專利名稱：以圓酵母菌株連續(xù)發(fā)酵提取生產(chǎn)赤蘚糖醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以圓酵母菌株連續(xù)發(fā)酵提取生產(chǎn)赤蘚糖醇的方法，具體涉及一株圓酵母(Torula.sp)B84512菌株,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著生活水平的提高，“三高”人群數(shù)量呈指數(shù)增長，現(xiàn)今低糖、低鹽、低熱量的食品成為了人們的首選。赤蘚糖醇由于其具有熱量低、口感佳、低吸濕性、對糖尿病人安全、對熱酸十分穩(wěn)定及不會引起腸胃不適等優(yōu)點，成為了 21世紀(jì)最受歡迎的功能性食品添加劑。赤蘚糖醇的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。化學(xué)合成法主要是用酸堿處理經(jīng)高碘酸氧化過的淀粉或纖維素，高溫高壓下加氫還原獲得，但產(chǎn)物中副產(chǎn)物較多，收率低，產(chǎn)物較難分離，難以實現(xiàn)工業(yè)化。而以小麥或玉米等淀粉質(zhì)原料，經(jīng)酶降解生成葡萄糖，由耐高滲酵母或其他菌株，在高濃度下發(fā)酵后濃縮結(jié)晶分離干燥而得。與化學(xué)合成法相比，該法生產(chǎn)過程溫和容易控制、環(huán)境污染少、產(chǎn)品安全，更具有生產(chǎn)優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種圓酵母(Torula.sp)B84512連續(xù)發(fā)酵提取赤蘚糖醇的方法，以提高赤蘚糖醇的發(fā)酵效率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率、簡化提取工藝。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，一種以圓酵母菌株連續(xù)發(fā)酵提取生產(chǎn)赤蘚糖醇的方法，步驟為:
Cl)細(xì)胞液體培養(yǎng)物的制備:挑取YPD固體培養(yǎng)基上的圓酵母(Torula.sp) B84512菌株一環(huán)，接種在裝有50mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在25_35°C下，置于搖床上以150-200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)30_48h至對數(shù)期，即制得圓酵母(Torula.sp)B84512菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物；
Yro固體培養(yǎng)基如下:酵母粉10 g/L;蛋白胨20 g/L;葡萄糖20 g/L ；pH 7.0，121°C高壓蒸汽滅菌20min ;固體YPD培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20 g/L瓊脂粉；
種子培養(yǎng)基:葡萄糖200 g/L，酵母粉10 g/L，尿素I g/L，CuSO4 5H20 0.01 g/L,MnSO4 H2O 0.01 g/L，PH自然，其余為純水，115°C高壓蒸汽滅菌15min ;
(2)準(zhǔn)備發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分按重量百分比計如下:葡萄糖20%-30%，酵母粉
0.5%-1%，CuSO4.5H20 0.0005%-0.001%, MnSO4 H2O 0.0005%_0.001%，其余為純水，pH 自然，110-120°C、0.1-0.2MPa 蒸汽滅菌 10_20min，待用；
(3)發(fā)酵裝置連接:補料瓶與5L發(fā)酵罐相連，5L發(fā)酵罐依次連接微濾膜、納濾膜，納濾膜與赤蘚糖醇儲罐連接；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)條件:將步驟(I)制備的圓酵母(Torula.sp)B84512菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以重量比，即細(xì)胞液體培養(yǎng)物的重量占發(fā)酵培養(yǎng)基4%-8%的接種量接種在裝有已滅菌的2-3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在溫度為28-30°C，轉(zhuǎn)速為300_600r/min，通氣量為
0.5-lvvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)60_84h ；當(dāng)5L發(fā)酵罐中赤蘚糖醇濃度達(dá)到60g/L時，通過微濾膜過濾發(fā)酵體系，濾液繼續(xù)經(jīng)納濾膜過濾，被微濾膜截留的大分子液體以0.5-lmL/min的流速回流至發(fā)酵體系再利用；通過納濾膜選擇性過濾后，即得到赤蘚糖醇的發(fā)酵液，儲存于赤蘚糖醇儲罐中，被納濾膜截留的液體以0.5-lmL/min的流速回流至發(fā)酵體系；同時以0.4-0.6mL/min的速度流加質(zhì)量濃度為15%-25%的葡萄糖，為發(fā)酵體系提供充足的底物，并維持發(fā)酵總體積不變，不斷發(fā)酵培養(yǎng)即可連續(xù)發(fā)酵提取得到赤蘚糖醇的發(fā)酵液。所述葡萄糖底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到45%以上，赤蘚糖醇的發(fā)酵液提取收率達(dá)到97%。所述微孔濾膜的過濾孔徑為0.1-1 μ m ;納孔濾膜的過濾孔徑為0.l_100nm。赤蘚糖醇含量測定:采用HPLC法檢測赤蘚糖醇。色譜柱為Sugar-D色譜柱；流動相為乙腈:水=75:25 ;流速為lml/min，檢測器為示差折光檢測器。赤蘚糖醇標(biāo)準(zhǔn)品來自于Sigma0生物材料樣品保藏:一株圓酵母(7brw7a.sp) B84512菌株，保藏編號為CGMCC7582，保藏日期為2013年5月12日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明具有如下優(yōu)點:本發(fā)明所述的以圓酵母(7biT/7a.5/7>B84512為出發(fā)菌株連續(xù)發(fā)酵提取產(chǎn)赤蘚糖醇的方法，延長了赤蘚糖醇的發(fā)酵周期，提高了底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品收率，簡化了提取工藝，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，該工藝可進(jìn)一步推廣至工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1本發(fā)明發(fā)酵系統(tǒng)連接示意圖。

附圖標(biāo)記說明:①補料瓶:內(nèi)裝20%葡萄糖溶液；(D 5L發(fā)酵罐；(D微濾膜:用于過濾酵母，使其回流至發(fā)酵罐；④納濾膜:用于選擇性過濾赤蘚糖醇；⑤赤蘚糖醇儲罐。箭頭為液體流向。
具體實施例方式實施例1圓酵母(Torula.sp) B84512的5L發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵體系制備赤蘚糖醇
1、培養(yǎng)基配方
(I)種子培養(yǎng)基:葡萄糖200 g/L，酵母粉10 g/L，尿素I g/L，CuS04 5H20 0.01 g/L，MnS04 H20 0.01 g/L，PH 自然，115°C高壓蒸汽滅菌 15min。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 300 g/L，酵母粉 10 g/L，尿素 I g/L，CuS04 5H20 0.01g/L, MnS04 H20 0.01 g/L，PH 自然，115°C高壓蒸汽滅菌 15min。2、培養(yǎng)方法
(I)種子培養(yǎng)方法
挑取YPD固體培養(yǎng)基上的圓酵母(Torula.sp)B84512菌株一環(huán)，接種在裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30°C下，置于搖床上以150-200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)30-48h至對數(shù)期，即制得圓酵母(Torula.sp) B84512菌株的種子液體培養(yǎng)物。(2) 5L發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵提取方法
將上述圓酵母(Torula.sp)B84512菌株的種子液體培養(yǎng)物以4-8% (v/v)的接種量接種在裝有已滅菌的3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在30°C條件下，轉(zhuǎn)速為300-600r/min，通氣量為lvvm, 50h后設(shè)定為0.5vvm,約70h后發(fā)酵液中赤蘚糖醇產(chǎn)量達(dá)到60g/L,葡萄糖濃度降至50g/L左右，此時開啟補料，以0.5 ml/min的速度補加20%的葡萄糖；同時開啟微濾、納濾裝置，以0.5mL/min的速度提純赤蘚糖醇母液。發(fā)酵至240h左右，菌株活性下降，赤蘚糖醇比合成速率下降至0.5g/L/h以下，停止發(fā)酵，取發(fā)酵液過濾除菌，經(jīng)納濾得到的濾過液與赤蘚糖醇母液混合。經(jīng)計算此發(fā)酵過程中消耗葡萄糖1920g，發(fā)酵底物轉(zhuǎn)化率達(dá)45%以上，取得赤蘚糖醇母液約7L，濃度為120g/L，總計840g，產(chǎn)品收率達(dá)97%。實施例2
一種以圓酵母菌株連續(xù)發(fā)酵提取生產(chǎn)赤蘚糖醇的方法，步驟為:
Cl)細(xì)胞液體培養(yǎng)物的制備:挑取YPD固體培養(yǎng)基上的圓酵母(Torula.sp) B84512菌株一環(huán)，接種在裝有50mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在35°C下，置于搖床上以200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)36h至對數(shù)期，即制得圓酵母(Torula.sp)B84512菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物；YH)固體培養(yǎng)基如下:酵母粉10 g/L;蛋白胨20 g/L;葡萄糖20 g/L ；pH 7.0，121°C高壓蒸汽滅菌20min ;固體YPD培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20 g/L瓊脂粉；
種子培養(yǎng)基:葡萄糖200 g/L，酵母粉10 g/L，尿素I g/L，CuSO4 5H20 0.01 g/L,MnSO4 H2O 0.01 g/L，PH自然，其余為純水，115°C高壓蒸汽滅菌15min ;
(2)準(zhǔn)備發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分按重量百分比計如下:葡萄糖30%，酵母粉1%，CuSO4.5H20 0.001%, MnSO4 H2O 0.001%，其余為純水，pH 自然，120°C、0.2MPa 蒸汽滅菌20min，待用；
(3)發(fā)酵裝置連接:如圖1所示，補料瓶I與5L發(fā)酵罐2相連，5L發(fā)酵罐2依次連接微濾膜3、納濾膜4，納濾膜4與赤蘚糖醇儲罐5連接；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)條件:將步驟I制備的圓酵母(Torula.sp)B84512菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以重量比，即細(xì)胞液體培養(yǎng)物的重量占發(fā)酵培養(yǎng)基8%的接種量接種在裝有已滅菌的2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐2中，在溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為300r/min，通氣量為Iwm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)60-84h ；
當(dāng)5L發(fā)酵罐2中赤蘚糖醇濃度達(dá)到60g/L時，通過微濾膜3過濾發(fā)酵體系，濾液繼續(xù)經(jīng)納濾膜4過濾，被微濾膜3截留的大分子液體以lmL/min的流速回流至發(fā)酵體系再利用；通過納濾膜4選擇性過濾后，即得到赤蘚糖醇的發(fā)酵液，儲存于赤蘚糖醇儲罐5中，被納濾膜4截留的液體以0.5mL/min的流速回流至發(fā)酵體系；同時以0.6mL/min的速度流加質(zhì)量濃度為15%的葡萄糖，為發(fā)酵體系提供充足的底物，并維持發(fā)酵總體積不變，不斷發(fā)酵培養(yǎng)即可連續(xù)發(fā)酵提取得到赤蘚糖醇的發(fā)酵液。所述葡萄糖底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到45%以上，赤蘚糖醇的發(fā)酵液提取收率達(dá)到97%。所述微孔濾膜的過濾孔徑為0.1-1 μ m ;納孔濾膜的過濾孔徑為0.l_100nm。實施例3
一種以圓酵母菌株連續(xù)發(fā)酵提取生產(chǎn)赤蘚糖醇的方法，步驟為:
Cl)細(xì)胞液體培養(yǎng)物的制備:挑取YPD固體培養(yǎng)基上的圓酵母(Torula.sp)B84512菌株一環(huán)，接種在裝有5 0mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30°C下，置于搖床上以180 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)42h至對數(shù)期，即制得圓酵母(Torula.sp)B84512菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物；YH)固體培養(yǎng)基如下:酵母粉10 g/L;蛋白胨20 g/L;葡萄糖20 g/L ；pH 7.0，121°C高壓蒸汽滅菌20min ;固體YPD培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20 g/L瓊脂粉；
種子培養(yǎng)基:葡萄糖200 g/L，酵母粉10 g/L，尿素I g/L，CuSO4 5H20 0.01 g/L,MnSO4 H2O 0.01 g/L，PH自然，其余為純水，115°C高壓蒸汽滅菌15min ;
(2)準(zhǔn)備發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分按重量百分比計如下:葡萄糖25%，酵母粉0.8%，CuSO4.5H20 0.0005%, MnSO4 H2O 0.001%，其余為純水，pH 自然，115°C、0.1-0.2MPa 蒸汽滅菌15min，待用；
(3)發(fā)酵裝置連接:如圖1所示，補料瓶I與5L發(fā)酵罐2相連，5L發(fā)酵罐2依次連接微濾膜3、納濾膜4，納濾膜4與赤蘚糖醇儲罐5連接；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)條件:將步驟(I)制備的圓酵母(Torula.sp)B84512菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以重量比，即細(xì)胞液體培養(yǎng)物的重量占發(fā)酵培養(yǎng)基6%的接種量接種在裝有已滅菌的2-3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐2中，在溫度為28-30°C，轉(zhuǎn)速為500r/min，通氣量為Ivvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)84h ；
當(dāng)5L發(fā)酵罐2中赤蘚糖醇濃度達(dá)到60g/L時，通過微濾膜3過濾發(fā)酵體系，濾液繼續(xù)經(jīng)納濾膜4過濾，被微濾膜3截留的大分子液體以0.5mL/min的流速回流至發(fā)酵體系再利用；通過納濾膜4選擇性過濾后，即得到赤蘚糖醇的發(fā)酵液，儲存于赤蘚糖醇儲罐5中，被納濾膜4截留的液體以0.8mL/min的流速回流至發(fā)酵體系；同時以0.5mL/min的速度流加質(zhì)量濃度為20%的葡萄糖，為發(fā)酵體系提供充足的底物，并維持發(fā)酵總體積不變，不斷發(fā)酵培養(yǎng)即可連續(xù)發(fā)酵提取得到赤蘚糖醇的發(fā)酵液。所述葡萄糖底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到45%以上，赤蘚糖醇的發(fā)酵液提取收率達(dá)到97%。所述微孔濾膜的過濾 孔徑為0.1-1 μ m ;納孔濾膜的過濾孔徑為0.l_100nm。
權(quán)利要求
1.一種以圓酵母菌株連續(xù)發(fā)酵提取生產(chǎn)赤蘚糖醇的方法，其特征是: (1)細(xì)胞液體培養(yǎng)物的制備:挑取YPD固體培養(yǎng)基上的圓酵母(Torula.sp)B84512菌株一環(huán)，接種在裝有50mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在25-35°C下，置于搖床上以150-200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)30_48h至對數(shù)期，即制得圓酵母(Torula.sp)B84512菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物； Yro固體培養(yǎng)基如下:酵母粉10 g/L;蛋白胨20 g/L;葡萄糖20 g/L ；pH 7.0，121°C高壓蒸汽滅菌20min ;固體YPD培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20 g/L瓊脂粉； 種子培養(yǎng)基:葡萄糖200 g/L，酵母粉10 g/L，尿素I g/L，CuSO4 5H20 0.01 g/L,MnSO4 H2O 0.01 g/L，PH自然，其余為純水，115°C高壓蒸汽滅菌15min ; (2)準(zhǔn)備發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分按重量百分比計如下:葡萄糖20%-30%，酵母粉0.5%-1%，CuSO4.5H20 0.0005%-0.001%, MnSO4 H2O 0.0005%_0.001%，其余為純水，pH 自然，110-120°C、0.1-0.2MPa 蒸汽滅菌 10_20min，待用； (3)發(fā)酵裝置連接:補料瓶(I)與5L發(fā)酵罐(2)相連，5L發(fā)酵罐(2)依次連接微濾膜(3)、納濾膜(4)，納濾膜(4)與赤蘚糖醇儲罐(5)連接； (4)發(fā)酵培養(yǎng)條件:將步驟(I)制備的圓酵母(Torula.sp)B84512菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以重量比，即細(xì)胞液體培養(yǎng)物的重量占發(fā)酵培養(yǎng)基4%-8%的接種量接種在裝有已滅菌的2-3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐(2)中，在溫度為28-30°C，轉(zhuǎn)速為300_600r/min，通氣量為0.5-lvvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)60-84h ； 當(dāng)5L發(fā)酵罐(2)中赤蘚糖醇濃度 達(dá)到60g/L時，通過微濾膜(3)過濾發(fā)酵體系，濾液繼續(xù)經(jīng)納濾膜(4)過濾，被微濾膜(3)截留的大分子液體以0.5-lmL/min的流速回流至發(fā)酵體系再利用；通過納濾膜(4)選擇性過濾后，即得到赤蘚糖醇的發(fā)酵液，儲存于赤蘚糖醇儲罐(5)中，被納濾膜(4)截留的液體以0.5-lmL/min的流速回流至發(fā)酵體系；同時以0.4-0.6mL/min的速度流加質(zhì)量濃度為15%_25%的葡萄糖，為發(fā)酵體系提供充足的底物，并維持發(fā)酵總體積不變，不斷發(fā)酵培養(yǎng)即可連續(xù)發(fā)酵提取得到赤蘚糖醇的發(fā)酵液。
2.如權(quán)利要求1所述以圓酵母菌株連續(xù)發(fā)酵提取生產(chǎn)赤蘚糖醇的方法，其特征是:所述葡萄糖底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到45%以上，赤蘚糖醇的發(fā)酵液提取收率達(dá)到97%。
3.如權(quán)利要求1所述以圓酵母菌株連續(xù)發(fā)酵提取生產(chǎn)赤蘚糖醇的方法，其特征是:所述微孔濾膜的過濾孔徑為0.1-1 μ m ;納孔濾膜的過濾孔徑為0.l-100nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以圓酵母菌株連續(xù)發(fā)酵提取生產(chǎn)赤蘚糖醇的方法，具體涉及一株圓酵母(Torula.sp)B84512菌株，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述的以圓酵母(Torula.sp)B84512為出發(fā)菌株連續(xù)發(fā)酵提取產(chǎn)赤蘚糖醇的方法，通過濾膜過濾回收濾液和添加葡萄糖延長了赤蘚糖醇的發(fā)酵周期，提高了底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品收率，簡化了提取工藝，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，該工藝可進(jìn)一步推廣至工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12P7/18GK103224960SQ201310191160
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月21日
發(fā)明者陸茂林, 吳燕, 張六六, 唐寶英, 劉佳 申請人:江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司