專利名稱：Line-1基因甲基化定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Line-1基因甲基化定量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
在腫瘤細(xì)胞增殖與分化中，基因突變、DNA甲基化紊亂表達(dá)、LOH缺失等是導(dǎo)致癌基因和抑癌基因調(diào)控紊亂的主要原因，而DNA甲基化作為非常重要的表觀遺傳機(jī)制，均參與上述調(diào)控過(guò)程，在腫瘤的形成中發(fā)揮潛在作用?；虍惓NA甲基化的檢測(cè)方法主要有甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶法、重亞硫酸鹽測(cè)序法(BSP)以及甲基化特異性PCR法(MSP)三種。其中甲基化特異性PCR法是目前研究基因甲基化最為廣泛的、首選的方法。但是該方法仍然存在下列缺點(diǎn):(1)這種方法只能作定性研究，即只能明確是否存在甲基化；若要求定量.則需用其他的方法進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)；(2)若要區(qū)分甲基化引物與非甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物量的不同，需要嚴(yán)格控制PCR反應(yīng)的條件及循環(huán)數(shù)。而甲基化特異性PCR法最為關(guān)鍵的一點(diǎn)在于引物的設(shè)計(jì)。Line-1基因是一種分布在人類基因組內(nèi)的內(nèi)源性的易變基因序列。研究表明，大約有4 X IO5的Line-1基因重復(fù)拷貝存在于人類基因組，它們占據(jù)整個(gè)人類基因組的5%。在哺乳動(dòng)物的基因組中，Line-1的反轉(zhuǎn)錄活性具有潛在的危險(xiǎn)性，而Line-1基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島DNA甲基化可導(dǎo)致其沉默，是一種重要的保護(hù)機(jī)制。DNA重復(fù)序列Line-1的甲基化有利于整個(gè)基因組的穩(wěn)定性和完整性，而Line-1的低甲基化(去甲基化)卻增加了基因組的不穩(wěn)定性和有絲分裂重組的機(jī)會(huì)。Line-1序列啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化可導(dǎo)致整個(gè)基因組的不穩(wěn)定。低甲基化導(dǎo)致的Line-1反轉(zhuǎn)錄活性激活能夠使腫瘤抑制基因失活(例如結(jié)腸癌中的APC)，插入癌基因 上游的Line-1啟動(dòng)子序列可以導(dǎo)致這些腫瘤基因的失活(例如乳腺癌中的c-myc基因)。Line-1序列的低甲基化現(xiàn)象出現(xiàn)在多種腫瘤中，包括結(jié)腸癌、膀胱上皮癌、惡性生殖細(xì)胞瘤、卵巢癌、宮頸癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、前列腺癌、慢性髓樣白血病等等。在一項(xiàng)研究中，作者用焦磷酸測(cè)序的方法檢測(cè)了 48例非細(xì)胞肺癌中Line-1序列的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Line-1的低甲基化水平與基因組的不穩(wěn)定性相關(guān)。而在前列腺癌中，Line-1的低甲基化與腫瘤的惡性程度相關(guān)。因此，DNA重復(fù)序列的Line-1甲基化檢測(cè)可作為腫瘤基因組整體低甲基化的標(biāo)記物，研究Line-1序列的甲基化有助于我們對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)理的分子研究。目前尚未發(fā)現(xiàn)檢測(cè)Line-1基因甲基化的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種Line-1基因甲基化定量檢測(cè)方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是:一種Line-1基因甲基化定量檢測(cè)方法，具有如下步驟:①對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行處理，得到樣本模板；②設(shè)計(jì)并合成Line-1基因甲基化引物和Line-1基因未甲基化引物；③分別用步驟②的甲基化引物和未甲基化引物對(duì)步驟①的樣本模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并分別得到相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；④對(duì)分別對(duì)步驟③得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理，并分別得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品模板分別對(duì)步驟①的樣本模板以及步驟
④的標(biāo)準(zhǔn)品模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，并計(jì)算出甲基化程度。其中步驟②中所述的Line-1基因甲基化引物如下:Line_l基因甲基化正向引物:CGCGAGTCGAAGTAGGGC ;Line_l 基因甲基化反向引物:ACCCGAITTTCCAAATACGACCG ；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為llObp。步驟②中所述的Line-1基因未甲基化引物如下:Line_l基因未甲基化正向引物:TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT ;Line_l基因未甲基化反向引物:ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA ;擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 I IObp。上述步驟①中所述的對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行處理包括:A、從待測(cè)樣本中提取DNA ;B、對(duì)提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾；C、對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行純化，得到樣本模板。所述的待測(cè)樣本包括組織、血液、體液、分泌物或者穿刺物。上述步驟③中所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s, 58°C退火 40s, 72°C延伸 45s, 35 個(gè)循環(huán)。上述步驟③中所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為:2.5 μ L 不含 MgCl2 的 IOxPCR buffer ；2.0 μ L 濃度為 25mM 的 MgCl2 ；2.0μ L 濃度為 2.5mM 的 dNTP ；0.5μ L濃度 為 5 υ/μ L 的 Taq 酶；0.5μ L濃度為20μΜ的正向引物；0.5μ L濃度為20μΜ的反向引物；1.0yL的樣本模板；16μΙ^3Η20。上述步驟④中所述的對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理具體過(guò)程如下:先將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并連接入PMD18-T Vector ;然后電擊法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌的DH5 α工程菌；接著挑選出重組克隆菌進(jìn)行菌液DNA測(cè)序；最后對(duì)測(cè)序正確的重組克隆菌進(jìn)行擴(kuò)增、抽提，得到標(biāo)準(zhǔn)品模板。上述步驟⑤中所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，58°C退火40s，72°C延伸45s，40個(gè)循環(huán)。上述步驟⑤中所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為:10 μ L 的 SYBR-PCR 反應(yīng)液；0.5μ L的正向引物;0.5μ L的反向引物;1.0yL 的模板；8μΙ^3Η20。上述步驟⑤中所述的甲基化程度的計(jì)算方法為:以標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，檢測(cè)得到的標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)，分別制作Line-1基因甲基化標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線和Line-1基因未甲基化標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線；由制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距以及檢測(cè)得到的待測(cè)樣本的循環(huán)數(shù)計(jì)算出待測(cè)樣本的Line-1基因甲基化的拷貝數(shù)M和Line-1基因甲基化的拷貝數(shù)U ;M/ (M+U)即為L(zhǎng)ine-1基因甲基化程度的定量值。
本發(fā)明具有的積極效果:本發(fā)明針對(duì)Line-1基因設(shè)計(jì)出了 Line-1基因甲基化引物和Line-1基因未甲基化引物，這樣可以利用甲基化特異性PCR法對(duì)Line-1基因甲基化進(jìn)行定性檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)Line-1基因甲基化進(jìn)行定量檢測(cè)，具有特異性好、靈敏度高、定量精確、快速簡(jiǎn)便、可重復(fù)性高等特點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明的Line-1基因甲基化標(biāo)準(zhǔn)品定量PCR檢測(cè)曲線；其中A為標(biāo)準(zhǔn)曲線，B為融解曲線，C為擴(kuò)增曲線。圖2為本發(fā)明的Line-1基因未甲基化標(biāo)準(zhǔn)品定量PCR檢測(cè)曲線；其中A為標(biāo)準(zhǔn)曲線，B為融解曲線，C為擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式(實(shí)施例1)本實(shí)施例以肝癌患者臨床組織為待測(cè)樣本，定量檢測(cè)Line-1基因的甲基化程度。本實(shí)施例的定量檢測(cè)方法具有以下步驟:①對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行處理，得到樣本模板。A、從待測(cè)樣本中提取DNA。取新鮮肝癌切除組織50mg，用基因組DNA抽提試劑盒提取DNA (按說(shuō)明書(shū)操作)，得到待測(cè)樣本的DNA。B、對(duì)提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，具體過(guò)程如下:
I)、取I μ g的DNA溶于20 μ L的水中，95°C水浴IOmin ;立即放入冰??；加入2 μ L濃度為IOM的氫氧化鈉，使DNA變性，成為單鏈DNA。2)、加入230 μ L的亞硫酸氫鈉修飾液(含有5Μ的亞硫酸氫鈉、IOmM的氫醌、ImM的TAC以及0.3Μ的鹽酸胍，pH為5.0),混勻后分裝到三個(gè)PCR管中，每管約80 μ L 90 μ L。3)、將三個(gè)PCR管放入PCR儀，運(yùn)行下列程序進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾反應(yīng):95°C預(yù)變性20s ;95°C變性10s，58°C退火20min，7個(gè)循環(huán)。保存于4°C。C、對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行純化，得到PCR擴(kuò)增用模板，具體過(guò)程如下:I)、純化:合并上述三個(gè)PCR管中的修飾后的DNA溶液，加入ImL作為結(jié)合劑的鹽酸胍溶液(6M，pH為5.0)以利于吸附，混勻后將溶液移至套放在2mL收集管內(nèi)的MNIQ-10柱中，室溫(15°C 25°C,下同)放置2min,8000rpm室溫離心30s,棄收集管中的廢液。2)、洗滌:加入500 μ L的洗滌緩沖液(含有IOmM的Tris和80wt%乙醇，pH為6.8)，8000rpm室溫離心30s，棄洗滌液，再加入500 μ L的上述洗滌緩沖液清洗一次。3)、脫磺化:在上述麗IQ-10柱中加入250 μ L的脫磺化液(含有30wt%乙醇、5wt%甘油、200mM氫氧化鈉以及IOOmM氯化鈉)，室溫放置lOmin，8000rpm室溫離心30s，棄收集管中的廢液。4)、洗滌:加入500 μ L的洗滌緩沖液(含有IOmM的Tris和80wt%乙醇，pH為6.8)，8000rpm室溫離心30s，棄洗滌液，再加入500 μ L的上述洗滌緩沖液清洗一次。5)、洗脫:將上述MNIQ-1O柱放入一個(gè)新的1.5mL的EP管中，加入35 μ L的70V預(yù)熱的TE洗脫液(含有IOmM的Tris和ImM的EDTA，pH為8.0), 12000rpm室溫離心2min，收集洗脫液。該洗脫液即為樣本模板。②設(shè)計(jì)并合成Line-1基因甲基化引物和Line-Ι基因未甲基化引物，包括正向引物和反向引物。Line-1基因甲基化引物如下:Line-1 基因甲基化正向引物:CGCGAGTCGAAGTAGGGC ；Line-1 基因甲基化反向引物:ACCCGATTTTCCAAATACGACCG ；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為I IObp。Line-1基因未甲基化引物如下:Line-1 基因未甲基化正向引物:TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT ；Line-1 基因未甲基化反向引物:ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA ；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為I IObp。③在兩個(gè)PCR管中，分別用步驟②的甲基化引物和未甲基化引物對(duì)步驟①的樣本模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(包括Line-1基因甲基化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和Line-1基因未甲基化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)。
·
PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件如下:95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，58°C退火40s，72°C延伸45s，35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系見(jiàn)表I。表I
IOxPCR buffer (不含 MgCl2) |2.5μ L~
MgCl2 (25mM)2.0μ L~
dNTP (2.5mM)2.0μ L~
Taq 酶(5ΙΙΙ/μ L)0.5μ L~
正向引物(20μΜ)0.5μ L~
反向引物(20μΜ)0.5μ L~
樣本模板1.0μ L~
ζθ16 μ L
總體積25 μ L。其中Taq酶來(lái)源于寶生物工程(大連)有限公司。④分別對(duì)步驟③得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理，并分別得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品模板。具體過(guò)程如下:
先將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(包括Line-1基因甲基化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和Line-1基因未甲基化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)進(jìn)行純化并連接入pMD18-T Vector (按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)。然后電擊法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌的DH5ci工程菌。接著用T載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒挑選出重組克隆菌進(jìn)行菌液DNA測(cè)序。最后對(duì)測(cè)序正確的重組克隆菌進(jìn)行擴(kuò)增，并用細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染質(zhì)粒抽提，得到標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒(包括Line-1基因甲基化標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和Line-1基因未甲基化標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒)。其中pMD18-T Vector來(lái)源于寶生物工程(大連)有限公司，T載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒來(lái)源于生工生物工程(上海)股份有限公司，細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒抽提試劑盒來(lái)源于生工生物工程(上海)股份有限公司。經(jīng)DNA濃度檢測(cè)，Line-1基因甲基化標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度為152.1ng/ μ L，Line-1基因未甲基化標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度為126.4ng/l.! L。質(zhì)粒的拷貝數(shù)(copies/μ L)的計(jì)算公式如下:6.02Χ IO23X質(zhì)粒濃度X 10_3 X 10_6/[(質(zhì)粒長(zhǎng)度+插入片段長(zhǎng)度)X每對(duì)堿基平均分子量]。經(jīng)計(jì)算Line-1基因甲基化標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝數(shù)為4.48 X 101° (copies/ μ L)，Line-1基因未甲基化標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝數(shù)為3.49 X 101° (copies/μ L)。

分別以Line-1基因甲基化質(zhì)粒的拷貝數(shù)為4.48Χ 104、4.48Χ 105、4.48 X IO6以及
4.48X IO7以及Line-1基因未甲基化質(zhì)粒的拷貝數(shù)為3.49Χ104、3.49Χ105、3.49X IO6以及3.49 X IO7作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)品模板。⑤分別對(duì)步驟①的樣本模板以及步驟④的標(biāo)準(zhǔn)品模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，并計(jì)算出甲基化程度。其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)條件如下:95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，58°C退火40s，72°C延伸45s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系見(jiàn)表2。表 權(quán)利要求
1.一種Line-1基因甲基化定量檢測(cè)方法，具有如下步驟: ①對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行處理，得到樣本模板； ②設(shè)計(jì)并合成Line-1基因甲基化引物和Line-1基因未甲基化引物； ③分別用步驟②的甲基化引物和未甲基化引物對(duì)步驟①的樣本模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并分別得到相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； ④分別對(duì)步驟③得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理，并分別得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品模板； ⑤分別對(duì)步驟①的樣本模板以及步驟④的標(biāo)準(zhǔn)品模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，并計(jì)算出甲基化程度； 其特征在于: 步驟②中所述的Line-1基因甲基化引物如下: Line-1基因甲基化正向引物:CGCGAGTCGAAGTAGGGC ； Line-1 基因甲基化反向引物:ACCCGATTTTCCAAATACGACCG ； 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為IlObp ; 步驟②中所述的Line-1基因未甲基化引物如下: Line-1基因未甲基化正向引物:TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT ； Line-1 基因未甲基化反向引物:ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA ； 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為I IObp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Line-1基因甲基化定量檢測(cè)方法，其特征在于:步驟①中所述的對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行處理包括: A、從待測(cè)樣本中提取DNA； B、對(duì)提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾； C、對(duì)修飾后的DNA進(jìn)行純化，得到樣本模板。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Line-1基因甲基化定量檢測(cè)方法，其特征在于:所述的待測(cè)樣本包括組織、血液、體液、分泌物或者穿刺物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Line-1基因甲基化定量檢測(cè)方法，其特征在于:步驟③中所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，58°C退火40s，72°C延伸45s, 35個(gè)循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的Line-1基因甲基化定量檢測(cè)方法，其特征在于:步驟③中所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為:2.5 μ L 不含 MgCl2 的 IOxPCR buffer ；2.0 μ L 濃度為 25mM 的 MgCl2 ；2.0 μ L 濃度為 1.5mM 的 dNTP ； 0.5 μ L濃度為5IU/ μ L的Taq酶； 0.5 μ L濃度為20 μ M的正向引物； 0.5 μ L濃度為20 μ M的反向引物； 1.0 μ L的樣本模板；16yL 的!120。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Line-1基因甲基化定量檢測(cè)方法，其特征在于:步驟④中所述的對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理具體過(guò)程如下:先將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并連接入pMD18-TVector ;然后電擊法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌的DH5 α工程菌；接著挑選出重組克隆菌進(jìn)行菌液DNA測(cè)序；最后對(duì)測(cè)序正確的重組克隆菌進(jìn)行擴(kuò)增、抽提，得到標(biāo)準(zhǔn)品模板。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的Line-I基因甲基化定量檢測(cè)方法，其特征在于步驟⑤中所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，58°C退火40s，72°C延伸45s，40個(gè)循環(huán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或7所述的Line-I基因甲基化定量檢測(cè)方法，其特征在于步驟⑤中所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為 10 μ L 的 SYBR-PCR 反應(yīng)液； O. 5μ L的正向引物； 0.5μ L的反向引物； 1.O μ L的模板；8μ L 的 Η20。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或7所述的Line-I基因甲基化定量檢測(cè)方法，其特征在于步驟⑤中所述的甲基化程度的計(jì)算方法為以標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，檢測(cè)得到的標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)，分別制作Line-I基因甲基化標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線和Line-I基因未甲基化標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線；由制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距以及檢測(cè)得到的待測(cè)樣本的循環(huán)數(shù)計(jì)算出待測(cè)樣本的Line-I基因甲基化的拷貝數(shù)M和Line-I基因甲基化的拷貝數(shù)U ;M/(M+U)即為L(zhǎng)ine-I基因甲基化程度的定量值。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的Line-I基因甲基化定量檢測(cè)方法，其特征在于步驟⑤中所述的甲基化程度的計(jì)算方法為以標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，檢測(cè)得到的標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)，分別制作Line-I基因甲基化標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線和Line-I基因未甲基化標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線；由制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距以及檢測(cè)得到的待測(cè)樣本的循環(huán)數(shù)計(jì)算出待測(cè)樣本的Line-I基因甲基化的拷貝數(shù)M和Line-I基因甲基化的拷貝數(shù)U ;M/ (M+U)即為L(zhǎng)ine-I基因甲基化程度的定量值。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種Line-1基因甲基化定量檢測(cè)方法，具有如下步驟①對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行處理，得到樣本模板；②設(shè)計(jì)并合成Line-1基因甲基化引物和Line-1基因未甲基化引物；③分別用步驟②的甲基化引物和未甲基化引物對(duì)步驟①的樣本模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并分別得到相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；④對(duì)分別對(duì)步驟③得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理，并分別得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品模板；⑤分別對(duì)步驟①的樣本模板以及步驟④的標(biāo)準(zhǔn)品模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，并計(jì)算出甲基化程度。本發(fā)明針對(duì)Line-1基因設(shè)計(jì)出了甲基化引物和未甲基化引物，這樣可以利用MSP法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)Line-1基因甲基化進(jìn)行定性定量檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103255210SQ20131010666
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月28日
發(fā)明者張長(zhǎng)松, 凌揚(yáng), 朱長(zhǎng)太, 朱靜, 劉永萍, 孔穎澤 申請(qǐng)人:常州市腫瘤醫(yī)院