專利名稱：二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物及其制備和應用方法
技術領域：
本發(fā)明公開了一種二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物及其制備和應用方法，尤其是在制備基于多肽自組裝納米線作為電子媒介體的葡萄糖電化學生物傳感器上的應用方法。
背景技術：
自克拉克和里昂開發(fā)出將酶固定于電極表面的檢測方法以來(Annals of the NewYork Academy of Sciences, 1962, 102，29-45),酶傳感器得到了迅速發(fā)展。近十年來,雖然不同種類的生物傳感器和檢測器件相繼被開發(fā)出來，但葡萄糖生物傳感器的進一步完善和商業(yè)化依然是國際上生物傳感器研究領域的熱門。血糖的實時監(jiān)控對于糖尿病患者病情控制意義重大，現(xiàn)今血糖測試儀已使糖尿病患者可在家中自行測定血糖值。將葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,簡稱GOx)和電子媒介體二茂鐵(ferrocene,簡稱Fe)固定于工作電極上，當在檢測體系中加入血樣后，血液中的葡萄糖被GOx氧化。Fe具有優(yōu)良的電化學活性， 可起到增強電子傳遞、放大信號作用。通常分步將GOx和Fe固定到電極上，步驟較繁瑣且影響傳感器的重現(xiàn)性。因此，我們考慮制備一種納米復合材料同時包含F(xiàn)e和G0x，這樣只需一步，將此納米材料固定在電極上即可完成葡萄糖傳感器的制備。近年來，自組裝多肽納米材料因其良好的生物相容性、簡單的自組裝過程以及易于功能化等特點而備受關注(Journal of the American ChemicalSociety, 2010, 132，15632-15636)。在已報道的多種多肽分子中，二苯丙氨酸(diphenylalanine, Phe-Phe,簡稱FF)及其衍生物因其分子結構簡單而得到研究工作者青睞。在不同條件下，F(xiàn)F可自組裝形成納米管、納米線,納米顆粒等。這類納米材料表面的氨基或羧基使其可進行多樣的化學修飾，從而應用于構造復雜納米器件、作為藥物載體以及制備生物傳感器。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物及其制備和應用方法。本發(fā)明首次基于二茂鐵-二苯丙氨酸(Fc-Phe-Phe-OH)通過共價鍵、氫鍵等作用自組裝形成的二茂鐵多肽納米線(Fc-Nano Peptide Wires,簡稱Fc-PNWs),并結合葡萄糖氧化酶，得到Fc-Nano Peptide Wires-GOx,簡稱Fc-PNWs_G0x,再由此制備了測定血糖的電化學生物傳感器。該傳感器靈敏度高，檢測限低且制備方法簡單。二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物的制備方法，包括以下任一方式所述的步驟:稱取二茂鐵-二苯丙氨酸溶于乙醇，待溶劑揮發(fā)后，二茂鐵-二苯丙氨酸逐漸析出并且自組裝形成線型納米材料A ;將A加入蒸餾水中，在超聲儀中超聲震蕩，使A由團聚狀態(tài)分散開來得到B ;取殼聚糖溶液與B混合，震蕩超聲后放置，使殼聚糖分子充分修飾到納米線表面得到C ;將C離心，移除上層溶液，然后至少重復進行兩次加pH=7.4的磷酸緩沖溶液、離心和移除上層溶液的過程后滴入戊二醛的水溶液，形成混合物后震蕩，然后離心得到D ;向D中加入葡萄糖氧化酶水溶液，震蕩，放置，即制成二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物；或者稱取二茂鐵-二苯丙氨酸溶于乙醇；待溶劑揮發(fā)后，二茂鐵-二苯丙氨酸逐漸析出并且自組裝形成線型納米材料A ;將A加入磷酸緩沖溶液，在超聲儀中超聲震蕩，使A由團聚狀態(tài)分散成單條納米線狀態(tài)，然后離心，再次加入磷酸緩沖溶液，離心，移除上層溶液，得到E，分別取殼聚糖溶液，戊二醛水溶液和葡萄糖氧化酶水溶液，加入E中配成二茂鐵-二苯丙氨酸溶液，震蕩超聲，放置，即制成二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物。上述方法具體如下:
稱取二茂鐵-二苯丙氨酸溶于乙醇，配成2 5mg/mL的溶液；待溶劑揮發(fā)后，二茂鐵-二苯丙氨酸逐漸析出并且自組裝形成線型納米材料A ;稱取A2mg加入ImL蒸餾水，在超聲儀中超聲震蕩3 5分鐘，使A由團聚狀態(tài)分散開來得到B ;取ImL質量分數(shù)1%的殼聚糖溶液與B混合，震蕩超聲2分鐘后放置3小時，使殼聚糖分子充分修飾到納米線表面得到C ;將C離心，離心轉數(shù)為5000轉/分鐘，離心5分鐘，移除上層溶液，然后重復進行兩次加pH=7.4的磷酸緩沖溶液、離心和移除上層溶液的過程后滴入500 μ L0.25%的戊二醛的水溶液，形成混合物后震蕩半小時，然后離心得到D ;按照二茂鐵-二苯丙氨酸2mg/mL的配比，向D中加入10 15mg/mL的葡萄糖氧化酶水溶液，震蕩2_5分鐘，放置24h，即制成二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物；或者稱取2 5mg 二茂鐵-二苯丙氨酸溶于ImL乙醇；將溶液烘干待二茂鐵_ 二苯丙氨酸析出及自組裝形成線型納米材料A ;稱取A2mg加入ImL磷酸緩沖溶液，在超聲儀中超聲3 5分鐘，使A由團聚狀態(tài)分散成單條納米線狀態(tài)，然后5000轉/分鐘，離心5分鐘，再次加入ImL磷酸緩沖溶液，離心，移除上層溶液，得到E，分別取100 μ L0.5%質量分數(shù)的殼聚糖溶液，450 μ L0.25%戊二醛水溶液和450 μ L10_15mg/mL的葡萄糖氧化酶水溶液，加入E中配成2mg/mL的二茂鐵-二苯丙氨酸溶液，震蕩超聲2 5分鐘，放置24小時，即制成二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物。所述的二茂鐵-二苯丙氨酸的制備方法如下:I)將摩爾比1:1.2:1.2的單羧基二茂鐵、1-羥基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽溶在無水二氯甲烷中，體系置于冰浴中逐滴加入三乙胺至體系環(huán)境PH達到8.0 9.0范圍間；攪拌I小時；薄層層析點板跟蹤反應；待反應完畢，依次用飽和NaC03、5%HCl和蒸餾水各萃取一次；萃取液濃縮，柱層析純化，真空干燥；得暗紅色化合物Fc-OBt ；2)將N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸、苯并三氮唑-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽和1-羥基苯并三唑溶解于無水二氯甲烷，三者的濃度均為4.4禮，冰浴條件下逐滴加入三乙胺直至體系環(huán)境達到PH8-9范圍間，反應I小時，再加入L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽，使之濃度達到4.4mM，室溫攪拌18小時，薄層色譜點板監(jiān)測反應基本完全；依次用飽和NaHCO3, 10%HC1和蒸餾水洗滌，并用Na2SO4干燥；減壓蒸干，柱層析純化，在旋轉蒸發(fā)儀上旋轉蒸干至油狀液體，移入冷凍干燥機內低溫干燥，得Boc-Phe-Phe-OMe粉末；3)將Boc-Phe-Phe-OMe溶于無水二氯甲烷20mL，濃度為2mM，再和IOmL三氟乙酸混合，常溫攪拌反應30min，減壓蒸干，所得中間產物H-Phe-Phe-OMe溶解在2mL無水二氯甲烷中，用三乙胺調至pH=8 ;繼續(xù)加入20mL無水二氯甲烷稀釋溶液，并加入步驟I)得到的Fc-OBt,使Fc-OBt濃度為2.2mM,常溫攪拌I小時，薄層層析點板跟蹤反應；待反應完畢，依次用飽和NaC03、5%HCl和蒸餾水萃取一次；萃取液濃縮，柱層析純化，真空干燥；得橙黃色化合物 Fc-Phe-Phe-OMe ；4)將Fc-Phe-Phe-OMe溶解在12mL的四氫呋喃，濃度為ImM，再緩慢滴加2.5mM的氫氧化鋰6mL，室溫下攪拌2小時；薄層層析點板跟蹤反應；待反應完畢，減壓蒸餾將其中的四氫呋喃抽凈，然后向此懸濁液里加入二氯甲烷30mL，依次用5%HC1和蒸餾水萃取，減壓旋轉蒸干；柱層析純化，真空干燥，得到化合物Fc-Phe-Phe-OH。上述的二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物的應用方法，用于制備檢測血糖的生物傳感器或者試紙。在制備檢測血糖的生物傳感器時將制備得到的二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物滴加于電極上， 干燥后即可。優(yōu)選取IOyL 二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物滴加于電極上。本發(fā)明使用的多肽為二茂鐵-二苯丙氨酸。其結構如下:
λ)
o有益效果:(I)本發(fā)明利用二茂鐵多肽納米線的高比表面積來提高葡萄糖氧化酶的負載量，同時5納米長的納米線上包含約8X IO5個二茂鐵分子是一種性能優(yōu)越的電子媒介體。與分步固定GOx和Fe的方法相比較,將其用于傳感器制備步驟簡單，F(xiàn)c-PNWs結合GOx形成Fc-PNWs-GOx后，只需一步即可固定到電極表面，干燥后即可進行檢測。(2)本發(fā)明首次將葡萄糖氧化酶與含大量二茂鐵分子的多肽納米線結合制成葡萄糖電化學傳感器，與同類型傳感器相比，制備過程簡單，靈敏度高，檢測限低。該傳感器在37°C，pH7.4生理條件下具有良好的檢測性能。在此條件下，對醫(yī)院提供的血樣的血糖值進行了檢測，所得到的結果與醫(yī)院提供的數(shù)據(jù)吻合。(3)本發(fā)明制備的二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物具有優(yōu)良的生物相容性和專一性，有望用于血糖試紙的開發(fā)。(4)本發(fā)明制備的二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物，其制備方法可推廣到其他類型的酶與二茂鐵多肽納米線復合物的構建，從而有望開發(fā)出檢測多種物質的酶生物傳感器。(5)本發(fā)明中的電化學生物傳感器制備簡單，自組裝納米線廉價且易合成，在生物傳感方面具有廣泛的應用前景。


圖1為將葡萄糖氧化酶修飾到二茂鐵多肽納米線上的示意圖；圖2為二茂鐵多肽納米線的原子力顯微鏡圖；圖3為二茂鐵多肽納米線的掃描電子顯微鏡圖；圖4(A)為二茂鐵多肽納米線修飾電極10圈掃描的循環(huán)伏安圖；(B)為葡萄糖傳感器對葡萄糖的循環(huán)伏安響應圖，I號曲線為體系含有20mmol/L葡萄糖的循環(huán)伏安響應圖，2號曲線為10mmol/L，3號為O ; (C)為葡萄糖傳感器對連續(xù)加入葡萄糖的電流-時間響應圖；(D)為葡萄糖傳感器的校準曲線。
具體實施例方式下面列舉實施方式對本發(fā)明進行具體描述，但不限于以下實例。實施例1稱取2 5mg 二茂鐵-二苯丙氨酸溶于ImL乙醇。將溶液烘干，二茂鐵-二苯丙氨酸自組裝形成線型納米材料A。稱取A2mg加入ImL蒸懼水,在超聲儀中超聲3 5分鐘，使A由團聚狀態(tài)分散開來得到B。取lmLl% (質量分數(shù))殼聚糖溶液與B混合，震蕩超聲2分鐘后放置3小時，形成C。將C在5000轉/分鐘條件下離心5分鐘，移除上層溶液，離心后加適量磷酸緩沖溶液(pH=7.4)，重復加磷酸緩沖溶液離心步驟2次，最后滴入500 μ L戊二醛(0.25%)水溶液形成混合物后震蕩半小時，然后離心得到D。按照二茂鐵-二苯丙氨酸2mg/mL的配比，向D中加入10mg/mL的葡萄糖氧化酶水溶液，震蕩2 5分鐘，放置24h，即制成Fc-PNWs-GOx。取10 μ LFc-PNWs-GOx滴加于電極上，干燥后即可進行電化學測試。實施例2稱取5mg 二茂鐵-二苯丙氨酸溶于ImL乙醇。將溶液烘干待二茂鐵_ 二苯丙氨酸析出及自組裝形成線型納米材料A。稱取A2mg加入lmLPBS，在超聲儀中超聲5分鐘，使A由團聚狀態(tài)分散成單條納米線狀態(tài)，然后5000轉/分鐘，離心5分鐘，再次加入ImL磷酸緩沖溶液，離心，移除上層溶液，得到E ；分別取100 μ L0.5%質量分數(shù)的殼聚糖溶液，450 μ L0.25%戊二醛水溶液和450 μ L10mg/mL的葡萄糖氧化酶水溶液，加入E中配成2mg/mL的Fc-PNWs溶液，震蕩超聲5分鐘，放置24小時，形成附著于納米線表面的殼聚糖與葡萄糖氧化酶的復合物，F(xiàn)c-PNWs-GOx即制成。取10 μ LFc-PNWs-GOx滴加于電極上，干燥，用二次水沖洗電極以除去未附著在納米線上的葡萄糖氧化酶，隨后進行檢測。實施例3一，將摩爾比1:1.2:1.2的單羧基二茂鐵(Fc-COOH)U-羥基苯并三唑(HOBt)和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)溶在無水二氯甲烷(DCM)中，體系置于冰浴中逐滴加入三乙胺(Et3N)至體系環(huán)境pH達到8.0 9.0范圍間；攪拌I小時；薄層層析點板跟蹤反應；待反應完畢，依次用飽和NaC03、5%HCl和蒸懼水各萃取一次；萃取液濃縮，柱層析純化，真空干燥；得暗紅色化合物Fc-OBt ；二，將 N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸(Boc-Phe-COOH，4mM)，HBTU、H0Bt (均為 4.4mM)溶解于DCM，冰浴條件下逐滴加入2mL Et3N至pH至8_9，反應I小時，再加入L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽(H-Phe-OMe *HC1,4.4mM)，室溫攪拌18小時，薄層色譜點板監(jiān)測反應基本完全。分別用飽和NaHCO3, 10%HC1和蒸餾水洗滌并用Na2SO4干燥。減壓蒸干，柱層析純化，在旋轉蒸發(fā)儀上旋轉蒸干至油狀液體，移入冷凍干燥機內低溫干燥，得Boc-Phe-Phe-OMe粉末。
三，將 Boc-Phe-Phe-OMe (2mM)溶于 DCM(20mL)和 TFA (IOmL)混合溶液中，常溫攪拌反應30min，減壓蒸干，所得中間產物H-Phe-Phe-OMe溶解在2mL DCM中，用Et3N調至pH=8。繼續(xù)加入DCM(20mL)稀釋溶液，并加入Fc-OBt (2.2mM)常溫攪拌I小時，薄層層析點板跟蹤反應；待反應完畢，依次用飽和NaC03、5%HCl和蒸餾水各萃取一次；萃取液濃縮，柱層析純化，真空干燥；得橙黃色化合物Fc-Phe-Phe-OMe。四，將Fc-Phe-Phe-OMe (ImM)溶解在12mL的四氫呋喃，緩慢滴加2.5mM的氫氧化鋰6mL，室溫下攪拌2小時。薄層層析點板跟蹤反應；待反應完畢，減壓蒸餾盡量將其中的四氫呋喃抽凈，然后向此懸濁液里加入二氯甲烷30mL，依次用5%HC1和蒸餾水萃取，減壓旋轉蒸干。柱層析純化，真空干燥，得到化合物Fc-Phe-Phe-OH。實施例4一，采用參比電極(銀/氯化 銀電極)，對電極(鉬電極)，工作電極(修飾電極)的三電極體系，F(xiàn)c-PNWs-GOx修飾電極在3mL100mmol/L磷酸鹽(pH=7.4)中，電壓掃描范圍O 0.7V，掃描速率為0.lV/s條件下進行循環(huán)伏安測試。如圖4 (A)和(B)，實驗結果顯示，修飾電極穩(wěn)定性較好，隨著葡萄糖濃度的增加(0、10和20mmol/L), Fe的氧化峰電流明顯升高，由此可以說明Fc-PNWs結合大量G0x，間接提高了電極面積，且Fe促進了電子在酶和電極表面之間的轉移，同時CS包覆既不影響葡萄糖擴散也不影響Fc-PNWs和GOx分子間的電子轉移。二,三電極體系下,Fc-PNWs-GOx修飾電極在3mL100mmol/L磷酸鹽(pH=7.4)中，電壓0.6V，采集間隔0.ls，每隔20s進樣一次，進樣量為6μ L (lOOmmol/L葡萄糖溶解于磷酸緩沖溶液)，進行計時安培電流測試，圖4 (C)顯示在0.2 2mmol/L的范圍內，響應電流值與葡萄糖濃度呈現(xiàn)較好的線性關系，經測定保持線性關系最高葡萄糖濃度為3mmol/L，最低濃度為0.01mmol/L,標準曲線如圖4 (D)所示,信噪比為3時檢出限為5ymol/L,圖中所有點的誤差線(error bar,即相對標準偏差值)均小于6%。說明Fc-PNWs-GOx傳感器具有較好的重現(xiàn)性和再生性。三，采用二中的檢測方法檢測3種人體血樣檢測結果與醫(yī)院提供數(shù)據(jù)比對如下表:正常人與糖尿病患者血樣檢測
權利要求
1.二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物的制備方法，其特征在于，包括以下任一方式所述的步驟: 稱取二茂鐵-二苯丙氨酸溶于乙醇，待溶劑揮發(fā)后，二茂鐵-二苯丙氨酸逐漸析出并且自組裝形成線型納米材料A ;將A加入蒸餾水中，在超聲儀中超聲震蕩，使A由團聚狀態(tài)分散開來得到B ;取殼聚糖溶液與B混合，震蕩超聲后放置，使殼聚糖分子充分修飾到納米線表面得到C ;將C離心，移除上層溶液，然后至少重復進行兩次加pH=7.4的磷酸緩沖溶液、離心和移除上層溶液的過程后滴入戊二醛的水溶液，形成混合物后震蕩，然后離心得到D ；向D中加入葡萄糖氧化酶水溶液，震蕩，放置，即制成二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物； 或者 稱取二茂鐵-二苯丙氨酸溶于乙醇；待溶劑揮發(fā)后，二茂鐵-二苯丙氨酸逐漸析出并且自組裝形成線型納米材料A ;將A加入磷酸緩沖溶液，在超聲儀中超聲震蕩，使A由團聚狀態(tài)分散成單條納米線狀態(tài)，然后離心，再次加入磷酸緩沖溶液，離心，移除上層溶液，得到E，分別取殼聚糖溶液，戊二醛水溶液和葡萄糖氧化酶水溶液，加入E中配成二茂鐵-二苯丙氨酸溶液，震蕩超聲，放置，即制成二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物。
2.根據(jù)權利要求1所 述的制備方法，其特征在于，具體方法如下: 稱取二茂鐵-二苯丙氨酸溶于乙醇，配成2 5mg/mL的溶液；待溶劑揮發(fā)后，二茂鐵-二苯丙氨酸逐漸析出并且自組裝形成線型納米材料A ;稱取A2mg加入ImL蒸餾水，在超聲儀中超聲震蕩3 5分鐘，使A由團聚狀態(tài)分散開來得到B ;取ImL質量分數(shù)1%的殼聚糖溶液與B混合，震蕩超聲2分鐘后放置3小時，使殼聚糖分子充分修飾到納米線表面得到C ;將C離心，離心轉數(shù)為5000轉/分鐘，離心5分鐘，移除上層溶液，然后重復進行兩次加pH=7.4的磷酸緩沖溶液、離心和移除上層溶液的過程后滴入500 μ L0.25%的戊二醛的水溶液，形成混合物后震蕩半小時，然后離心得到D ;按照二茂鐵-二苯丙氨酸2mg/mL的配比，向D中加入10 15mg/mL的葡萄糖氧化酶水溶液，震蕩2_5分鐘，放置24h，即制成二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物； 或者 稱取2 5mg 二茂鐵-二苯丙氨酸溶于ImL乙醇；將溶液烘干待二茂鐵_ 二苯丙氨酸析出及自組裝形成線型納米材料A ;稱取A2mg加入ImL磷酸緩沖溶液,在超聲儀中超聲3 5分鐘，使A由團聚狀態(tài)分散成單條納米線狀態(tài)，然后5000轉/分鐘，離心5分鐘，再次加入ImL磷酸緩沖溶液，離心，移除上層溶液，得到E，分別取100 μ L0.5%質量分數(shù)的殼聚糖溶液,450 μ L0.25%戊二醒水溶液和450 μ L10-15mg/mL的葡萄糖氧化酶水溶液,加入E中配成2mg/mL的二茂鐵-二苯丙氨酸溶液，震蕩超聲2 5分鐘，放置24小時，即制成二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物。
3.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的二茂鐵-二苯丙氨酸的制備方法如下: I)將摩爾比1:1.2:1.2的單羧基二茂鐵、1-羥基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽溶在無水二氯甲烷中，體系置于冰浴中逐滴加入三乙胺至體系環(huán)境PH達到8.0 9.0范圍間；攪拌I小時；薄層層析點板跟蹤反應；待反應完畢，依次用飽和NaC03、5%HCl和蒸餾水各萃取一次；萃取液濃縮，柱層析純化，真空干燥；得暗紅色化合物Fc-OBt ； 2)將N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸鹽和1-羥基苯并三唑溶解于無水二氯甲烷，三者的濃度均為4.4mM,冰浴條件下逐滴加入三乙胺直至體系環(huán)境達到PH8-9范圍間，反應I小時，再加入L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽，使之濃度達到4.4mM,室溫攪拌18小時，薄層色譜點板監(jiān)測反應基本完全；依次用飽和NaHCO3, 10%HC1和蒸餾水洗滌，并用Na2SO4干燥；減壓蒸干，柱層析純化，在旋轉蒸發(fā)儀上旋轉蒸干至油狀液體，移入冷凍干燥機內低溫干燥，得Boc-Phe-Phe-OMe粉末； 3)將Boc-Phe-Phe-OMe溶于無水二氯甲烷20mL，濃度為2mM，再和IOmL三氟乙酸混合，常溫攪拌反應30min，減壓蒸干，所得中間產物H-Phe-Phe-OMe溶解在2mL無水二氯甲烷中，用三乙胺調至pH=8 ;繼續(xù)加入20mL無水二氯甲烷稀釋溶液，并加入步驟I)得到的Fc-OBt，使Fc-OBt濃度為2.2mM，常溫攪拌I小時，薄層層析點板跟蹤反應；待反應完畢，依次用飽和NaC03、5%HCl和蒸餾水萃取一次；萃取液濃縮，柱層析純化，真空干燥；得橙黃色化合物Fc-Phe-Phe-OMe ； 4)將Fc-Phe-Phe-OMe溶解在12mL的四氫呋喃，濃度為ImM，再緩慢滴加2.5mM的氫氧化鋰6mL，室溫下攪拌2小時；薄層層析點板跟蹤反應；待反應完畢，減壓蒸餾將其中的四氫呋喃抽凈，然后向此懸濁液里加入二氯甲烷30mL，依次用5%HC1和蒸餾水萃取，減壓旋轉蒸干；柱層析純化，真空干燥，得到化合物Fc-Phe-Phe-OH。
4.二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物，其特征在于，是由權利要求1或2或3所述的方法制備而成的。
5.權利要求4所述的二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物的應用方法，其特征在于，用于制備檢測血糖的生物傳感器或者試紙。
6.根據(jù)權利要求5所述的二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物的應用方法，其特征在于，在制備檢測血糖的生物傳感器時將制備得到的二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物滴加于電極上，干燥后即可。
7.根據(jù)權利 要求6所述的二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物的應用方法，其特征在于，取10 μ L 二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物滴加于電極上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種二茂鐵多肽納米線-葡萄糖氧化酶復合物及其制備和應用方法。首次基于二茂鐵-二苯丙氨酸自組裝納米線并結合葡萄糖氧化酶制備葡萄糖傳感器。該葡萄糖傳感器制備簡單，在37℃，pH=7.4的人體生理條件下具有較高的靈敏度和較寬的線性范圍，有望實現(xiàn)商品化。同時，該酶傳感器制備方法可望拓展到其它電化學酶傳感器的構建。
文檔編號C12N9/98GK103224925SQ20131010622
公開日2013年7月31日 申請日期2013年3月29日 優(yōu)先權日2013年3月29日
發(fā)明者陽明輝, 李丁, 王建秀, 孫志方 申請人:中南大學