專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種利用pax1和cdh1基因甲基化檢測(cè)宮頸癌的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及利用與宮頸癌發(fā)生相關(guān)基因PAX1和⑶HI的甲基化狀態(tài)檢測(cè)宮頸癌或?qū)m頸癌易感性的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：長(zhǎng)期以來(lái)，人們對(duì)生命體遺傳的觀點(diǎn)是用DNA語(yǔ)言(即以4個(gè)堿基核苷酸，腺苷酸(G)，胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)為語(yǔ)符的)來(lái)描述的。生命體表型的維持及異化均歸結(jié)于攜帶決定這些表型的基因的攜帶者DNA(在某些情況下，以RNA的形式)的忠實(shí)或突變后的代間傳遞。雙倍體生物的表型多樣性亦可由父本及母本的基因組的組合而大大地提高。然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明，不涉及到基因組一級(jí)結(jié)構(gòu)變化的表觀遺傳學(xué)的機(jī)制，也參與了高等生物體的遺傳和變異。幾乎在所有生物中都發(fā)現(xiàn)了DNA甲基化。除胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤外，DNA可含有甲基化的核堿基5-甲基胞嘧啶(5-mCyt)、N4-甲基胞嘧啶(4_mCyt)或N6-甲基腺嘌呤(6-mAde)。由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MTase)形成這些甲基化核堿基，該酶能催化活化甲基從輔因子S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)轉(zhuǎn)移到其DNA識(shí)別序列中的胞嘧啶的C5碳、胞嘧啶的N4氮或腺嘌呤的N6氮上(Cheng,(1995)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24，293-318)。由于核苷酸序列可以以甲基化或非甲基化形式存在，所以可認(rèn)為DNA甲基化是DNA信息量的增加，并負(fù)責(zé)各種生物功能。在原核生物中，DNA甲基化參與保護(hù)宿主基因組不受內(nèi)源性限制性核酸內(nèi)切酶、DNA錯(cuò)配修復(fù)、基因表達(dá)調(diào)控和DNA復(fù)制的影響。在真核生物中，DNA甲基化在一些重要的調(diào)控過(guò)程中起作用，這些調(diào)控過(guò)程包括基因沉默(Bird,(2002)GeneDev.16，6-21)、基因組印記(Feil和Khosla，(1999)TrendsGenet.15，431-435)、X-染色體失活(Panning和Jaenisch，(1998)Cell93，305-308)、基因組內(nèi)寄生物的沉默(Yoder,(1997)TrendsGenet.13，335-340)和癌發(fā)生(Baylin,(1998)Adv.CancerRes.72，141-196Jones和Laird,(1999)Nat.Genet.21，163-167)。據(jù)認(rèn)為許多癌癥與基因表達(dá)調(diào)控的改變有關(guān)。在許多情況下，基因表達(dá)改變可追溯到染色體DNA的甲基化模式改變。很久以前就知道，DNA甲基化是改變基因表達(dá)而不改變基因的編碼功能的機(jī)制。甲基化反應(yīng)涉及形成5-甲基胞嘧啶(5-mCyt)。令人感興趣的是，5-甲基胞嘧啶在染色體DNA中并非均勻分布，而傾向于位于CpG二核苷酸。哺乳動(dòng)物基因組含有數(shù)個(gè)分離的CpG二核苷酸，它們大部分是甲基化的(Larsen，等人，(1992)Genomics13，1095-1107)。更通常觀察到的是CpG的二核苷酸簇或“CpG島”(Gardiner-Garden和Frommer,(1987)J.Mol.Biol.196，261-282)，它們存在于約40%的哺乳動(dòng)物基因的啟動(dòng)子和外顯子區(qū)。CpG島長(zhǎng)度一般為約0.2-lkb，并富含胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤。已證明CpG島連接于所有管家基因和許多組織特異性基因的5’端，并連接于一些組織特異性基因的3’端。5’CpG島可通過(guò)5’側(cè)翼DNA、外顯子和內(nèi)含子延伸，而大多數(shù)3’CpG島似乎連接于外顯子。CpG島通常的位置與不同種類(lèi)中等效基因的轉(zhuǎn)錄單元相同，但有一些顯然例外(Gardiner-Garden3和Frommer，(1987)J.Mol.Biol.196，261-82)。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象的一種核心機(jī)制。在高等生命體中，組成DNA的4個(gè)堿基核苷酸，僅胞嘧啶的5’碳原子可被甲基化。這也只發(fā)生在其3’端毗鄰的堿基核苷酸為鳥(niǎo)苷的胞嘧啶5’碳原子上，即5’CpG3’的二連體中的胞嘧啶。這些GpG二連體在高等生命體基因組中的出現(xiàn)的頻率僅為0.6%左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于二連體均態(tài)出現(xiàn)的預(yù)期值8.35%。這一分布的非隨機(jī)性偏移是與甲基化的C很易經(jīng)脫氨等反應(yīng)過(guò)程而轉(zhuǎn)變?yōu)?尿嘧啶U，胸腺嘧啶T)，即，與胞嘧啶甲基化可促進(jìn)C向T的點(diǎn)突變的現(xiàn)象相關(guān)。在高等生命體中，大部分CpG二連體散在于象AluI和Line等類(lèi)高度重復(fù)序列中，且甲基化程度高。CpG的甲基化將抑制重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄活性從而負(fù)調(diào)該類(lèi)DNA的片段轉(zhuǎn)座和重排，以確?；蚪M的穩(wěn)定。剩余的CpG則富集在所謂的CpG島區(qū)(長(zhǎng)度為200-1000bp左右，CpG的頻率在8.33%左右)。CpG島的分布有著高度的選擇性，尤以見(jiàn)之于核糖體RNA基因和50%左右編碼蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子區(qū)而令人矚目。在多數(shù)情況下，這類(lèi)CpG島的甲基化程度很低，是這類(lèi)基因得以轉(zhuǎn)錄所必需。全豐度的甲基化僅見(jiàn)于完全靜息化了的常染色體的遺傳印記基因或女性個(gè)體失活了的X染色體上的多個(gè)基因的CpG島。CpG二連體的甲基化是一由甲基轉(zhuǎn)移酶以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體和DNA為模板的反應(yīng)過(guò)程。CpG二連體的C甲基化雖不影響C與G之間的堿基配對(duì)，但可明顯地改變的DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)的精細(xì)分析表明甲基基團(tuán)外伸在DNA雙螺旋原先空置的大溝區(qū)中，這直接影響DNA與蛋白質(zhì)相互的作用。參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中的很多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子所識(shí)別的DNA序列中含有CpG序列。由此這類(lèi)CpG的甲基化會(huì)使其與相應(yīng)蛋白的結(jié)合能力減弱，從而引起有關(guān)的下游基因轉(zhuǎn)錄受抑以至失活。長(zhǎng)期以來(lái)，癌被認(rèn)為是一種涉及到多個(gè)關(guān)鍵基因的量或質(zhì)發(fā)生改變的遺傳性的疾病。癌相關(guān)的染色質(zhì)數(shù)目和結(jié)構(gòu)的宏觀水平改變，早在上世紀(jì)初已有報(bào)道。近代癌癥分子遺傳學(xué)研究在核苷酸序列的水平上已精確地描述了眾多正或負(fù)地影響正常細(xì)胞向癌變細(xì)胞惡化過(guò)程的基因的變化(點(diǎn)突變、缺失重排等等)。另外，在腫瘤細(xì)胞中抑癌基因的去表達(dá)似乎也可因其啟動(dòng)子CpG島的甲基化程度提高所致。同樣，癌基因啟動(dòng)子的去甲基化和該基因的活化亦同見(jiàn)之于某些腫瘤細(xì)胞中。與此同時(shí)，CpG島區(qū)選擇性的甲基化也可導(dǎo)致抑癌基因的失活。隨著人們對(duì)DNA的甲基化在腫瘤發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)的影響的重視程度的提高，對(duì)各類(lèi)腫瘤的DNA甲基化的分析已成為當(dāng)前種腫瘤分子生物些研究的一個(gè)熱點(diǎn)。在W02002/070742中公開(kāi)了一種基于基因的甲基化進(jìn)行疾病檢測(cè)的方法，其中列舉了多達(dá)上百種的抑癌基因和原癌基因，并認(rèn)為這些抑癌基因和原癌基因可能與某些癌癥有關(guān)，其中包括ABL1、ABL2、AKT1、AKT2、APC、ARAF1、ARAF2、ARHA、ARHB、ARHC、AXL、BCL2、BCL3、BCR、BLYM、BMI1、BRAF、BRAFP、CBFA2、CBL、CCND1、CDH1、CDK4、CDKN1A、CDKN1C、CDKN2A、CHES1、COT、CRK、CRKL、CSF1R、DIGS170、DCC、DDX6、E2F1、ECT2、EGFR、EIF3S6、ELEI、ELK1、ELK2P1、ELK3、EMPLI、EMS1、EPHA1、EPHA3、ERBA2L、ERBAL2、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERG、ETS1、ETS2、ETV1、ETV3、ETV6、EVI1、EWSR1、FAT、FER、FES、FGF3、FGF4、FGF6、FGR、FKHL1、FLU、FLT1、FOS、F0SB、F0SL1、F0SL2、FYN、GLI、GLI2、GLI3、GRF2、GR01、GR02、GR03、HCK、HKR3、HRAS、HRASP、INT6P1、IRF4、JUN、JUNB、JUND、KAI1、CD82抗原、KIT、KRAS1P、KRAS2、LBC、LCK、LCN2、LCO、LPSA、LTA、LTB、LYN、M1S1、M4S1、MADH4、MAF、MAFG、MAFK、MASKMAX,MCC、MCF2、MDM2、MEL、MELL1、MET、MLH1、MOS、MPL、MSH2、MUM1、MYB、MYBL1、MYBL2、MYC、MYCL1、MYCL2、MYCLK1、MYCN、MYCP、NBL1、NF1、NF2、NFKB2、NKTR、N0TCH4、NOV、NRAS、NRASL1、NRASL2、NRASL3、NTRK1、OVC、PACE、PDGFB、PIM1、PVT1、RAB1、RAB11A、RAB11A、RAB13、RAB2、RAB27A、RAB27B、RAB2L、RAB3A、RAB3B、RAB4、RAB5A、RAB5B、RAB6、RAB7L1、RABL、RAF1、RAF1P1、RALA、RALB、RAN、RAP1A、RAP1AP、RAPIB、RAP2A、RAP2B、RB1、REL、RELA、RELB、RET、ROS1、RRAS、SEA、SKI、SMARCB1、SPI1、SPINK1、SRC、ST5、SUPT3H、SUPT5H、SUPT6H、TALI、TGFBR2、THPO、THRA、THRB、TIAM1、TIM、TM4SF1、TNF、TP53BP2、TP73、TPR、TRE17、USP4、USP6、VAV1、VAV2、VHL、WNT1、WNT2、WNT5A、WT1、YES1、YESP、AMPHL、APC、ARHA、ARHB、ARHC、AXL、BCL2、BCL3、BCR、BLYM、BRCA1、BRCA2、CBL、CCND1、CDH1、CDK4、CDKN1A、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CHES1、D1OS170、DCC、DDX6、E2F1、EIF3S6、ELE1、ELK3、EMP1、EMS1、EPHA1、EPHA3、ETV3、EVI1、EWSRUFAT、FER、FHIT、FKHL1、FLT1、F0SL1、F0SL2、GLI2、GLI3、HCK、HKR3、ING1、IRF4、KAI1、CD82抗原、LCK、LTA、LTB、MISI、IMS1、MADH4、MAX、MCC.MENUMLH1、MSH2、NBL1、NF1、NF2、NFKB2、NKTR、NME1、NOV、NTRK1、PDGFRL、PLA2G2A、PTCH、PTEN、RBI、SMARCB1、SPINK1、ST5、SUPT3H、SUPT5H、SUPT6H、TALI、TGFBR2、TIAM1、TIM、TM4SF1、TNF、TP53、TP53BP2、TP73、VHL、WNTUWNT2、WNT5A、WT1。宮頸癌是常見(jiàn)的婦科腫瘤之一，嚴(yán)重危害女性生命健康。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，多種抑癌基因的失活是導(dǎo)致宮頸癌的重要原因，而DNA甲基化作為一種主要的基因失活方式在宮頸癌中被頻繁發(fā)現(xiàn)(KEKEEVATV,ZHEVLOVAAI,PODISOCIUI,etal.Aberrantmethylationoftumorsuppressorgenesandallelicimbalanceincervicalintraepithelialneoplasia[J].MolBiol(Mosk)2006，40(2):224_230)。雖然已知了眾多的抑癌基因或原癌基因，然而導(dǎo)致哪些基因與宮頸癌發(fā)生密切有關(guān)是不清楚的。如果需要同時(shí)檢測(cè)10種或更多的基因才能給出檢測(cè)結(jié)果的話，那么可能會(huì)因檢測(cè)成本過(guò)高而難以普及。另一方面，如果確定的少數(shù)幾種基因不能覆蓋絕大部分患者的話，那么又可能會(huì)導(dǎo)致漏檢率過(guò)高。綜上所述，鑒于包括宮頸癌在內(nèi)的多種癌癥的治療成功大部分取決于腫瘤發(fā)生的早期診斷，因此本領(lǐng)域迫切需要研究各種基因在DNA甲基化狀態(tài)與宮頸癌的相關(guān)性，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)更為敏感和有效的早期診斷的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供新的更有效和簡(jiǎn)便的檢測(cè)宮頸癌或?qū)m頸癌易感性的方法和試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供一種有助于早期輔助檢測(cè)宮頸癌或?qū)m頸癌與宮頸炎和HPV感染進(jìn)行有效區(qū)分的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種可用于檢測(cè)宮頸癌的試劑盒，它含有(a)針對(duì)P0X1基因和CDH1基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對(duì)；或含有(b)甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶，以及針對(duì)P0X1基因和CDH1基因的特異性引物對(duì)。5在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還可用于將(1)宮頸癌與(2)宮頸炎和HPV感染但無(wú)宮頸癌進(jìn)行區(qū)分。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還可用于將(1)宮頸癌與(3)宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變I期(CINI)進(jìn)行區(qū)分。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照和/或陰性對(duì)照。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的特異性引物對(duì)通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出擴(kuò)增產(chǎn)物含有啟動(dòng)子區(qū)的CpG島。在另一優(yōu)選例中，所述的針對(duì)CDHl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對(duì)如下(i)CDHl甲基化引物對(duì)GTGGGCGGGTCGTTAGTTTC,SEQIDN0:1禾口CTCACAAATACTTTACAATTCCGACG,SEQIDNO2；(ii)CDHl甲基化引物對(duì)GGTGGGTGGGTTGTTAGTTTTGT,SEQIDNO3禾口AACTCACAAATCTTTACAATTCCAAC,SEQIDNO:4。在另一優(yōu)選例中，所述的針對(duì)POXl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對(duì)如下(iii)擴(kuò)增PAXl基因的甲基化引物對(duì)TATTTTGGGTTTGGGGTCGC,SEQIDNO5CCCGAAAACCGAAAACCG,SEQIDNO6；(iv)擴(kuò)增PAXl基因的甲基化引物對(duì)GTTTATTTTGGGTTTGGGGTTGTG,SEQIDNO7CACCCAAAAACCAAAAACCAC,SEQIDNO:8。在另一優(yōu)選例中，所述的甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶選自HpaII、BstuI和HhaI。在另一優(yōu)選例中，所述的使甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的試劑包括亞硫酸氫鹽，聯(lián)苯二酚和氫氧化鈉。在本發(fā)明第二方面中，提供了一種引物集的用途，所述的引物集包括(a)針對(duì)POXl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對(duì)和(b)針對(duì)CDHl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對(duì)，所述的引物集被用于制備檢測(cè)宮頸癌或?qū)m頸上皮內(nèi)瘤樣病變的試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的引物集被用于制備檢測(cè)宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變I期(CINI)和II-III期(CINII-III)的試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的引物集被用于制備檢測(cè)人的宮頸癌或?qū)m頸上皮內(nèi)瘤樣病變的試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的引物集還被用于制備區(qū)別宮頸癌與宮頸炎的試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的引物集包括或由以下引物構(gòu)成序列如SEQIDNO=I-S所示的引物。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種基因集的用途，所述的基因集包括(a)POXl基因和(b)CDHl基因，其中所述的基因集被用于制備檢測(cè)宮頸癌或?qū)m頸上皮內(nèi)瘤樣病變的試劑或試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括或由以下引物構(gòu)成序列如SEQIDN0:l_8所示的引物；或者，所述的試劑盒含有序列如SEQIDN0:l-8所示的引物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。圖1.CDHl基因的MSP-PCR和非MSP-PCR反應(yīng)后產(chǎn)物電泳結(jié)果。其中，U非甲基化M甲基化。各泳道如下M=DNA分子量標(biāo)志物；12=HPV；34宮頸炎；56=CINI；78=CINIIIII；910宮頸癌；11陽(yáng)性對(duì)照；12陰性對(duì)照。圖2.PAXl基因的MSP-PCR和非MSP-PCR反應(yīng)后產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。其中，U:非甲基化M甲基化。各泳道如下M=DNA分子量標(biāo)志物；12=HPV；34宮頸炎；56=CINI；78=CINIIIII；910宮頸癌；11陰性對(duì)照；12陽(yáng)性對(duì)照具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，對(duì)大量基因進(jìn)行了篩查，對(duì)宮頸癌患者的癌及其癌旁組織的多種基因甲基化的情況進(jìn)行了分析，意外地發(fā)現(xiàn)，對(duì)于PAXl和CDHl這兩種基因而言，不僅其各自甲基化狀態(tài)與宮頸癌之間存在密切相關(guān)性，而且基于這兩個(gè)基因的檢測(cè)存在極佳的互補(bǔ)性(如在宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變I期和CINIIIII期樣品中無(wú)交叉樣品)且覆蓋廣(在宮頸癌中可檢測(cè)高達(dá)97%的樣品)。此外，從HPV感染到宮頸炎、再到宮頸增生及宮頸癌的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中，⑶Hl和PAXl基因甲基化的陽(yáng)性率明顯增高。這提示⑶Hl和PAXl基因可能涉及導(dǎo)致宮頸癌的二種不同機(jī)制。此外，通過(guò)對(duì)⑶Hl和PAXl基因甲基化的跟蹤檢測(cè)，可以作為判斷HPV感染到宮頸炎、再到宮頸增生及宮頸癌的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程的參考指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明人應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)法(methylationspecificPCR,MSP)對(duì)HPV、宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cervicalintraepithelialneoplasia,CINI)、CINIIIII(各15例)及宮頸癌組(40例)組織中⑶HI、PAXl基因進(jìn)行甲基化檢測(cè)。結(jié)果表明(I)CDHl基因在HPV、宮頸炎、CINI組中均末出現(xiàn)甲基化狀態(tài)，在CINII-III組和宮頸癌組甲基化的陽(yáng)性率分別為13.3%、22.5%，與前述各組相比差異顯著，P<0.05；(2)PAXl基因甲基化在HPV、宮頸炎組中末出現(xiàn)，在CINI、CINII-III組和宮頸癌組中甲基化的陽(yáng)性率分別為13.3%、46.7%、87.5%，P<0.05，與前述各組相比差異顯著。(3)上述基因甲基化總陽(yáng)性率(任何一個(gè)基因出現(xiàn)甲基化即為陽(yáng)性)宮頸癌組(97.5%)高于CINII-III組(60.0%),(P<0.05)；兩組均明顯高于CINI組(13.5%),(P<0.05)。這提示，從HPV感染到宮頸炎、再到宮頸增生及宮頸癌的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中，⑶HI、PAXl基因甲基化的陽(yáng)性率明顯增高。這一結(jié)果顯示，⑶Hl和PAXl基因的組合，在宮頸癌的臨床診斷上具有潛在價(jià)值。如本文所用，“啟動(dòng)子CpG島特異性引物”指與模板DNA基本上完全匹配且與模板的結(jié)合位點(diǎn)中包括啟動(dòng)子CpG島或其一部分的引物。例如，用甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶處理樣品DNA后，未甲基化的CpG島被切割開(kāi)，而甲基化的CpG島未被切割。使用特異性結(jié)合于該啟動(dòng)子CpG島的引物(即啟動(dòng)子CpG島特異性引物)時(shí)，前者不會(huì)產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，而后者則會(huì)產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。又例如，如果采用使胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的試劑(包括亞硫酸氫鈉，聯(lián)苯二酚和氫氧化鈉)使胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，這可以使用二對(duì)引物，一對(duì)引物針對(duì)甲基化情況，另一對(duì)引物針對(duì)未甲基化情況，它們會(huì)因該CpG島的甲基化或非甲基化以否而特異地結(jié)合于含啟動(dòng)子CpG島的區(qū)域，從而引發(fā)甲基化或非甲基化特異性的PCR擴(kuò)增。在本發(fā)明提供的宮頸癌相關(guān)基PAXl和CDHl都屬于抑癌基因。當(dāng)抑癌基因的啟動(dòng)子CpG島發(fā)生甲基化后，導(dǎo)致抑癌基因不表達(dá)或表達(dá)水平下降，從而導(dǎo)致癌癥。因此，在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，檢測(cè)抑癌基因(尤其是其啟動(dòng)子CpG島)是否發(fā)生了甲基化。如果存在上述情況，就表明被檢測(cè)對(duì)象患有宮頸癌或?qū)m頸癌易感性高于正常人群。分析DNA甲基化的常見(jiàn)方法有以下二種(1)使用對(duì)甲基化敏感的限制性?xún)?nèi)切酶；(2)甲基化胞嘧啶核苷酸特異性的PCR。第一種方法(使用對(duì)甲基化敏感的限制性?xún)?nèi)切酶)方便簡(jiǎn)單，但受限于限制性?xún)?nèi)切酶的DNA識(shí)別序列的有限性。目前可供使用的酶僅有三種HpaII(CCGG)(注MspI是可以切動(dòng)甲基化的CCGG序列的酶)、BstuI(CGCG)和HhaI(GCGC)。這些酶無(wú)法切動(dòng)其中CpG二連體中C甲基化了的識(shí)別序列。基因組DNA經(jīng)這些酶分別充分消化后，作為模板用相應(yīng)的引物對(duì)有關(guān)的區(qū)段進(jìn)行PCR分析。PCR結(jié)果陽(yáng)性意味著相應(yīng)CpG沒(méi)有被甲基化，否則即甲基化。顯然這種方法受到“并非所有CpG二連體會(huì)位于限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列之中”這一事實(shí)的限制，且只能提供存在上述核苷酸序列中CpG中的C的甲基化的狀態(tài)的信息，對(duì)其它CpG的甲基化狀態(tài)的評(píng)估毫無(wú)價(jià)值。第二種方法(甲基化胞嘧啶核苷酸特異性的PCR)，可以對(duì)任一對(duì)象片段中的每個(gè)CpG二聯(lián)體中的C是否甲基化進(jìn)行測(cè)定。由于亞硫酸氫鹽處理單鏈的DNA中，所有的未甲基化的胞嘧啶脫氨后均變?yōu)槟蜞奏?，其配?duì)由C:G變?yōu)門(mén):A，而甲基化C不會(huì)被脫氨而仍保持C:G配對(duì)。結(jié)果是前者(未甲基化)的二連體序列變?yōu)镃pG二TpG，而后者(甲基化的)則仍為CpG。通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增的片段進(jìn)行測(cè)序，人們可以研究該研究區(qū)域中的每個(gè)CpG的甲基化的狀態(tài)。本發(fā)明所提供的腫瘤發(fā)生的重要基因的甲基化狀態(tài)信息，在宮頸癌的基因診斷和治療上有極為重大的指導(dǎo)性意義。在診斷方面，由于所研究的對(duì)象是DNA，它較蛋白質(zhì)及RNA材料的穩(wěn)定性明顯為高，對(duì)發(fā)展簡(jiǎn)單易用檢驗(yàn)方法是有利的。診斷新方法的準(zhǔn)確、快速以及方便上的程度都是影響其的應(yīng)用前景的關(guān)鍵因素。上面所提到兩種檢測(cè)甲基化的方法都用于檢測(cè)，即，使用對(duì)甲基化敏感的限制性?xún)?nèi)切酶酶切方法以及亞硫酸氫鈉處理DNA的方法，再分別結(jié)合PCR反應(yīng)的程序。另外，DNA芯片技術(shù)也可以用于將來(lái)的臨床檢驗(yàn)的方法。此外，還可通過(guò)對(duì)檢測(cè)樣品直接進(jìn)行測(cè)序，而進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒本發(fā)明還提供一種檢測(cè)宮頸癌或?qū)m頸癌易感性的試劑盒，它包括(a)針對(duì)POXl基因和CDHl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對(duì)；或含有(b)甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶，以及針對(duì)POXl基因和CDHl基因的特異性引物對(duì)。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于抽提液、擴(kuò)增液、雜交液、酶、對(duì)照液等。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)基于PAXl和⑶Hl這兩種基因的檢測(cè)存在極佳的互補(bǔ)性(如在宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變I期和CINIIIII期樣品中無(wú)交叉樣品)且覆蓋廣(在宮頸癌中可檢測(cè)高達(dá)97%的樣品)。(b)從HPV感染到宮頸炎、再到宮頸增生及宮頸癌的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中，⑶Hl和PAXl基因甲基化的陽(yáng)性率明顯增高。因此，通過(guò)對(duì)⑶Hl和PAXl基因甲基化的跟蹤檢測(cè)，可以作為判斷HPV感染到宮頸炎、再到宮頸增生及宮頸癌的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程的參考指標(biāo)，為臨床診斷治療提供新的方法。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYorkCoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。1資料與方法1.1臨床資料選擇2006年1月至2008年11月在上海市第八人民醫(yī)院行宮頸環(huán)形電刀切除術(shù)、子宮全切除術(shù)以及門(mén)診活檢的患者。根據(jù)宮頸上皮有無(wú)異型細(xì)胞、異型細(xì)胞侵犯上皮的程度以及細(xì)胞的極性、核分裂象分成HPV感染正常宮頸組織標(biāo)本15例、宮頸炎組標(biāo)本15例、CINI組標(biāo)本15例、高度CINIIIII組標(biāo)本15例、宮頸癌組標(biāo)本各40例?；颊吣挲g1763歲，中位年齡32歲。所有樣本一次性取組織約50mg-150mg，放入液氮中保存以備提取基因組DNA。1.2組織DNA提取DNA的提?、贅?biāo)本中加入組織消化液和蛋白酶K(終濃度為0.5mg/ml)55°C過(guò)夜。②取上述等體積的酚、氯仿、異戊醇混合物，室溫振蕩、離心取上清液2次。③1/10體積的3mol/L醋酸鈉，2倍體積的無(wú)水乙醇混勻，-20°C過(guò)夜。④離心，75%乙醇洗滌沉淀，ddH2050ul溶解后于_20°C保存待用。1.3MSP檢測(cè)聚合酶(Takara公司產(chǎn)品)，dNTPmix(混合脫氧核苷三磷酸)(Takara公司)使用方法參考試劑說(shuō)明。(a)亞硫酸氫鈉處理取IOugDNA,加入3MNaOH至終濃度0.3M，37°C15分鐘一加入新鮮配制的對(duì)苯二酚至終濃度5mM—加入新鮮配制的亞硫酸氫鈉(sodiumbisulfite,pH5.0)至終濃度3.1M—加礦物油，50°C16小時(shí)。將的瓊脂糖加入2ml的試管，插入200ul的管尖。待瓊脂糖凝固后拔出tip，在孔中加入上述處理樣品。室溫下靜置45分鐘。重復(fù)以上操作3次。吸出以上樣品加入3MNaOH至終濃度0.3M，37°C15分鐘。加入lug/lul糖原，加入IOMNH4Ac至終濃度3M，加入3倍體積無(wú)水乙醇。沉淀DNA(_20°C過(guò)夜，離心30分鐘)，70%乙醇洗滌，干燥，溶解于20ul的水中。保存在_20°C。(b)甲基化胞嘧啶特異性PCR法分別用甲基化特異性或非甲基化特異性引物對(duì)(表1)對(duì)處理過(guò)的DNA進(jìn)行PCR。用MJ公司的PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，所有基因甲基化和非甲基化PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并用溴化乙錠(EB)染色。相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)使用50bp標(biāo)準(zhǔn)DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(北京天為時(shí)代科技有限公司)。PCR反應(yīng)體系中用ddH20代替DNA作為陰性對(duì)照。其余反應(yīng)試劑和條件一樣。結(jié)果分析采用PCR產(chǎn)物條帶用凝膠成像系統(tǒng)(ΒΙΟ-Rad公司)。MSP引物由上海生工合成，引物序列見(jiàn)表1。表1.MSP中所用的引物序列和產(chǎn)物片斷大小SEQIDSEQID長(zhǎng)度基因正向引物(5，-3')反向引物(5，-3’)_NO:_NO:(bp)CDHl(M)GTGGGCGGGTCGTTAGTTTC1CTCACAAATACTTTACAATTCCGACG2172CDHl(U)GGTGGGTGGGTTGTTAGTTTTGT3AACTCACAAATCTTTACAATTCCAAC4172PAXl(M)TATTTTGGGTTTGGGGTCGC5CCCGAAAACCGAAAACCG6153PAXl(U)GTTTATTTTGGGTTTGGGGTTGTG7CACCCAAAAACCAAAAACCAC_81581.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)甲基化的總陽(yáng)性率=所有基因甲基化例數(shù)/所有基因分析的例數(shù)X100%基因甲基化率=基因甲基化數(shù)/標(biāo)本總數(shù)X100%數(shù)據(jù)顯著性分析采用T檢驗(yàn)。2結(jié)果2.IOTHl基因在宮頸癌和非癌對(duì)照各組間的甲基化情況部分CDHl基因的甲基化和非甲基化PCR產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖1。⑶Hl基因甲基化在HPV組、宮頸炎組和CINI組中均未見(jiàn)檢出；在CINIIIII組中檢出2例(所占比例為13.3%，與HPV組有顯著差異，P<0.05)，宮頸癌組中檢出9例(所占比例為22.5%，與HPV組有顯著差異，P<0.05)。但宮頸癌組和CINII-III組相比，其顯著性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從以上各組來(lái)看，⑶Hl基因甲基化比例隨病癥發(fā)展程度呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。而用甲基化引物和非甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在所有各組樣本中，用CDHl基因非甲基化引物都能擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明CDHl基因即使在標(biāo)本中存在著甲基化現(xiàn)象，也不是整個(gè)基因完全甲基化(詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2)。表2宮頸癌發(fā)生過(guò)程不同時(shí)期基因異常甲基化的例數(shù)和百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*N樣本數(shù)量；P括號(hào)內(nèi)為百分比2.2PAX1基因在宮頸癌和非癌對(duì)照各組間的甲基化情況部分PAXl基因的甲基化和非甲基化PCR產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖2。PAXl基因甲基化在HPV組和宮頸炎組中均未見(jiàn)出現(xiàn)。在CINI組中出現(xiàn)2例(所占比例為13.3%，和HPV組P>0.05，無(wú)顯著差異)，CINII-III組中出現(xiàn)7例(所占比例為46.7%JPCINI組有顯著差異，P<0.05)，宮頸癌組出現(xiàn)35例(所占比例為87.5%，和CINII-III組有顯著差異，P<0.05)。從以上各組來(lái)看，PAXl基因的甲基化比例從HPV組、宮頸炎組至CINI組、CINIIIII組、宮頸癌組逐步遞增，并且在CINIIIII組和宮頸癌組中具有非常高的甲基化陽(yáng)性率。從甲基化的總陽(yáng)性率來(lái)看，HPV組和宮頸炎組無(wú)甲基化，在CINI組中甲基化總陽(yáng)性率為13.3%，在CINII-III組和宮頸癌組中分別達(dá)到了60.0%和97.5%(見(jiàn)表2)。3討論盡管高危型人乳頭狀病病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染被認(rèn)為是最有可能的宮頸癌致病因素，但HPV病毒感染本身并不能完全導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生，因?yàn)槟[瘤的發(fā)生是多步驟多階段的一個(gè)過(guò)程，腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期涉及很多基因的失活或過(guò)量表達(dá)，目前HPV感染后啟動(dòng)宮頸癌中相關(guān)抑癌基因失活的具體分子機(jī)制并不清楚，但DNA甲基化作為一種主要的抑癌基因失活方式在宮頸癌中被頻繁發(fā)現(xiàn)，已有的研究多從ΠΠΤ、P16等在其它腫瘤中廣泛出現(xiàn)的失活平行應(yīng)用到宮頸癌中的研究。DNA甲基化屬于表觀遺傳學(xué)的一部分，通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)的甲基修飾導(dǎo)致基因無(wú)法轉(zhuǎn)錄。而腫瘤細(xì)胞作為一種惡性增殖細(xì)胞脫離了細(xì)胞周期和凋亡調(diào)控，在分子機(jī)制上常涉及抑癌基因的失活，目前已有大量的研究表明抑癌基因的DNA頻繁甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切。⑶Hl和PAXl是眾多抑癌基因中的二個(gè)抑癌基因。成對(duì)區(qū)控制基因家族(Pairedbox,PAX)是包括了128個(gè)氨基酸的成對(duì)結(jié)構(gòu)域。目前共發(fā)現(xiàn)9個(gè)PAX基因，即PAXl9。PAX基因編碼一組結(jié)合特異DNA序列的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)不同基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、浸潤(rùn)等生物學(xué)行為。目前PAX家族基因的甲基化和腫瘤方面的研究尚為數(shù)不多，HATA等研究了PAX4在黑色素瘤中存在著異常甲基化，據(jù)此認(rèn)為它是一個(gè)抑癌基因(HATAS，HAMADAJ，MAEDAK，etal.PAX4hasthepotentialtofunctionasatumorsuppressorinhumanmelanoma[J].IntJOncol.2008,33(5):1065-1071)；Li等也報(bào)道了PAX4基因在血液腫瘤中存在著異常甲基化M^.(LIY,NAGAIH,0JN0T,etal.AberrantDNAdemethylationinpromoterregionandaberrantexpressionofmRNAofPAX4geneinhematologicmalignancies[J].LeukRes.2006，30(12):1547-1553.)。而PAXl基因在宮頸癌中的異常甲基化是Lai等人于2008年首次發(fā)現(xiàn)的(LAIHC,LINYff,HUANGTH,etal.IdentificationofnovelDNAmethylationmarkersincervicalcancer[J]·IntJCancer.2008,123(1):161-167)，通過(guò)全基因組掃描芯片發(fā)現(xiàn)PAXl是宮頸癌發(fā)生的一個(gè)有效基因。此外，他們比較了正常組織和HSIL/SCC標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，PAXl基因甲基化合并HPV檢測(cè)可以提高臨床檢測(cè)靈敏度(提高了14%)，因而揭示了PAXl基因在宮頸癌的篩選鑒定上有著重要意義。本發(fā)明人系統(tǒng)地檢測(cè)了宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中不同階段包括HPV感染者、宮頸炎、CINI型、CINIIIII型、宮頸癌病人的PAXl基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化陽(yáng)性情況，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)明顯增高狀態(tài)，在HPV感染者、宮頸炎、CINI型組織中無(wú)陽(yáng)性率或陽(yáng)性率極低；在CINIIIII組、宮頸癌組織中甲基化陽(yáng)性率則極高，尤其是在宮頸癌患者中陽(yáng)性率可達(dá)87.5%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大多數(shù)其他基因在子宮頸癌中的甲基化陽(yáng)性率。同時(shí)這一結(jié)果也恰能說(shuō)明PAXl基因可以作為宮頸癌臨床診斷的一個(gè)極具參考價(jià)值的指標(biāo)。E-cadherin的編碼基因⑶Hl是一種腫瘤抑制基因和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。已有研究表明，E-cadherin的編碼基因⑶Hl異常甲基化與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)(NAKATAS,SUQIOK,URAM0TAH,etal.ThemethylationstatusandproteinexpressionofCDHl,ρ16(INK4A),andfragilehistidinetriadinnonsmallcelllungcarcinomaepigeneticsilencing，clinicalfeatures,andprognosticsignificance[J].Cancer.2006,106(10):2190_2199)。已知正常組織細(xì)胞向腫瘤的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，⑶Hl失活，細(xì)胞的粘附能力下降，遷移運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，因而⑶Hl可用作判斷腫瘤從良性至惡性轉(zhuǎn)變的一個(gè)重要分子標(biāo)志物。CDHl基因的甲基化頻繁出現(xiàn)于膽管癌、卵巢癌胃癌等各種不同的癌癥標(biāo)本和細(xì)胞株Φ(LEES,KIMWH,JUNGHY,etal.AberrantCpGislandmethylationofmultiplegenesinntrahepaticcholangiocarcino-ma[J].AmJPathol,2002,1611015-1022；沈文靜，郭科軍，戴冬秋，等.CDHl基因異常甲基化在上皮性卵巢癌中的檢測(cè)及臨床意義[J],中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2007，7:520-522;丫六獻(xiàn)5!111六S,TSUJIN0Y，MORIGUCHIK,etal.ChemicalgenomicscreeningformethyIation-silencedgenesingastriccancercelllinesusing5-aza-2'-deoxycytidinetreatmentandoligonucleotidemicroarray[J],CancerSci.，2006，97:64_71)。此外，CDHl基因的甲基化被認(rèn)為是E-cadherin表達(dá)下調(diào)或無(wú)表達(dá)的主要原因(CHENCL,LIUSS,IPSM,etal.E-cadherinexpressionissilencedbyDNAmethylationincervicalcancercelllinesandtumours[J].Eur.J.Cancer.2003,39517-523；Τ0Υ00ΚΑKO，T0Y00KAS,VIRMANIAK，etal.LossofexpressionandaberrantmethylationoftheCDH13(H-cadherin)geneinbreastandlungcarcinomas[J].CancerRes.2001,61:4556_4560·)。既然CDHl基因在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)變過(guò)程中起著關(guān)健的作用，那么其和腫瘤治療預(yù)后是密切相關(guān)的。Widschwendter等人的研究顯示，血清DNA檢測(cè)的⑶Hl和⑶H13非陽(yáng)性癌頸癌病人存活期顯著高于陽(yáng)性病人，存活期中位值分別為1.2年和4.3年。同時(shí)在宮頸癌中CDHl和CDH13的合并甲基化率達(dá)到43%(WIDSCHWENDTERA,IVARSS0NL,BLASSNIGA.CDHlandCDH13methylationinserumisanindependentprognosticmarkerincervicalcancerpatients[J]·Nt.J.Cancer.2004.109，163-166)。在本發(fā)明人的研究顯示了相似的結(jié)果，⑶Hl在宮頸癌中的甲基化率為22.5%。更為重要的是，本發(fā)明人通過(guò)在子宮頸癌中對(duì)PAXl和⑶Hl兩個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行甲基化研究，并且揭示了這兩個(gè)基因之間存在極佳的互補(bǔ)性，并且隨著宮頸癌發(fā)生發(fā)展的不同階段中的甲基化狀態(tài)改變。本發(fā)明人的研究顯示，二者在宮頸癌組織中的總陽(yáng)性率可達(dá)97.5%，并且隨著病癥的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)明顯的升高趨勢(shì)。綜上所述，對(duì)于PAXl和⑶Hl這兩種基因而言，不僅其各自甲基化狀態(tài)與宮頸癌之間存在密切相關(guān)性，而且基于這兩個(gè)基因的檢測(cè)存在極佳的互補(bǔ)性(如在宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變I期和CINIIIII期樣品中無(wú)交叉樣品)且覆蓋廣(在宮頸癌中可檢測(cè)高達(dá)97%的樣品)。此外，從HPV感染到宮頸炎、再到宮頸增生及宮頸癌的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中，⑶Hl和PAXl基因甲基化的陽(yáng)性率明顯增高。這提示⑶Hl和PAXl基因可能涉及導(dǎo)致宮頸癌的二種不同機(jī)制。此外，通過(guò)對(duì)⑶Hl和PAXl基因甲基化的跟蹤檢測(cè)，可以作為判斷HPV感染到宮頸炎、再到宮頸增生及宮頸癌的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程的參考指標(biāo)。實(shí)施例2試劑盒的制備制備一宮頸癌檢測(cè)試劑盒，它含有甲基化特異性限制性?xún)?nèi)切酶HpaII、BstuI和HhaI各200單位，并且含有特異性引物對(duì)各100微升，所述各引物對(duì)就是表1中各引物SEQIDN0:l-8。該試劑盒還含有使用說(shuō)明書(shū)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表<110>上海市第八人民醫(yī)院<120>一種利用PAXl和⑶Hl基因甲基化檢測(cè)宮頸癌的方法和試劑盒<130)091180<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>1gtgggcgggtcgttagtttc20<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>2ctcacaaatactttacaattccgacg26<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>3ggtgggtgggttgttagttttgt23<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>4aactcacaaatctttacaattccaac26<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>5tattttgggtttggggtcgc20<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>6cccgaaaaccgaaaaccg18<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>7gtttattttgggtttggggttgtg24<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>8cacccaaaaaccaaaaaccac2權(quán)利要求一種可用于檢測(cè)宮頸癌的試劑盒，其特征在于，它含有(a)針對(duì)POX1基因和CDH1基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對(duì)；或含有(b)甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶，以及針對(duì)POX1基因和CDH1基因的特異性引物對(duì)。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，它還包括陽(yáng)性對(duì)照和/或陰性對(duì)照。3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還含有非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的試劑。4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的特異性引物對(duì)通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出擴(kuò)增產(chǎn)物含有啟動(dòng)子區(qū)的CpG島。5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的針對(duì)CDHl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對(duì)如下(i)CDHl甲基化引物對(duì)GTGGGCGGGTCGTTAGTTTC,SEQIDNO1禾口CTCACAAATACTTTACAATTCCGACG,SEQIDNO2；(ii)CDHl甲基化引物對(duì)GGTGGGTGGGTTGTTAGTTTTGT,SEQIDNO3禾口AACTCACAAATCTTTACAATTCCAAC,SEQIDNO:4。6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的針對(duì)POXl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對(duì)如下(iii)擴(kuò)增PAXl基因的甲基化引物對(duì)TATTTTGGGTTTGGGGTCGC,SEQIDNO5CCCGAAAACCGAAAACCG,SEQIDNO6；(iv)擴(kuò)增PAXl基因的甲基化引物對(duì)GTTTATTTTGGGTTTGGGGTTGTG,SEQIDNO7CACCCAAAAACCAAAAACCAC,SEQIDNO:8。7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶選自HpaII、BstuI禾口HhaI。8.一種引物集的用途，所述的引物集包括(a)針對(duì)POXl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對(duì)和(b)針對(duì)CDHl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對(duì)，其特征在于，所述的引物集被用于制備檢測(cè)宮頸癌或?qū)m頸上皮內(nèi)瘤樣病變的試劑盒。9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的引物集還被用于制備區(qū)別宮頸癌與宮頸炎的試劑盒。10.一種基因集的用途，所述的基因集包括(a)POXl基因和(b)⑶Hl基因，其特征在于，所述的基因集被用于制備檢測(cè)宮頸癌或?qū)m頸上皮內(nèi)瘤樣病變的試劑或試劑盒。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用PAX1和CDH1基因甲基化檢測(cè)宮頸癌的方法和試劑盒。具體地，本發(fā)明提供了一種試劑盒，它含有(a)針對(duì)POX1基因和CDH1基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對(duì)；或含有(b)甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶，以及針對(duì)POX1基因和CDH1基因的特異性引物對(duì)。本發(fā)明的試劑盒可有效地將宮頸癌與宮頸炎、HPV感染區(qū)分開(kāi)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101831490SQ200910047419公開(kāi)日2010年9月15日申請(qǐng)日期2009年3月12日優(yōu)先權(quán)日2009年3月12日發(fā)明者徐軍,王紅琳申請(qǐng)人:上海市第八人民醫(yī)院