專利名稱：抗趨化因子4單克隆抗體、雜交瘤細胞系及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術領域的抗體，具體是一種抗趨化因子4單克隆抗體、雜交瘤細胞系及應用。
背景技術：
目前，化療藥物是治療惡性腫瘤的主要方法之一。然而，化療藥物在抑制或殺傷腫瘤細胞的同時，對機體正常的組織或器官也有嚴重的毒副作用，其中腸黏膜損傷是抗癌藥物常見的劑量毒性反應和并發(fā)癥，臨床應用中化療病人的發(fā)病率達到50%_80%，癥狀包括惡心，嘔吐，厭食以及腹 寫等(Wadler S, Benson AB, 3rd, EngelkingC，Catalano Rj Field M，Kornblau SM，et al.Recommended guidelines forthetreatment ofchemotherapy-1nduced diarrhea.JClin Oncol.1998，16:3169—3178 ；Benson AB，3rd，Ajani JA，Catalano RB，Engelking C，Kornblau SM，Martenson JAj Jr., etal.Recommended guidelines for the treatment of cancer treatment-1nduceddiarrhea.2004，J Clin 0ncol22:2918-2926)。這些嚴重的副作用不僅大大地阻礙了癌癥的化療療效，也是引起化療中止或者藥物劑量減少的主要原因，其中，以腹瀉為主要表現(xiàn)的腸黏膜損傷是化療藥物的主要毒副作用之一?，F(xiàn)在認為，化療藥物引起的腸黏膜損傷是一系列細胞生理反應的綜合結果，這些反應包括炎癥反應、細胞凋亡、細胞增殖能力降低以及直接的細胞毒性作用等(DanieleB，Secondulfo Mj De Vivo R，Pignata S，De Magistris L，Delrio P，et al.Effect ofchemotherapy with5-fluorouracil on intestinal ermeability and absorption inpatients with advanced colorectal cancer.J Clin Gastroenterol2001，32:228-230 ;Duncan M，Grant G.0ral and intestinal mucositis-causes and possible treatments.AlimentPharmacol Ther.2003，18:853-874 ；Bowen JMj Gibson RJj Cummins AG，KeefeDM.1ntestinal mucositis: the role of theBcl_2family，p53and caspases inchemotherapy-1nduced damage.Support Care Cancer2006，14:713-731)。其中，小腸隱窩上皮細胞的凋亡是化療所引起的腸黏膜損傷的主因之一(Anilkumar TV, SarrafCEj HuntT，Alison MR (1992).The nature of cytotoxic drug-1nduced cell death in murineintestinal crypts.Br J Cancer65:552—558 ;Pritchard DM, Potten CS，HickmanJA.The relationships between p53_dependent apoptosis，inhibition of proliferation，and5-fluorouraci1-1nduced histopathology in murine intestinalepithelia.Cancer Res.1998, 58:5453-5465 ；KeefeDM, Brealey J，Goland GJ，CumminsAG.Chemotherapy for cancer causes apoptosis that precedes hypoplasia in cryptsof the small intestine in humans.2000，Gut47:632-637 ;Inomata A, Horii I,SuzukiK.5-Fluorouraci1-1nduced intestinal toxicity:what determines the severityofdamage to murine intestinal crypt epithelia.ToxicolLett2002，133:231-240)。有研究表明使用化療藥物5-FU注射小鼠后，導致小腸隱窩細胞凋亡，且在化療后第一天最嚴重，而在這期間小腸組織的形態(tài)學差異并不大，這表明5-FU注射后24小時內啟動的凋亡在化療導致的腸黏膜炎中扮演了重要角色(Yasuda Mj Kato S，YamanakaN，Iimori M，Matsumoto K，Utsumi D，Kitahara Y，Amagase K，Horie S，TakeuchiK.Serotonin5_HT3receptor antagonists ameliorate 5_fluorouraciI— inducedintestinal mucositis by suppression of apoptosis in mice intestinal cryptcells.BrJPharmacol.20120ctl6.)。研究發(fā)現(xiàn)，這類細胞凋亡與趨化因子4及其受體的參與有密切關系。
血小板作為一類特殊并且豐富的趨化因子來源，已經被證實參與很多組織器官的炎癥以及損傷過程，其中包括胃腸道組織。目前，作為血小板中最豐富的趨化因子CXCL4在胃腸道損傷方面的研究還不是很清晰。趨化因子(chemokines)是一類能使細胞發(fā)生趨化運動的小分子細胞因子，分子量多在8 12KD之間，根據(jù)其N端所含的Γ2個半胱氨酸的位置，趨化因子可分為 CXC、CCλ C 及 C3XC 四個亞族(Oppenheim JJj Zachariae CO，Mukaida N，MatsushimaK:Properties of the novel proinflammatory supergene “intercrine，，cytokinefamily.Ann Rev Immunol, 1991，9:617 ；Rollins BJ:Chemokines.B10d1997，90:909)。趨化因子4 (PF4/CXCL4)，是一個肝素結合蛋白，存在于血小板a-顆粒致密體中，在血小板黏附、聚集、活化時，以蛋白多糖復合物的形式從血小板中釋放。趨化因子4既是巨核細胞成熟和血小板活化的標記物，同時也是從血小板中分離出的第一個趨化因子(Hannah AL.Kinases as drug discovery targets in hematologic malignancies.Curr Mol Med.2005，5 (7):625-42)。在結構上，人趨化因子4是對稱的，由四個相同的亞基組成四聚體(Grazia Gentilinij NancyE.Kirschbaumj James A.A μ gustine，RichardH.Aster, and Gian Paolo Visentin.1nhibition of Human Umbilical Vein EndothelialCell Proliferation by the CXC Chemokinej Platelet Factor4(PF4)，Is AssociatedWith Impaired Downregulation of p21Cipl/WAFl.Blood, Vol93，Nol，1999:pp25_33)。趨化因子4是趨化因子CXC亞族的一員。與大多數(shù)其他的趨化因子不同，趨化因子4還參與了許多重要的生物學事件，包括細胞凋亡、細胞分化、細胞增殖和細胞存活等。此夕卜，趨化因子4還支持造血干細胞的存活(Han ZCj Lu M，Li J，Defard M，Boval B，etal.Platelet factor4and other CXC chemokines support the survival of normalhematopoietic cells and reduce the chemosensitivity ofcells to cytotoxicagents.Bloodl997，89:2328-2335),抑制血管內皮細胞和成纖維細胞的增殖(WatsonJBj Getzler SB，Mosher DF Platelet factor4modulates the mitogenic activity ofbasic fibroblast growth factor.J Clin Invest.1994，94:261268)同時，還能抑制巨核細胞的生成(Han，Z.C.，Belluccij S.，Walzj A.，Baggiolinij Μ.，Caen, J.P.Negativeregulation of human megakaryocytopoiesis by human platelet factor4 (PF4)andconnective tissue-activating peptide (CTAP-1II).1nt.J.Cell Cion, e，1990，8，253 -259)等。最近有研究表明，趨化因子4在小腸組織的損傷中扮演了調節(jié)子的角色(LapchakpH, 1annouAj Rani P，Lieberman LA，et al.(2012)The role of plateletfactor4in local and remote tissue damage in a mouse model of mesentericischemia/reperfusioninjury.1ntroduction)。
趨化因子受體CXCR3在上皮細胞，內皮細胞和淋巴細胞中都存在著廣泛表達(ffuyts.A, Proost.P, Lenaerts.J.P, Ben-Baruch.A, Van Damme.J and Wang.J.M.Eur.J.Biochem.1998，255 (I)，67-73)，并且參與調節(jié)人體的各種病理生理反應。其生物學功能主要是提供一種與趨化因子配體相結合的位點，使配體和表達CXCR3受體的細胞結合，從而發(fā)揮生物學功倉泛(Colvin RA, Campanella GS, Sun J, et al.1ntracellular domains ofCXCR3that mediate CXCL9, CXCL10, and CXCLll function.JBiol Chem2004, 279:30219 -30227)。已有研究證實，在乳糜瀉疾病中，CXCR3在小鼠和人腸上皮細胞以及粘膜組織中的表達都有所升高(Karen Μ, Lammers, Ruliang Lu, Julie Brownley, Bao Lu, et al.GliadinInduces an Increase in Intestinal Permeability and Zonulin Release by Bindingto the Chemokine Receptor CXCR3.Gastroenterology2008，135:194 - 204)。因此，本領域需要研究能抑制化療毒副作用的物質，特別是能預防和治療化療導致的腸粘膜損傷的藥物。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，提出一種抗趨化因子4單克隆抗體、雜交瘤細胞系及應用，涉及用重組人源CXCL4蛋白免疫大鼠和將大鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，并對形成的雜交瘤細胞篩選兩個階段；本發(fā)明的另外一個目的是提供抗趨化因子4的單克隆抗體在拮抗化療所造成的小腸黏膜損傷等方面的用途。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:本發(fā)明涉及一種抗趨化因子4雜交瘤細胞系，所述的雜交瘤細胞16D6-3的保藏號為CCTCC N0.C2012186;于2012年11月29日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為:中國武漢武漢大學，430072。本發(fā)明涉及上 述雜交瘤細胞系的應用，將其用于制備抗趨化因子4單克隆抗體。所述的制備具體是指:a)擴增保藏號為CCTCC N0.C2012186的雜交瘤細胞16D6-3 ；b)腹腔注射小鼠；c)回收腹水并從腹水中分離抗趨化因子4單克隆抗體。所述的抗趨化因子4單克隆抗體，由輕鏈和重鏈構成，其中:輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重鏈的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。所述的重鏈的編碼基因選自如下序列之一:I)其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述的重鏈氨基酸的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述的重鏈氨基酸的DNA分子。所述的輕鏈的編碼基因選自如下序列之一:I)其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；II)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述的輕鏈氨基酸的DNA分子;III)與I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述的輕鏈氨基酸的DNA分子。本發(fā)明涉及一種重組載體，通過將如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的DNA分子進行克隆并與T4載體進行連接處理得到的重組載體。本發(fā)明涉及一種表達盒，包含上述核苷酸序列分別為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2的編碼基因。本發(fā)明涉及上述抗趨化因子4單克隆抗體在制備治療或預防腫瘤化療毒副作用的藥物、以及制備預防或治療化療哺乳動物小腸粘膜損傷的藥物中的應用。所述的藥物優(yōu)選包括上述單克隆抗體和藥學上可接受的載體和/或賦形劑的組合物。所述的哺乳動物優(yōu)選為人或小鼠。小腸黏膜損傷與修復是一個動態(tài)過程，有多種細胞因子共同參與，運用基因芯片技術，本發(fā)明對小腸黏膜再生過程中基因表達變化的規(guī)律進行了系統(tǒng)研究。結果表明，5-FU化療后相關細胞因子的變化趨勢可以分為3類:(I)表達基本沒有變化；(2)表達譜先上升后下降；(3)表達譜先下降后上升。根據(jù)本實驗室已有的造血基因芯片結果及其相關細胞因子在造血調控中的研究結果，本發(fā)明推測，與化療后小鼠的腸黏膜損傷修復調控相關的細胞因子的分泌，可能會呈現(xiàn)出表達水平先上升后下降的趨勢，而趨化因子4(CXCL4)與其受體CXCR3無論在基因水平還是蛋白質水平都符合這一趨勢，提示CXCL4與其受體CXCR3可能參與了腸黏膜損傷修復的調控過程。本發(fā)明以最貼近于臨床實際的化療小鼠模型為基礎，進行了少量Anti_CXCL4(抗趨化因子4)單克隆抗體防治化療小鼠腸黏膜炎的藥效和藥理機制研究。實驗結果證明在CXCR3激活的p38MAPK通路的參與下，Anti_CXCL4(抗趨化因子4)單克隆抗體通過中和CXCL4調控的p53與Bax的表達 ，防止了小腸隱窩細胞的凋亡，從而減輕了化療導致的腸粘膜損傷。本發(fā)明為Ant1-CXCL4 單克隆抗體成為防治腫瘤化療腸道毒副作用候選藥物，提供了充分的實驗依據(jù)。進一步，本發(fā)明需要制備和純化Anti_CXCL4單克隆抗體。本發(fā)明以純化的重組人CXCL4為抗原，與弗氏佐劑混合制成乳液，采取多點注射方式免疫SD大鼠。首次免疫后，每2周免疫一次，重復3次。分別用重組人CXCL4(rhcxcl4-his)和重組鼠CXCL4(rmcxcl4-his)做包被抗原，用ELISA方法檢測大鼠血清中的抗體滴度，待抗體滴度大于1: 20000后準備細胞融合。細胞融合前3天，用PBS溶液稀釋CXCL4抗原，加強免疫I次，免疫劑量為400 μ g，腹腔注射。取適量的免疫SD大鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞，在50%PEG4000的作用下進行細胞融合。在HAT選擇性培養(yǎng)基中篩選融合細胞。每天觀察雜交瘤細胞的生長情況，待其長至孔底面積約一半以上時吸出上清。以重組鼠CXCL4 (rmCXC14-his)做包被抗原，用ELISA方法檢測融合細胞的陽性率，篩選時，設SP2/0骨髓瘤細胞上清液為陰性對照，以帶有his標簽的CXCL4蛋白為陽性對照，去除his陽性雜交瘤干擾。發(fā)現(xiàn)OD值大于或等于陰性孔2.1倍的樣品即來自陽性孔，當陽性孔數(shù)量較多時，可選取其中部分OD值相對較高的孔用有限稀釋法進行克隆化篩分。經過3次克隆化篩分出穩(wěn)定分泌抗重組人和小鼠CXCL4單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并保存細胞株，將它命名為16D6-3。細胞株體外連續(xù)培養(yǎng)I個月，經ELISA方法檢測證明，抗體分泌能力穩(wěn)定。用該細胞株注射裸鼠收集腹水，樣品經過親和柱HiTrap protein G HP (GE Healthcare)分離，純化腹水中的抗體，SDS-PAGE電泳檢測抗體的純度達到98%(圖3D_a)，應用蛋白質印跡(Western blot)方法檢測單克隆抗體與重組人CXCL4蛋白的結合活性(圖3D_b)為陽性。用BIAcore檢測純化得到的單克隆抗體與重組人CXCL4的親和力，經Biaevaluation軟件分析數(shù)據(jù)，采用一對一 Langmuir結合模型計算結合率(km)和解離率(kf),發(fā)現(xiàn)分別為L 79X Kr6 (Ι/s)和 97.8 (1/ms)，平衡解離常數(shù)(Kd)計算為 1.83X 1(Γ8Μ (圖 3A)。本發(fā)明將ACHN細胞用10 μ g/mL-100 μ g/mL的重組人rhCXCL4蛋白孵育，72小時后MTT檢測發(fā)現(xiàn)rhCXCL4(IC5Q=72.6 μ g/mL)有效降低了 ACHN細胞的存活率，與文獻報道一致(圖3B)，而Ant1-CXCL4單克隆抗體則有效阻斷了 CXCL4 (72.6 μ g/mL)對ACHN細胞的生長抑制作用，并且呈現(xiàn)濃度依賴性(圖3C)。本發(fā)明從穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞中提取RNA，逆轉錄cDNA，通過PCR及序列分析獲得了該抗體序列，借助NCBI以及MGT等網(wǎng)站對結果加以分析，并對抗體的重鏈、輕鏈進行比對和分區(qū)。結果證實，Ant1-CXCL4單克隆抗體的DNA 序列(SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2)以及氨基酸序列(SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4)符合典型的大鼠IgG序列特征(圖1)。實驗結果充分說明了 16D6-3細胞株分泌的Anti_CXCL4單克隆抗體能夠有效地中和(或抑制)CXCL4的生物學功能，防止細胞凋亡，從而有可能將該單克隆抗體用于治療化療藥物(如5-FU)所引起的腸黏膜損傷等毒副效應。以腹瀉為主要表現(xiàn)的腸黏膜損傷是化療藥物的主要毒副作用之一，研究發(fā)現(xiàn)預防性使用Ant1-CXCL4單克隆抗體通過拮抗化療損傷初期表達上調的CXCL4，有效推遲了化療后小鼠腹瀉的發(fā)生時間以及減輕了腹瀉的嚴重程度，并且大大提高小鼠對高劑量化療藥物的耐受性。雖然化療導致腸黏膜炎的機制尚未完全研究清楚，但初步認定這一過程涉及一系列細胞生理變化，包括炎癥浸潤，細胞凋亡，細胞增殖能力降低，以及細胞毒性等(Daniele B,Secondulfo M, De Vivo R, Pignata S，De MagistrisLjDelrio P，et al.Eff ect of chemotherapy with5_fluorouraciI on intestinalpermeability and absorption inpatients with advanced colorectal cancer.J Clin Gastroenterol.2001，32:228-230.；Duncan Mj Grant G.0ral andintestinal mucositis-causes and possible treatments.Aliment PharmacolTher2003, 18:853-874 ；Bowen JMj Gibson RJjGummins AG,Keefe DM.1ntestinalmucositis: the role of theBcl_2family，p53and caspases in chemotherapy-1nduceddamage.Support Care Cancer.2006，14:713-731)。而小腸隱窩上皮細胞的凋亡是化療導致腸粘膜損傷的主因之一((Anilkumar TV, SarrafCEj Hunt Tj Alison MR(1992).Thenature of cytotoxic drug-1nduced cell death in murine intestinal crypts.Br JCancer65:552—558 ;Pritchard DM, Potten CS，Hickman JA.The relationships betweenp53_dependent apoptosis,inhibition of proliferation, and5-fluorouracil-1nduced histopathology in murine intestinal epithelia.Cancer Res.1998，58:5453—5465 ;KeefeDMjBrealey J，Goland GJj Cummins AG.Chemotherapy for cancer causesapoptosis that precedes hypoplasia in crypts of the small intestine inhumans.2000, Gut47:632-637 ；Inomata A，Horii I,Suzuki K.5-Fluorouracil-1nducedintestinal toxicity:what determines the severity ofdamage to murine intestinalcrypt 印ithelia.ToxicolLett2002, 133:231-240)。有研究表明 5-FU 化療導致的小腸隱窩細胞凋亡在化療后第一天最嚴重，在這期間小腸組織的形態(tài)學差異并不大，這說明5-FU注射后24小時內啟動的凋亡在化療導致的腸黏膜炎中扮演了重要角色。因此推斷Ant1-CXCL4單克隆抗體對腸粘膜損傷的保護機制與減少化療后小腸隱窩細胞的凋亡相關。通過對C57BL/6野生型與CXCR3-/-小鼠預防性使用Anti_CXCL4單克隆抗體，本發(fā)明證實了在CXCR3的介導下，抗體通過拮抗化療后小鼠小腸組織中CXCL4的高表達，有效地減少了小腸隱窩中凋亡細胞的比例，保護了腸粘膜的損傷。Ant1-CXCL4單克隆抗體不僅有效減輕了化療所致的小鼠腸粘膜損傷，并且這種保護作用是由CXCR3受體介導的，是以一種p53依賴機制防止小腸隱窩上皮細胞的凋亡來實現(xiàn)的。同時，本發(fā)明的研究還表明P38信號通路也參與到這一保護機制中。研究還發(fā)現(xiàn)預防性使用Anti_CXCL4單克隆抗體通過拮抗化療損傷初期表達上調的CXCL4，有效推遲了化療后小鼠腹瀉的發(fā)生時間以及減輕了腹瀉的嚴重程度，并且大大提高小鼠對高劑量化療藥物的耐受性。推斷Ant1-CXCL4單克隆抗體對腸粘膜損傷的保護機制與減少化療后小腸隱窩細胞的凋亡相關。通過對C57BL/6野生型與CXCR3-/-基因敲除小鼠預防性地使用Ant1-CXCL4單克隆抗體，本發(fā)明的確證實了在CXCR3的介導下，抗體通過拮抗化療后小鼠小腸組織中的CXCL4的表達水平，有效地減少了小腸隱窩中凋亡細胞的比例，從而防止了腸粘膜的損傷。


圖1為小鼠化療后不同時間大腸和小腸組織中CXCL4和CXCR3蛋白質和基因表達水平的變化
圖中:A為對小鼠一次性腹腔注射5_FU(250mg/kg)，化療后第0、1、2、3、5、7天分別取小鼠的小腸與大腸組織進行檢測，CXCL4在mRNA水平的基因芯片結果顯示CXCL4在mRNA水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且在1.5d達到最高峰。(n=3)B為Elisa檢測小鼠化療后大腸與小腸組織中CXCL4的表達變化圖；化療后第5天CXCL4在大腸與小腸中的表達量達到最高值，分別比正常表達量提高了 2.25和2.02倍。(n=3)C為RT-PCR檢測小鼠化療后大腸與小腸組織中CXCL4在基因水平的表達變化圖；化療后第2天CXCL4在大腸與小腸中的表達量達到最高值，分別比正常表達量提高了 5.52和 24.72 倍。(n=3)D為RT-PCR檢測小鼠化療后大腸與小腸組織中CXCR3在基因水平的表達變化圖；化療后第3天CXCR3在大腸與小腸中的表達量達到最高值，分別比正常表達量提高了 5.17和 1.48 倍。(η=3) (*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.0lvs 第 O 天)。圖2為使用免疫組化方法對CXCR3在小鼠小腸隱窩中的表達定位圖。圖中:一次性注射5-FU (250mg/kg)后免疫組化方法分別對第0，3，5，7天CXCR3在小鼠小腸隱窩中的表達定位(400X)。圖3為Anti_CXCL4單克隆抗體特性的鑒定示意圖；圖中:A為BIAcore方法分析Anti_CXCL4單克隆抗體的親和力。用一對一的朗格繆爾結合模型計算結合率(k on)和解離率(k off)。平衡解離常數(shù)(k d)為k on與k off的比值為趨化因子4對ACHN細胞的影響圖，其中:趨化因子4對ACHN細胞存在生長抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性；C為Ant1-CXCL4單克隆抗體拮抗了趨化因子4 (72.6 μ g/mL)對ACHN細胞的抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性；D為SDS/PAGE (8%) (a)與Western blotting (b)方法分析純化的Ant1-CXCL4單克隆抗體。實驗結果用平均值土SD表示。林P〈0.0lversus anti_CXCL4mAb ofO。對照組代表未經趨化因子4以及單抗處理的ACHN細胞。圖4為Ant1-CXCL4單克隆抗體降低5-FU化療導致的小鼠腹瀉以及小鼠的死亡率比較示意圖；圖中:A為5-FU (250mg/kg)化療前2小時，實驗組BALB/c小鼠腹腔注射Ant1-CXCL4單克隆抗體(lm g/kg)，對照組注射同體積生理鹽水，觀察小鼠腹瀉程度。(n=10)；B為5-FU(400mg/kg)化療前2小時，實驗組C57/BL6小鼠腹腔注射Anti_CXCL4單克隆抗體(lmg/kg)，對照組注射同體積生理鹽水，觀察小鼠死亡情況。(n=10)其中:實驗結果以平均值土 SE表示。*Ρ〈0.05, #Ρ〈0.01。圖5為預防性使用Anti_CXCL4單克隆抗體防止5_FU化療導致的小腸隱窩上皮細胞凋亡的作用圖；圖中:A為Tunel方法檢測生理鹽水，5_FU化療以及抗體處理后野生型小鼠與CXCR3敲除小鼠小腸隱窩細胞的凋亡情況。(n=3)；B為凋亡指數(shù)統(tǒng)計:隨機選取3個視野，每個視野計算10個隱窩的Tunel陽性細胞個數(shù)。(n=3)C為Western blots方法檢測生理鹽水，5_FU化療以及抗體處理后野生型小鼠與CXCR3敲除小鼠小腸，組織中p53和Bax的表達情況。光密度測定法對各組p53和Bax的表達變化進行統(tǒng)計。(n=3)其中:實驗結果以平均值土SD表示。*Ρ〈0.05, #Ρ〈0.01。圖6為趨化因子4誘導小腸上皮細胞(IEC-6)的凋亡伴隨ρ53和Bax表達的上調圖；圖中:A為Tunel方法檢測不同濃度趨化因子4 (a:0，b: 5 μ g/mL, c: 10 μ g/mL, d:20 μ g/mL)處理24小時后對IEC-6細胞的促凋亡作用。(箭頭指向凋亡小體)；B為MTT檢測不同濃度趨化因子4對IEC-6細胞增殖的影響；C為Western blots檢測IEC-6細胞中p53和Bax在趨化因子4 (10 μ g/mL)刺激后，不同時間點的表達變化；D為Western blots檢測IEC-6細胞中caspases3,8,9的剪切形式。分別在趨化因子4 (10 μ g/mL)孵育O, 6，12，24小時后收集IEC-6細胞。β -actin設立為參比對照；其中:實驗結果以平均值土SD表示。*Ρ〈0.05, #Ρ〈0.01。圖7為CXCL4通過調控CXCR3介導的ρ38ΜΑΡΚ與ERK通路，誘導IEC-6細胞的凋亡示意圖；圖中:Western blots 檢測 IEC-6 細胞中 phospho_p38, p38, phospho-Erk 和 Erk的表達變化。分別在趨化因子4 (10 μ g/mL)孵育0h，6h, 12h, 24h小時后收集IEC-6細胞。β -actin設立為參比對照。圖8為Anti_CXCL4單克隆抗體降低放療導致的小鼠腹瀉以及小鼠的死亡率示意圖；圖中:A為輻照(8Gy)前I小時，實驗組BALB/c小鼠腹腔注射Anti_CXCL4單克隆抗體(lmg/kg)，對照組注射同體積生理鹽水，觀察小鼠腹瀉程度。(n=10);B為輻照(8Gy)前I小時，實驗組BALB/c小鼠腹腔注射Anti_CXCL4單克隆抗體(lmg/kg)，對照組注射同體積生理鹽水，觀察小鼠死亡情況。(n=10)；圖中:實驗結果以平均值土SE表示。*Ρ〈0.05，#Ρ〈0.01。圖9為Anti_CXCL4單克隆抗體降低環(huán)磷酰胺化療導致的小鼠腹瀉以及小鼠的死亡率示意圖；圖中:A為環(huán)磷酰胺(450mg/kg)化療前2小時，實驗組BALB/c小鼠腹腔注射Ant1-CXCL4單克隆抗體(lmg/kg)，對照組注射同體積生理鹽水，觀察小鼠死亡情況。(n=10)；B為環(huán)磷酰胺(500mg/kg)化療前2小時，實驗組BALB/c小鼠腹腔注射Ant 1-CXCL4單克隆抗體(lmg/kg)，對照組注射同體積生理鹽水，觀察小鼠死亡情況。(n=10)
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例1重組人抗趨化因子4 (rhcxcl4_his)和重組鼠抗趨化因子4 (rmcxcl4_his)的制備一.基因序列:rhcxcl4-his:NM_002619.3rmcxcl4-his:NM_019932.4二.純化工藝流程簡介:破菌緩沖液重懸菌體一破菌一親和層析一變性一復性一陽離子交換層析三.純化過程:一) rhcxcl4-his 的純化:取發(fā)酵菌體20g，按照IOmL破菌緩沖液:lg菌體的比例加入IX中文(his-tagbinding buffer)在冰上懸浮菌體；分別用500，700, 800bar高壓勻漿破菌；破菌液經過4°C, IOOOOrpm離心30min,取上清棄沉淀,上清留樣lmL,4°C保存；純水清洗IOmL親和層析柱3-5CV，去除20%乙醇，流速2mL/min ；IX 組氨酸標簽電荷緩沖液(his-tag charge buffer)洗 3-5CV,流速 2mL/min ;IX 組氨酸標簽結合緩沖液 his-tag binding buffer 洗 3-5CV,流速 2mL/min ;上樣，流速 2mL/min ;
I Xhis-tag binding buffer 洗 2CV,流速 2mL/min ;IX組氨酸標簽洗漆緩沖液(his-tag wash buffer)洗3-5CV直至洗脫峰回到基線，收集洗脫峰取ImL留樣；IX組氨酸標簽洗脫緩沖液(his-tag elutionbuffer)洗脫，收集洗脫峰即為目的蛋白；收集到的蛋白溶液加入8M尿素邊加邊攪拌，再加入終濃度為IOmM的DTT，室溫攪拌Ih ；按照變性液:復性液為1: 10的比例加入復性液，4-10°C條件下Ih內加完，邊加邊攪拌，放置過夜；第二天復性液調節(jié)pH值為7.0上SP柱；SP陽離子交換層析步驟(20mL SP sephrose FF):純水洗3-5CV，去除20%乙醇；Wash buffer 平衡柱子 5CV, 3mL/min 流速；
上樣，3mL/min流速；Wash buffer 洗柱子 5CV, 3mL/min 流速；Elution buffer 洗脫，0-100%B (即 NaCl 濃度 0-1M)，40min 洗脫完畢，收集洗脫峰，25mL，4-10°C保存；樣品用0.22um過濾后取樣檢測蛋白濃度，SDS-PAGE ；樣品用PEG20000濃縮約5倍后重新檢測蛋白濃度，內毒素及SDS-PAGE檢測合格的樣品于超凈臺0.22um過濾后分裝于無熱源EP管中，低溫保存。二)rmcxcl4_his 的純化:1.搖瓶菌體7g解凍,按照IOmL連接緩沖液(binding buffer)(不含鹽酸胍):lg菌體充分懸浮(冰浴中操作)，分別用500，700，800bar高壓勻漿破菌，破菌液0D600值< 1，菌液經過IOOOOrpmX30min取上清，沉淀_20°C凍存，上清留樣lmL，4°C保存；2.50%硫酸銨進行鹽析，冰浴沉淀Ih，取沉淀棄上清；3.上述硫酸銨沉淀與變性液比例為1:10變性(室溫攪拌2小時)，肉眼觀測樣品乳光是否嚴重，若乳光嚴重IOOOOrpmX 15min離心；4.變性后的樣品參考rhcxcl4親和純化方案親和層析；5.收集到的樣品4 C保存；6.第二天將樣品按照與復性液比例為1:10體積進行稀釋復性，一小時內完成，復性后樣品加入終濃度為0.2%亞硫酸納；7.復性后的樣品進行SP層析，收集洗脫峰(0.SMNaCl洗脫)，4°C保存。
實施例2抗人和小鼠趨化因子4 (CXCL4)單克隆抗體的制備1.實驗材料1.1試劑:RPMI1640培養(yǎng)液購自invitrogen,血清購自hyclone,弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，HT和HAR購自Sigma公司，培養(yǎng)板為Corning公司產品，HRP標記的羊抗大鼠二抗購自Jackson公司，免疫用rhcxcl4_his和rmcxcl4_his均為本實驗室生產。1.2細胞株及實驗小鼠:人骨髓瘤細胞系SP2/0用含10%FBS的1640培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)，SD大鼠，10-12周，雄性，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。2.實驗方法2.1SD大鼠免疫:選取3只雄性SD大鼠，將rhCXC14-his抗原與等體積弗氏完全佐劑混合，乳化完全后皮下多點注射，每只大鼠的免疫劑量為200 μ g，首次免疫后每2周免疫一次，將rhcxcl4-his抗原與等體積弗氏不完全佐劑混合,乳化完全后皮下多點注射，重復3次后,分別用rhcxcl4-his和rmcxcl4-his做包被抗原，ELISA檢測大鼠血清滴度,待滴度大于1: 20000可以準備融合。融合前3天加強免疫I次，PBS稀釋抗原，免疫劑量為400 μ g，腹腔注射。2.2抗人和大鼠趨化因子4 (CXCL4)單克隆抗體的制備:取免疫SD大鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞在50%PEG4000的作用下進行細胞融合。在HAT選擇性培養(yǎng)基中進行篩選，每天觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積約一半以上時吸出上清，分別用rmcxcl4-his和rhcxcl4_his做包被抗原，ELISA法檢測融合細胞的陽性率，同時設SP2/0骨髓瘤細胞上清液作為陰性對照。篩選時增加有帶有his標簽的CXCL14蛋白作為對照，去除his陽性雜交瘤干擾。OD值大于或等于陰性孔的2.1倍即為陽性孔，當陽性孔數(shù)量較多時，可選取其中部分OD值相對較高的孔用有限稀釋法進行克隆化。經過3次克隆化篩出一株穩(wěn)定分泌抗CXCL4單克隆的雜交瘤細胞株16D6-3 (保藏號CCTCC NO: 2012186)，將該雜交瘤細胞系擴大培養(yǎng)并凍存保種。
實施例3單克隆抗體理化性質的鑒定本發(fā)明制備了具有中和人源以及鼠源CXCL4蛋白能力的Anti_CXCL4單克隆抗體，并對其進行分離純化，抗體特性的鑒定，以及生物學活性檢測。以純化的重組人CXCL4免疫SD大鼠，經細胞融合以及3次克隆化得到了一株分泌抗重組人和小鼠CXCL4單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為16D6-3。細胞株體外連續(xù)培養(yǎng)I個月，經ELISA方法檢測證明，抗體分泌能力穩(wěn)定。用該細胞株注射裸鼠收集腹水，親和柱HiTrap protein G HP (GE Healthcare)純化腹水中的抗體，SDS-PAGE檢測抗體純度達到98%(圖3D-a)，并用Western blot方法檢測單克隆抗體與重組人CXCL4蛋白的結合活性(圖3D-b)。用BIAcore檢測純化得到的單克隆抗體與重組人CXCL4的親和力，經Biaevaluation分析軟件處理數(shù)據(jù),采用一對一Langmuir結合模型計算結合率(km)和解離率(kj分別為1.79X10_6(l/s)和97.8 (I/ms)，平衡解離常數(shù)(Kd)為L83X10—8 M (圖4A)。根據(jù)文獻報道本發(fā)明將ACHN細胞用10 μ g/mL-100 μ g/mL的rhCXCL4蛋白孵育，72小時后MTT檢測發(fā)現(xiàn)rhCXCL4(IC50=72.6μ g/mL)有效抑制了 ACHN細胞的生存率，與文獻 艮道——致(圖 4Β) (Lasagni L, Francalanci M, Annunziato F，Lazzeri E, GianniniS，Cosmi Lj et al.An alternatively spliced variant of CXCR3mediates theinhibition of endothelial cell growth induced by IP—10，Mig，and 1-TACj and actsas functional receptor for platelet factor4.J Exp Med.2003，197(11):1537-49)，而Ant1-CXCL4單克隆抗體有效阻斷了 CXCL4(72.6 μ g/mL)對ACHN細胞的生長抑制作用，并且呈現(xiàn)濃度依賴性。本發(fā)明從穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞中提取RNA，逆轉錄cDNA，通過PCR等方法獲得了該抗體序 列，經NCBI以及頂GT等網(wǎng)站對結果加以分析，并對抗體的重鏈、輕鏈進行比對和分區(qū)。結果也證實，ant1-CXCL4單克隆抗體符合典型大鼠IgG序列特征(圖I)。重鏈由重鏈可變區(qū)(VH)、重鏈恒定區(qū)I (CHl)、鉸鏈區(qū)、重鏈恒定區(qū)2 (CH2)和重鏈恒定區(qū)3 (CH3)組成。以下為Ant1-CXCL4單克隆抗體DNA與氨基酸序列的分析。

VL:
權利要求
1.一種抗趨化因子4雜交瘤細胞系，其特征在于，該雜交瘤細胞16D6-3的保藏號為CCTCC N0.C2012186 ;于2012年11月29日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
2.根據(jù)權利要求1所述雜交瘤細胞系的應用，將其用于制備抗趨化因子4單克隆抗體。
3.根據(jù)權利要求2所述雜交瘤細胞系的應用，所述的制備具體是指: a)擴增保藏號為CCTCCN0.C2012186的雜交瘤細胞16D6-3 ； b)腹腔注射小鼠； c)回收腹水并從腹水中分離抗趨化因子4單克隆抗體。
4.一種抗趨化因子4單克隆抗體，其特征在于，根據(jù)權利要求2或3所述制備得到。
5.根據(jù)權利要求4所述的單克隆抗體，其特征是，該單克隆抗體由輕鏈和重鏈構成，其中:輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重鏈的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
6.根據(jù)權利要求5所述的單克隆抗體，其特征是，所述的重鏈的編碼基因選自如下序列之一: 1)其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述的重鏈氨基酸的DNA分子； 3)與I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述的重鏈氨基酸的DNA分子。
所述的輕鏈的編碼基因選自如下序列之一: I)其核苷酸序列如SEQID NO:1所示； II)在嚴格條件下與I)限定的`DNA序列雜交且編碼所述的輕鏈氨基酸的DNA分子； III)與I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述的輕鏈氨基酸的DNA分子。
7.一種重組載體，其特征在于，通過將如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的DNA分子進行克隆并與T4載體進行連接處理得到的重組載體。
8.一種表達盒，其特征在于，包含核苷酸序列分別為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2的編碼基因。
9.一種權利要求2至6中任意所述抗趨化因子4單克隆抗體在制備治療或預防腫瘤化療毒副作用的藥物中的應用。
10.根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征是，所述的藥物包括上述單克隆抗體和藥學上可接受的載體和/或賦形劑的組合物。
11.一種權利要求2至6中任意所述抗趨化因子4單克隆抗體在制備預防或治療化療哺乳動物小腸粘膜損傷的藥物中的應用。
12.根據(jù)權利要求11所述的應用，其特征是，所述的藥物包括上述單克隆抗體和藥學上可接受的載體和/或賦形劑的組合物。
13.根據(jù)權利要求11所述的應用，其特征是，所述的哺乳動物為人或小鼠。
全文摘要
一種生物技術領域的抗趨化因子4單克隆抗體、雜交瘤細胞系及應用，涉及用重組人源CXCL4蛋白免疫大鼠和將大鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，并對形成的雜交瘤細胞篩選兩個階段；本發(fā)明的另外一個目的是提供抗趨化因子4的單克隆抗體在拮抗化療所造成的小腸黏膜損傷等方面的用途。本發(fā)明單克隆抗體能抗人趨化因子4和抗鼠趨化因子4，具備預防和治療腫瘤化療毒副作用的效果。
文檔編號C12N15/63GK103173419SQ201310066089
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月1日 優(yōu)先權日2013年3月1日
發(fā)明者韓偉, 俞雁, 高婧 申請人:上海交通大學