專利名稱：塔賓曲霉szx-6及其發(fā)酵液和發(fā)酵液提取物與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種塔賓曲霉(Aspergillus
本發(fā)明還涉及該菌株的發(fā)酵液以及發(fā)酵液的提取物，本發(fā)明還涉及該發(fā)酵液以及發(fā)酵液提取物的用途。
背景技術(shù)：
自從上世紀(jì)50年代Newton等從海洋真菌Cephalosporium acremonium的發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)抗菌化合物cephalosporin C以來,海洋微生物抗菌活性物質(zhì)的研究日益成為藥物研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。海洋真菌迥異于陸生真菌的獨(dú)特生存環(huán)境(如寡營養(yǎng)、高鹽、弱堿性等)使海洋真菌形成特殊的代謝和防御體系，從而能夠產(chǎn)生不同于陸生真菌的結(jié)構(gòu)特異和活性優(yōu)良的次生代謝產(chǎn)物。到目前為止，已從海洋真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了一千多種新的次生代謝產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)類型涉及生物堿、聚酮、大環(huán)內(nèi)脂和萜類等，這些代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)出良好的抗菌、抗腫瘤、抗病毒等生物活性。近十幾年來，我國水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，水產(chǎn)品產(chǎn)量居世界首位，但也不斷出現(xiàn)各種動物疾病。獲弧菌(Vibrio <3/ 講/77<3/ )、副溶血弧菌{Vibrio parahaemolyti cus) >嗜水氣單胞菌(Aoromorms、哈維氏弧菌{Vibrio harveyi)和霍亂弧菌{Vibrio cholerae)等是引起養(yǎng)殖動物疾病的主要病原細(xì)菌。水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗菌藥物的長期使用或?yàn)E用所引起的致病菌耐藥性、高殘留和環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重。因此，開發(fā)新的高效、廣譜和低污的水用抗生素具有重要的意義
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的塔賓曲霉SZX-6菌株。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供上述塔賓曲霉SZX-6菌株的發(fā)酵液及發(fā)酵液提取物。本發(fā)明所要解決的再一個技術(shù)問題是提供上述塔賓曲霉SZX-6菌株的發(fā)酵液及其提取物的用途。本發(fā)明是一種塔賓曲霉QAspergi I Ius tubingensis ) SZX-6 CCTCC NO:M2012540。本發(fā)明所涉及的菌株塔賓曲霉tubingensis ) SZX-6,已于2012年12月20日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC NO:M 2012540，保藏地址:中國武漢市武漢大學(xué)，電話027-68754052。本發(fā)明還公開了一種塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液，其特點(diǎn)是，該發(fā)酵液以所述的塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵獲得，發(fā)酵方法為:將塔賓曲霉SZX-6菌種接種到海水沙氏液體培養(yǎng)基中，160 r/min, 28°C培養(yǎng)7 d，獲得塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵產(chǎn)物，濾除菌絲體后獲得發(fā)酵液；所述的海水沙氏液體培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、陳海水定容。本發(fā)明還公開了一種塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液提取物，其特點(diǎn)是，該提取物以上述技術(shù)方案所述的塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液為原料，依次用等體積乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，得到乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物或者萃余物。本發(fā)明所述的塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液或者塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液提取物具有顯著的抑菌用途，其可以抑制的菌為鰻弧菌{Vibrio、副溶血弧菌{Vibrioparahaemolyti cus)、嗜水氣單胞菌(Afsronioims hydrophila)、哈維氏弧菌{Vibrioharveyi)和霍亂弧菌(Yibrio cholerae)。本發(fā)明所述的塔賓曲霉SZX-6是從海水養(yǎng)殖動物三疣梭子蟹共附生微生物中分離得到。其分離純化方法為:將三疣梭子蟹用無菌剪子剪碎，加入無菌水制成懸液，取0.1mL均勻涂布沙氏固態(tài)培養(yǎng)基中，28°C恒溫箱培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取菌落劃線純化。所述沙氏固態(tài)培養(yǎng)基是將4% (W/V)葡萄糖、1% (W/V)蛋白胨和2% (W/V)瓊脂加熱溶解后，力口陳海水定容，在121°C滅菌20 min后獲得。本發(fā)明塔賓曲霉SZX-6的生物學(xué)形態(tài)描述為:在海水沙氏培養(yǎng)基上生長迅速，28°C培養(yǎng)7天，菌落直徑可達(dá)65-70 mm，質(zhì)地絨毛狀，菌絲初生時(shí)為白色，漸變?yōu)樽?、黑色，無滲出液，反面黃褐色，如圖1所示；在光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下觀察，菌絲有橫隔，分生孢子頭呈球形，褐黑色；頂囊膨大，頂囊上放射狀密生著兩輪小柄；分生孢子柄無色透明；分生孢子呈橢圓形，褐黑色，表面不光滑，有小刺，串生，如圖2、3所示。本發(fā)明所述的塔賓曲霉SZX-6的遺傳性特征如下:屬海洋真菌,其ITS序列已在Genbank登錄,登錄號為JX287371。該序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(Genbank http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/) BLAST比對結(jié)果顯示,該序列與曲霉屬真菌(Aspergillus sp.)的ITS序列具有很高的同源性， 其中與菌株tubingensis A1KA> A.tubingensis wxm77(序列號分別為AM745112214443.1和HM037959)的ITS序列同源性為99%，在以N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為同一簇群。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的塔賓曲霉SZX-6菌株的發(fā)酵液、發(fā)酵液的提取物均具有抗菌活性的特征。因此，其發(fā)酵液、發(fā)酵液的提取物可用于抗菌藥物，或可用于提取分離具有抗菌活性的化合物來開發(fā)抗菌藥物。


圖1為塔賓曲霉SZX-6菌株的菌落形態(tài) 圖2為塔賓曲霉SZX-6菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu) 圖3為塔賓曲霉SZX-6菌株的分生孢子 圖4為塔賓曲霉SZX-6菌株的發(fā)酵液和發(fā)酵液提取物對主要水產(chǎn)病原菌的抑制活性圖。
具體實(shí)施例方式以下進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對其權(quán)利的限制。實(shí)施例1，一種塔賓曲霉 QAspergiIIus tubingensis ) SZX-6 CCTCC NO:M2012540。實(shí)施例2，一種塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液，該發(fā)酵液以實(shí)施例1所述的塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵獲得，發(fā)酵方法為:將塔賓曲霉SZX-6菌種接種到海水沙氏液體培養(yǎng)基中，160r/min, 28°C培養(yǎng)7 d，獲得塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵產(chǎn)物，濾除菌絲體后獲得發(fā)酵液；所述的海水沙氏液體培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、陳海水定容。實(shí)施例3，一種塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液提取物，該提取物以實(shí)施例2所述的塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液為原料，依次用等體積乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，得到乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物或者萃余物。實(shí)施例4，實(shí)施例2所述的塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液以及實(shí)施例3所述的塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液提取物的抗菌實(shí)驗(yàn)。1.抗菌活性指示菌液制備:將鰻弧菌{Vibrio anguillarum )、副溶血弧菌{Vibrioparahaemolyti cus)、嗜水氣單胞菌(Afsronioims hydrophila)、哈維氏弧菌{Vibrioharveyi)和霍亂弧菌{Vibrio cholerae)分別以無菌水制成孢子懸液(IO7個/mL)。將孢子懸液按5%接種量接種到已滅菌的內(nèi)含200 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于溫度37°C、轉(zhuǎn)速160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，振蕩培養(yǎng)I天，獲得指示菌液。2.抑菌活性測試:將 熔化后冷卻至45_50°C的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基倒入90.00 mm平板中，每板倒20 mL左右，放置冷卻至凝固。分別于每個平板上涂抹100 μ L指示菌液，放置30 min。然后在平板上放好牛津杯，將100 μ L發(fā)酵液或發(fā)酵液提取物加入孔中。37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，活性大小以抑菌圈直徑(mm)表不。結(jié)果見圖4。實(shí)驗(yàn)表明:塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液及發(fā)酵液提取物(乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余物)對5種主要水產(chǎn)病原菌鰻弧菌、Vibrioanguillarum)、Vibrioparahaemolyti cus)、嗜水氣單胞菌(Afsronioims hydrophila)、哈維氏弧菌{Vibrioharveyi)和霍亂弧菌(Jibrio cholerae)均具有顯著的抑制活性,按抑菌活性大小排序?yàn)榘l(fā)酵液 > 萃余物 > 乙酸乙酯萃取物 > 正丁醇萃取物。因此，塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液、發(fā)酵液的提取物可用于抗菌藥物，或可用于提取分離具有抗菌活性的化合物來開發(fā)抗菌藥物。
權(quán)利要求
1.一種塔賓曲霉tubingensis) SZX-6 CCTCC NO:M 2012540。
2.一種塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液，其特征在于，該發(fā)酵液以權(quán)利要求1所述的塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵獲得，發(fā)酵方法為:將塔賓曲霉SZX-6菌種接種到海水沙氏液體培養(yǎng)基中，160r/min, 28°C培養(yǎng)7 d，獲得塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵產(chǎn)物，濾除菌絲體后獲得發(fā)酵液；所述的海水沙氏液體培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、陳海水定容。
3.一種塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液提取物，其特征在于，該提取物以權(quán)利要求2所述的塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液為原料，依次用等體積乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，得到乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物或者萃余物。
4.權(quán)利要求2所述的塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液或者權(quán)利要求3所述的塔賓曲霉SZX-6發(fā)酵液提取物的抑菌用途，所述的菌為鰻弧菌{Vibrio、副溶血弧菌(KiArioparahaemolyticus)、嗜水氣單胞菌{Aeromonas hydrophila)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)和霍亂弧菌{Vib rio cholera^)。
全文摘要
本發(fā)明是一種塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)SZX-6 CCTCC NOM2012540。本發(fā)明還公開了塔賓曲霉的發(fā)酵液及發(fā)酵液的提取物。塔賓曲霉的發(fā)酵液及發(fā)酵液的提取物對鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)和霍亂弧菌(Vibrio cholerae)具有明顯的抑制效果，因此，其發(fā)酵液、發(fā)酵液的提取物可用于抗菌藥物，或可用于提取分離具有抗菌活性的化合物來開發(fā)抗菌藥物。
文檔編號C12P1/02GK103114046SQ20131006588
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者郭雷, 朱成文, 許福泉, 劉瑋煒, 陳麗 申請人:淮海工學(xué)院