A型流感病毒NP基因有干擾作用的siRNA序列的設(shè)計及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為A型流感病毒NP基因有干擾作用的siRNA序列的設(shè)計及應(yīng)用，公開了四條對A型流感病毒NP基因復(fù)制有抑制作用的siRNA；通過雞胚實驗測HA滴度的方法確定了siRNA對流感病毒干擾的有效性。
【專利說明】A型流感病毒NP基因有干擾作用的s i RNA序列的設(shè)計及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及對A型流感病毒NP基因復(fù)制有干擾作用的SiRNA序列的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]流行性感冒(Influenza)，在流行性感冒病毒，是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒，在分類學(xué)上，流感病毒屬于正黏液病毒科，它會造成急性上呼吸道感染，并借由空氣迅速的傳播，在世界各地常會有周期性的大流行。
[0003]流感病毒表面抗原HA和NA的變異有兩種形式，即抗原性漂移(antigenic drift)和抗原性轉(zhuǎn)變(antigenic shift)?？乖云剖侵缸儺惙刃』蜻B續(xù)變異，屬于量變，即亞型內(nèi)變異。一般認(rèn)為這種變異是由病毒基因點突變和人群免疫力選擇所造成的，引起小規(guī)模流行?？乖赞D(zhuǎn)變是指變異幅度大，屬于質(zhì)變，即病毒株表面抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生一種或兩種變異，形成新亞型(如H2N2 — H3N2)，由于人群對變異病毒株缺少免疫力而容易造成新型流感的大流行。同一時期也可同時流行兩個亞型，如1997年甲3型(H3N2)流行時，甲I型(HlNl)同時出現(xiàn)。如果不同型別病毒同時流行，也可發(fā)生基因重組而形成新亞型。
[0004]盡管由死病毒、減毒毒株或重組表面糖蛋白組成的抗流感疫苗能夠有效地保護(hù)約70~80%的健康成年人免于患病，但是疫苗只能針對一小部分毒株，對于新的潛在爆發(fā)的毒株可能沒有作用。而且，對于高風(fēng)險人群如嬰孩、老人、孕婦和其它各種免疫力低下的人群，疫苗的保護(hù)作用是非常有限的，保護(hù)率低于40%。由于大部分的死亡都是發(fā)生在高風(fēng)險人群中，疫苗對于這些最需要它們的人卻不能起到很好的保護(hù)作用。正在應(yīng)用的幾種抗流感藥物也能夠降低流感感染的發(fā)生和減輕流感感染時的癥狀。但是，藥物的副作用、病人的承受能力、可能出現(xiàn)的抗藥性變異限制了這些藥物的大規(guī)模使用。所以，對于預(yù)防和治療流感病毒感染的方法仍然有很急切的需要，特別是在高風(fēng)險人群中和爆發(fā)流感時。因此，流感的防治至少在今后50年內(nèi)仍然是一個嚴(yán)重的問題，尋找更有效的預(yù)防和治療途徑是醫(yī)學(xué)研究的重大課題。
[0005] RNA干擾(RNA interference, RNAi)既目的RNA與同源的祀目標(biāo)mRNA結(jié)合，阻斷病毒翻譯蛋白質(zhì)是解決流感病毒流行的重要手段和方法，其作用原理為:①SiRNA形成階段。RNAi的誘導(dǎo)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被RNaseIII Dicer切割成為21_23nt的小分子干擾RNA(small interfering RNA, siRNA), siRNA的結(jié)構(gòu)特征是5 '端單磷酸，3'端羥基,而且3'端有2~3-nt的堿基突出RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA_induced SilencingComplex, RISC)的形成階段。siRNA與RNAi特異性酶(如Ago_2)結(jié)合，形成RISC，具有特異性的核酸內(nèi)切酶活性能特異性地降解與siRNA同源的mRNA ;③效應(yīng)階段。RISC中siRNA變性，雙鏈解開，卸下正義RNA，反義RNA仍結(jié)合在復(fù)合物上，并引導(dǎo)RISC與同源的靶目標(biāo)mRNA結(jié)合，在核酸內(nèi)切酶的作用下，將靶目標(biāo)mRNA切斷(切割位置在siRNA的中央，距離5'端ΙΟ-nt)，從而阻斷了其翻譯成蛋白質(zhì)，表現(xiàn)為基因沉默。[0006]作為一種快速、有效、特異的抑制基因表達(dá)的工具，被廣泛用于基因功能的研究以及腫瘤、病毒性疾病和遺傳性疾病的治療研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供4條對A型流感病毒NP基因復(fù)制有抑制作用的siRNA編碼序列。如序列表 400〈1>，400〈2>，400〈3>，400〈4> 所示。
[0008]本發(fā)明所述的四條siRNA載體質(zhì)粒的動物水平的實驗結(jié)果表明能效抑制H1N1，H9N2，H2N3的病毒復(fù)制。
【具體實施方式】
[0009]實施例1:雞胚實驗驗證siRNA載體質(zhì)粒干擾H9N2流感病毒增殖作用
[0010]H9N2病毒毒力ED50108/0.Iml,將H9N2病毒稀釋含有100個ED5tl病毒液，體積0.1ml，注射到9日齡SPF雞胚尿囊腔中，同時注射SiRNA載體質(zhì)粒6微克，33°C培養(yǎng)72小時，取尿囊液，測血凝效價。
[0011 ] 實施例2:雞胚實驗驗證siRNA載體質(zhì)粒干擾HlNl流感病毒增殖作用
[0012]HlNl病毒毒力ED5018_6/0.Iml,將HlNl病毒稀釋含有100個ED50病毒液，體積
0.1ml，注射到9日齡SPF雞胚尿囊腔中，同時注射SiRNA載體質(zhì)粒6微克，33°C培養(yǎng)72小時，取尿囊液，測血凝效價。
[0013]實施例3:雞胚實驗驗證siRNA載體質(zhì)粒干擾H3N2流感病毒增殖作用
[0014]H3N2病毒毒力ED50107_6/0.1ml，將HlNl病毒稀釋含有100個ED5tl病毒液，體積
0.1ml，注射到9日齡SPF雞胚尿囊腔中，同時注射SiRNA載體質(zhì)粒6微克，33°C培養(yǎng)72小時，取尿囊液，測血凝效價。
[0015]實施例4:尿囊液病毒滴度檢測
[0016](I)微量血凝板的每孔中滴加PH7.2PBS100 μ L，⑵吸取被檢尿囊液樣品100
[0017]μ L，倍比稀釋12孔，第12孔棄掉100 μ L。每孔中加入0.1 %紅細(xì)胞懸液100 μ L。
[0018](2)設(shè)陰性對照和流感病毒陽性對照。
[0019](4)置微型振蕩器上振蕩Imin混勻。
[0020](5)放室溫下(18~20°C )30min，觀察結(jié)果。
[0021]經(jīng)三次重復(fù)實驗，序列表所述的四條序列〈400>1，〈400>2，〈400>3，<400>4對
[0022]流感病毒復(fù)制的抑制率如下:
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種對流感病毒NP基因復(fù)制有干擾作用的SiRNA，其核苷酸序列如序列表400〈1>，400<2>,400<3>,400<4> 所示。
2.權(quán)利要求1、對所述的siRNA作為抑制流感病毒Np基因沉默的靶向基因的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/113GK103966212SQ201310048338
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月6日
【發(fā)明者】霍晉 申請人:霍晉