專利名稱：一種產(chǎn)表面活性劑的烴降解菌的改良方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)表面活性劑的烴降解菌的誘變改良方法，屬于環(huán)境生物工程和環(huán)境微生物技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
石油污染問題引起了人們越來越多的關注。石油污染環(huán)境的修復有物理、化學和生物修復等三種方法。微生物修復技術(shù)是生物修復中最重要、最核心的組成部分，具有成本低、應用方法簡單、污染物氧化完全、無二次污染、可原位處理、不需大型設備等優(yōu)點，日前引起重視，每年新發(fā)表公布的論文成果層出不窮。微生物修復的關鍵技術(shù)是選用高效的石油烴降解菌株。修復工作中應用的烴降解菌株的獲得目前多局限于天然分離和篩選，主要在被石油污染的水環(huán)境和土壤環(huán)境中采樣。由于野外環(huán)境復雜惡劣，用于烴污染修復的天然分離的菌株往往滿足不了要求。因此篩選和改良烴降解菌就顯得至關重要。其中方法之一是用基因工程的手段，對天然降解性質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)移來構(gòu)建新功能菌株，但此種方法需要較高的技術(shù)條件，同時工程菌的在環(huán)境中的釋放和應用受到嚴格的限制；另一種方法是用物理的、化學的和生物的方法進行誘變，目前多用紫外線和Y射線進行誘變，效果有限。尋找更有效的誘變源，就成為解決問題的關鍵之一。各種電離和非電離輻射是較常用的誘變源，低能離子束是一種新型、高效的電離輻射誘變源，而紫外線則一種經(jīng)典的非電離輻射誘變源。低能離子束誘變育種需要較昂貴的專用儀器設備，且維護費用較高，在一定程度上影響了其發(fā)展應用。紫外誘變操作簡單，成本低廉，效果較好，因此應用廣泛。以上兩種物理誘變劑各有優(yōu)缺點，應結(jié)合應用。但將二者結(jié)合應用的報道很少。
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平板篩選是誘變育種程序中最重要的一環(huán)，高效的平板初篩方法，對提高篩選效率、降低篩選勞動強度具有積極意義。但產(chǎn)表面活性劑的烴降解菌如何進行進行篩選，以獲得表面活性劑發(fā)酵產(chǎn)量與烴降解效率的同步提高，沒有權(quán)威報道，血平板和油平板制作技術(shù)要求高，成功率低，已有文獻均報道不詳。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種產(chǎn)表面活性劑的烴降解菌的改良方法，具體步驟如下:(I)菌種活化:取保藏菌種的甘油管，加入含有50mL肉胨培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30°C振蕩培養(yǎng)1-2天，直到培養(yǎng)出現(xiàn)明顯的渾濁為止；(2)平板培養(yǎng):取搖瓶培養(yǎng)物以10倍稀釋法稀釋成KT1-KT6,取適宜稀釋倍數(shù)的菌液涂布于肉胨平板；(3)斜面培養(yǎng):平板培養(yǎng)后檢查菌落的一致性，確定為純培養(yǎng)后，接種于肉胨斜面(采用15mL試管配制)，30°C條件下培養(yǎng)1_2天，至斜面找出菌苔為止；(4)制作菌懸液:取新培養(yǎng)的斜面，加入無菌生理鹽水(0.86% )5mL，振蕩1_5分鐘，使菌苔中的菌體脫落成菌懸液；
(5)涂布菌懸液:在超凈工作臺中，取上述0.1mL菌懸液，添加于滅菌的90mm培養(yǎng)皿下蓋中，用涂布棒涂勻；(6)制作菌膜:在超凈工作臺中，打開培養(yǎng)皿上蓋，開無菌風吹5-10min，至培養(yǎng)皿下蓋中無水珠為止，使之形成干燥的菌膜，吹風時間過短菌膜不干，易在下一步的離子束注入過程中不易形成真空環(huán)境，影響離子束誘變效果，吹風時間也不宜過長，容易造成自然對照和真空對照菌落過少，不易統(tǒng)計相對存活率；(7)離子束注入:吹干形成菌膜后，合上培養(yǎng)皿，立刻將培養(yǎng)皿置離子束注入機小靶室中，取出上蓋，封閉小靶室，抽真空至一定真空度后，按事先設計好的離子種類、能量和劑量進行注入，一般選用15-20keV氮離子，設定自然對照和真空對照，菌膜形成后立刻進行下一步即為自然對照，將培養(yǎng)皿放入小靶室中但放于輻照的培養(yǎng)皿下面不開蓋即為真空對照；(8)菌膜洗脫:所 有的培養(yǎng)皿蓋上上蓋，取出培養(yǎng)皿，用1.5mL生理鹽水用移液槍和涂布棒配合使用分兩次洗脫菌膜，轉(zhuǎn)移至1.5mL無菌離心管中；(9)平板培養(yǎng):上述菌懸液搖勻后，梯度稀釋到IO6倍后視實際情況取適宜倍數(shù)涂布于肉胨平板上，肉胨培養(yǎng)基成份為(/L):蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，純凈水或自來水1L，調(diào)pH至7.0左右，配制平板時要加1.5%的瓊脂粉，30°C倒置培養(yǎng)2天后統(tǒng)計菌落數(shù)，將各劑量處理均與真空對照相比，求得相對存活率，將真空對照與自然對照的相同稀釋倍數(shù)的菌落數(shù)相比，即得真空對照的存活率；(10)血平板篩選:將各處理肉胨平板上的菌落隨機挑取至90mm血平板上，每個平板點種6-7個菌落，30°C培養(yǎng)2天后測定各菌落的溶血圈直徑，統(tǒng)計突變率，突變效率分為正突變率(溶血圈直徑比出發(fā)菌株增加> 10% )和負突變率(溶血圈直徑比出發(fā)菌株降低> 10% )，以存活率20-30%、正突變率較高而負突變率較低的劑量較為適宜，作為后續(xù)輻照的劑量，配制血平板的方法如下:肉胨培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂粉滅菌后取出冷卻至50°C左右時，加入5-7%的脫纖維無菌羊血，迅速分配至培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中加入約15mL培養(yǎng)基，冷卻后即得血平板，血平板不耐貯存，一般隨用隨配；根據(jù)以上存活率和突變率確定最優(yōu)離子注入?yún)?shù)；(11)油平板評價和篩選:挑取溶血圈最大的菌落30個，肉胨培養(yǎng)基培養(yǎng)8-10小時后，用牙簽鈍頭蘸取少量菌液，點種至油平板，每個油平板點種4-5個菌落，30°C倒置培養(yǎng)3天后測定各菌株噬油斑直徑油平板配制方法如下:將原油溶于石油醚(濃度10%)中，濾紙剪成直徑85mm，置90mm培養(yǎng)皿中，加2mL10%石油溶液，待石油醚揮發(fā)后，121°C蒸汽高壓滅菌20min，取出60°C烘干備用，礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基(MSM)中加入1.5%的瓊脂粉，滅菌后傾倒平板，平板尚未凝固時將濾紙緊貼在平板上后即成油平板，MSM按以下方法配制:MgS04，
0.2g，KH2P04，1.0g ； (NH4)2SO4,1.0g ；CaCl2,0.02g ；K2HP04,1.0g ；FeCl3,0.05g ;蒸餾水 lL，pH值最后調(diào)整為7.0-7.2，選出噬油斑最大的突變株10株左右；(12)搖瓶復篩:初篩的菌株分別接肉胨培養(yǎng)基后，同時接產(chǎn)表活培養(yǎng)基和烴降解培養(yǎng)基，每個菌株設置3個獨立重復，進行搖瓶復篩，具體操作步驟如下:產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基成份為(g/L):NaN032.5，Κ2ΗΡ044.0, ΚΗ2Ρ044.0, CaCl2.2Η200.1，MgSO40.2，NaCll.0,KC11.0，酵母粉1.0，甘油30，pH值最后調(diào)整為6.5，加入3_5%的碳源(如廢棄植物油)，滅菌后，加入I %的種子液，300C、ISOrpm轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)3d后測定發(fā)酵液稀釋100倍后表面張力和發(fā)酵液排油圈大小，測定表面張力采用界/表面張力儀，排油圈測定大小的方法是:在90mm培養(yǎng)皿小蓋中，加入15mL去離子水，滴加200mL0#柴油，形成油膜后，再在油膜中心用微量取樣器加入IOuL的發(fā)酵液10倍去離子水稀釋液，如果排油圈直徑超過培養(yǎng)皿小蓋的直徑，則將發(fā)酵液稀釋10倍后再加入；烴降解 培養(yǎng)基為上述(11)中的MSM加1%的原油，按5%的量接種后30°C、120rpm轉(zhuǎn)速條件下?lián)u床培養(yǎng)7d，觀察原油乳化和降解情況，測定殘余烴的量和發(fā)酵液離心后的上清液的表面張力，并分別記錄，測定殘余烴的量采用重量法，具體方法是:漏斗中加入脫脂棉過濾得濾液，測定表面張力采用表面張力儀進行，脫脂棉上與粘在搖瓶壁上的殘余原油采用石油醚(30-60°C沸程)清洗回收到尖底燒瓶中，加熱(60°C )條件下采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干石油醚，根據(jù)尖底燒瓶前后的質(zhì)量差求得殘余原油的質(zhì)量，與稱重之前的原油質(zhì)量對t匕，并結(jié)合空白對照的質(zhì)量變化，求得微生物對搖瓶中原油的降解率；根據(jù)產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基的表面張力、排油圈、烴降解培養(yǎng)基濾油的表面張力、石油烴降解率進行綜合評定，初步篩選出最優(yōu)的菌株I株；如有必要，則重復上述步驟，進行多輪離子束誘變篩選；(13)制作菌懸液:取上述突變株接種肉胨培養(yǎng)基搖瓶，30°C培養(yǎng)8小時后，12000rpm離心5分鐘后，去上清，菌體再用生理鹽水重新懸浮；(14)紫外誘變:將菌懸液分配至無菌60mm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放5mL,按預定的參數(shù)進行紫外輻照，根據(jù)菌株對紫外線的敏感程度決定輻照時間，可以進行預備實驗，即在固定紫外燈功率和輻照距離后，進行一系列時間的紫外線輻照后，在肉胨平板上涂布計數(shù)，計算存活率，取存活率在10%左右的輻照時間為優(yōu)化后的輻照時間，紫外燈功率為15-20瓦，輻照距離為30厘米；(15)血平板篩選:基本同上述第(10)步，將各處理肉胨平板上的菌落隨機挑取至90mm血平板上，每個平板點種6-7個菌落，30°C培養(yǎng)2天后測定各菌落的溶血圈直徑；(16)油平板篩選:取溶血圈較大的菌落30個左右，肉胨培養(yǎng)基培養(yǎng)8-10小時后，用牙簽鈍頭蘸取少量菌液，點種至油平板，每個油平板點種4-5個菌落，30°C培養(yǎng)3天后測定曬油斑大小，篩選出最優(yōu)的菌株10株左右，(17)搖瓶復篩:同上述第(12)步，篩選出最優(yōu)的菌株3-5株；(18)穩(wěn)定性評價:取篩選出的優(yōu)良突變株連續(xù)培養(yǎng)5代以上，每代均搖瓶培養(yǎng)，測定相關指標，傳代方法是:斜面培養(yǎng)、保存一第一代種子搖瓶培養(yǎng)一同時進行兩種培養(yǎng)基的搖瓶發(fā)酵一斜面培養(yǎng)保存一第二代種子搖瓶培養(yǎng)……最終獲得穩(wěn)定性較好、綜合性狀優(yōu)良的突變株1-2個，作為最終的優(yōu)良突變菌株。由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明所具有的優(yōu)點和積極效果是:步驟較為簡便、可靠，操作性強，成功率高，易于推廣應用，誘變改良效果好。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種產(chǎn)表面活性劑的烴降解菌的綜合誘變改良方法。取出發(fā)菌株做成菌膜后，進行離子束注入，通過預備實驗獲得最佳參數(shù)，進行一至多輪離子束誘變處理，通過血平板與油平板復合篩選，初步篩選出優(yōu)良菌株，作為紫外線誘變的出發(fā)菌株，同樣通過血平板與油平板復合篩選，并結(jié)合產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基和烴降解培養(yǎng)基搖瓶篩選，進行綜合評價，獲得突變菌株10株左右，再連續(xù)傳代培養(yǎng)5代以上，考察各代表現(xiàn)，最終獲得穩(wěn)定的突變株1-2株。
具體實施例對銅綠假單胞菌Z41進行低能離子束和紫外線誘變，以期獲得較高表面活性劑產(chǎn)量和較高降解效率的突變株。先用20keV能量的氮離子以0-120X2.5X 1013ions/cm2的劑量進行注入，發(fā)現(xiàn)有明顯的馬鞍型存活曲線存在。通過存活率和血平板突變率的考查，認為60X2.5X1013ions/cm2 是較優(yōu)的劑量，在拐點的存活率達19 %，通過血平板和油平板篩選以及搖瓶評價，獲得突變株L18。對L18進行以20W紫外燈進行誘變，處理時間分別為5s，15s，30s, 40s和60s，之后通過復合篩選獲得優(yōu)良突變株V23，原油周降解率達52.1 %，比出發(fā)菌株提高29.6 %，發(fā)酵液中鼠李糖脂產(chǎn)量達19.6g/L，比出發(fā)菌株提高28.9 %。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)表面活性劑的烴降解菌的誘變改良方法，其特征是: 具體步驟如下: (1)菌種活化:取保藏菌種的甘油管，加入含有50mL肉胨培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30°C振蕩培養(yǎng)1-2天，直到培養(yǎng)出現(xiàn)明顯的渾濁為止； (2)平板培養(yǎng):取搖瓶培養(yǎng)物以10倍稀釋法稀釋成KT1-KT6,取適宜稀釋倍數(shù)的菌液涂布于肉胨平板； (3)斜面培養(yǎng):平板培養(yǎng)后檢查菌落的一致性，確定為純培養(yǎng)后，接種于肉胨斜面(采用15mL試管配制)，30°C條件下培養(yǎng)1_2天，至斜面找出菌苔為止； (4)制作菌懸液:取新培養(yǎng)的斜面，加入無菌生理鹽水(0.86% )5mL，振蕩1_5分鐘，使菌苔中的菌體脫落成菌懸液； (5)涂布菌懸液:在超凈工作臺中，取上述0.1mL菌懸液，添加于滅菌的90mm培養(yǎng)皿下蓋中，用涂布棒涂勻； (6)制作菌膜:在超凈工作臺中，打開培養(yǎng)皿上蓋，開無菌風吹5-10min，至培養(yǎng)皿下蓋中無水珠為止，使之形成干燥的菌膜，吹風時間過短菌膜不干，易在下一步的離子束注入過程中不易形成真空環(huán)境，影響離子束誘變效果，吹風時間也不宜過長，容易造成自然對照和真空對照菌落過少，不易統(tǒng)計相對存活率； (7)離子束注入:吹干形成菌膜后，合上培養(yǎng)皿，立刻將培養(yǎng)皿置離子束注入機小靶室中，取出上蓋，封閉小靶室，抽真空至一定真空度后，按事先設計好的離子種類、能量和劑量進行注入，一般選用15-20keV氮離子，設定自然對照和真空對照，菌膜形成后立刻進行下一步即為自然對照，將培養(yǎng)皿放入小靶室中但放于輻照的培養(yǎng)皿下面不開蓋即為真空對昭.(8)菌膜洗脫:所有的培 養(yǎng)皿蓋上上蓋，取出培養(yǎng)皿，用1.5mL生理鹽水用移液槍和涂布棒配合使用分兩次洗脫菌膜，轉(zhuǎn)移至1.5mL無菌離心管中； (9)平板培養(yǎng):上述菌懸液搖勻后，梯度稀釋到106倍后視實際情況取適宜倍數(shù)涂布于肉胨平板上，肉胨培養(yǎng)基成份為(/L):蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，純凈水或自來水1L，調(diào)pH至7.0左右，配制平板時要加1.5%的瓊脂粉，30°C倒置培養(yǎng)2天后統(tǒng)計菌落數(shù)，將各劑量處理均與真空對照相比，求得相對存活率，將真空對照與自然對照的相同稀釋倍數(shù)的菌落數(shù)相比，即得真空對照的存活率； (10)血平板篩選:將各處理肉胨平板上的菌落隨機挑取至90mm血平板上，每個平板點種6-7個菌落，30°C培養(yǎng)2天后測定各菌落的溶血圈直徑，統(tǒng)計突變率，突變效率分為正突變率(溶血圈直徑比出發(fā)菌株增加> 10% )和負突變率(溶血圈直徑比出發(fā)菌株降低> 10% )，以存活率20-30%、正突變率較高而負突變率較低的劑量較為適宜，作為后續(xù)輻照的劑量，配制血平板的方法如下:肉胨培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂粉滅菌后取出冷卻至50°C左右時，加入5-7%的脫纖維無菌羊血，迅速分配至培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中加入約15mL培養(yǎng)基，冷卻后即得血平板，血平板不耐貯存，一般隨用隨配；根據(jù)以上存活率和突變率確定最優(yōu)離子注入?yún)?shù)； (11)油平板評價和篩選:挑取溶血圈最大的菌落30個，肉胨培養(yǎng)基培養(yǎng)8-10小時后，用牙簽鈍頭蘸取少量菌液，點種至油平板，每個油平板點種4-5個菌落，30°C倒置培養(yǎng)3天后測定各菌株噬油斑直徑油平板配制方法如下:將原油溶于石油醚(濃度10% )中，濾紙剪成直徑85mm，置90mm培養(yǎng)皿中，加2mL10%石油溶液，待石油醚揮發(fā)后，121°C蒸汽高壓滅菌20min，取出60°C烘干備用，礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基(MSM)中加入1.5 %的瓊脂粉，滅菌后傾倒平板，平板尚未凝固時將濾紙緊貼在平板上后即成油平板，MSM按以下方法配制:MgSQ，0.2g，KH2P04，1.0g ； (NH4)2SO4,1.0g ；CaCl2,0.02g ；K2HPO4,1.0g ；FeCl3,0.05g ;蒸餾水 1L，pH 值最后調(diào)整為7.0-7.2，選出噬油斑最大的突變株10株左右； (12)搖瓶復篩:初篩的菌株分別接肉胨培養(yǎng)基后，同時接產(chǎn)表活培養(yǎng)基和烴降解培養(yǎng)基，每個菌株設置3個獨立重復，進行搖瓶復篩，具體操作步驟如下:產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基成份為(g/L):NaN032.5，Κ2ΗΡ044.0，ΚΗ2Ρ044.0，CaCl2.2Η200.LMgSO40.2，NaCll.0, KC11.0,酵母粉1.0，甘油30，pH值最后調(diào)整為6.5，加入3-5%的碳源(如廢棄植物油)，滅菌后，力口入1%的種子液，30°C、180rpm轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)3d后測定發(fā)酵液稀釋100倍后表面張力和發(fā)酵液排油圈大小，測定表面張力采用界/表面張力儀，排油圈測定大小的方法是:在90mm培養(yǎng)皿小蓋中，加入15mL去離子水，滴加200mL0#柴油，形成油膜后，再在油膜中心用微量取樣器加入IOuL的發(fā)酵液10倍去離子水稀釋液，如果排油圈直徑超過培養(yǎng)皿小蓋的直徑，則將發(fā)酵液稀釋10倍后再加入； 烴降解培養(yǎng)基為上述(11)中的MSM加I %的原油，按5%的量接種后30°C、120rpm轉(zhuǎn)速條件下?lián)u床培養(yǎng)7d，觀察原油乳化和降解情況，測定殘余烴的量和發(fā)酵液離心后的上清液的表面張力，并分別記錄，測定殘余烴的量采用重量法，具體方法是:漏斗中加入脫脂棉過濾得濾液，測定表面張力采用表面張力儀進行，脫脂棉上與粘在搖瓶壁上的殘余原油采用石油醚(30-60°C沸程)清洗回收到尖底燒瓶中，加熱(60°C )條件下采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干石油醚，根據(jù)尖底燒瓶前后的質(zhì)量差求得殘余原油的質(zhì)量，與稱重之前的原油質(zhì)量對比，并結(jié)合空白對照的質(zhì)量變化，求得微生物對搖瓶中原油的降解率； 根據(jù)產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基的表面張力、排油圈、烴降解培養(yǎng)基濾油的表面張力、石油烴降解率進行綜合評定，初步篩選出最優(yōu)的菌株I株； 如有必要，則重復上述步驟，進行多輪離子束誘變篩選； (13)制作菌懸液:取上述突變株接種肉胨培養(yǎng)基搖瓶，30°C培養(yǎng)8小時后，12000rpm離心5分鐘后，去上清，菌體再用生理鹽水重新懸?。? (14)紫外誘變:將菌懸液分配至無菌60mm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放5mL，按預定的參數(shù)進行紫外輻照，根據(jù)菌株對紫外線的敏感程度決定輻照時間，可以進行預備實驗，即在固定紫外燈功率和輻照距離后，進行一系列時間的紫外線輻照后，在肉胨平板上涂布計數(shù)，計算存活率，取存活率在10%左右的輻照時間為優(yōu)化后的輻照時間，紫外燈功率為15-20瓦，輻照距離為30厘米；(15)血平板篩選:基本同上述第(10)步，將各處理肉胨平板上的菌落隨機挑取至90mm血平板上，每個平板點種6-7個菌落，30°C培養(yǎng)2天后測定各菌落的溶血圈直徑； (16)油平板篩選:取溶血圈較大的菌落30個左右，肉胨培養(yǎng)基培養(yǎng)8-10小時后，用牙簽鈍頭蘸取少量菌液，點種至油平板，每個油平板點種4-5個菌落，30°C培養(yǎng)3天后測定噬油斑大小，篩選出最優(yōu)的菌株10株左右， (17)搖瓶復篩:同上述第(12)步，篩選出最優(yōu)的菌株3-5株； (18)穩(wěn)定性評價:取篩選出的優(yōu)良突變株連續(xù)培養(yǎng)5代以上，每代均搖瓶培養(yǎng)，測定相關指標，傳代方法是:斜面培養(yǎng)、保存一第一代種子搖瓶培養(yǎng)一同時進行兩種培養(yǎng)基的搖瓶發(fā)酵一斜面培養(yǎng)保存一第二代種子搖瓶培養(yǎng)……最終獲得穩(wěn)定性較好、綜合性狀優(yōu)良的突變株1-2個，作為 最終的優(yōu)良突變菌株，或作為下一輪誘變改良的出發(fā)菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)表面活性劑的烴降解菌的誘變改良方法，屬于環(huán)境生物工程和環(huán)境微生物技術(shù)領域。取出發(fā)菌株做成菌膜后，進行離子束注入，通過預備實驗獲得最佳參數(shù)，進行一至多輪離子束誘變處理，通過血平板與油平板復合篩選，初步篩選出優(yōu)良菌株，作為紫外線誘變的出發(fā)菌株，同樣通過血平板與油平板復合篩選，并結(jié)合產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基和烴降解培養(yǎng)基搖瓶篩選，進行綜合評價，獲得突變菌株10株左右，再連續(xù)傳代培養(yǎng)5代以上，考察各代表現(xiàn)，最終獲得穩(wěn)定的突變株1-2株。由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明所具有的優(yōu)點和積極效果是步驟較為簡便、可靠，操作性強，成功率高，易于推廣應用，誘變改良效果好。
文檔編號C12N13/00GK103146677SQ20131004355
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月27日
發(fā)明者張祥勝, 范紅香, 許德軍 申請人:鹽城師范學院