專利名稱：堪薩斯分枝桿菌檢測用的引物和探針、以及使用它們檢測堪薩斯分枝桿菌的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及利用核酸擴增及其檢測體系，在臨床檢查中檢測和/或鑒定堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii,以下稱為 M.kansasii)的方法。
背景技術(shù)：
非結(jié)核性抗酸菌(nontuberculous mycobacterium, NTM)是被分類在分枝桿菌(Mycobacterium)屬的具有抗酸性性質(zhì)的革蘭氏陽性桿菌，是結(jié)核菌群和Mycobacterium,leprae以外的一種抗酸菌。在非結(jié)核性抗酸菌中，臨床上引人注目的菌種已知有堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)、戈氏分枝桿菌(Mycobacteriumgordonae)、斯氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)、鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)、胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare)、蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi)、偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacteriumfortuitum)、龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)、胺腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)等。特別是由堪薩斯分枝桿菌和鳥分枝桿菌這2種菌引起的感染癥占非結(jié)核性抗酸菌癥全體的90%以上。通常，人們認為非結(jié)核性抗酸菌對健康人是無害的，但偶爾對人也表現(xiàn)出感染性，引起非結(jié)核性抗酸菌癥。特別是對于象感染了 AIDS病毒那樣的免疫功能缺陷者，成了重大的感染起因菌。雖然非結(jié)核性抗酸菌癥一直是很稀少的疾病，但由于近年有增加傾向，所以期盼開發(fā)在短時間能夠鑒別結(jié)核菌和非結(jié)核性抗酸菌的方法。加之鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的核酸擴增檢測和診斷法適用于健康保險，在全國急速推廣之后，其診斷上的意義很大。由于非結(jié)核性抗酸菌大多數(shù)對抗結(jié)核藥表現(xiàn)出抗性，當患者存在抗酸菌感染癥的嫌疑時，結(jié)核癥還是非結(jié)核性抗酸菌癥的鑒別診斷在決定治療方針上很重要。另外由非結(jié)核性抗酸菌引起的疾病因其菌的種類不同，治療法也各異，所以確定其菌種也非常重要。然而，由于非結(jié)核性抗酸菌癥沒有特異的臨床癥狀，所以根據(jù)臨床所見、病理組織學所見鑒別結(jié)核癥和非結(jié)核性抗酸菌癥，以及進一步確定非結(jié)核性抗酸菌的種類極其困難。因此，結(jié)核癥還是非結(jié)核性抗酸菌癥的診斷必須通過菌的鑒定進行。

作為一般的診斷法，首先進行喀痰涂抹檢查。該檢查僅判斷所謂的“抗酸菌陽性”，不能鑒別是結(jié)核菌還是非結(jié)核性抗酸菌。因此在喀痰涂抹檢查中為陽性時，通過在小川培養(yǎng)基等培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)，進行菌的培養(yǎng)檢查，鑒別是結(jié)核菌還是非結(jié)核性抗酸菌。然后再進行生物化學的試驗，鑒定菌種。然而分枝桿菌屬發(fā)育一般比較慢，培養(yǎng)需要相當長的時間。因此，當進行作為現(xiàn)在基本法的涂抹檢查或培養(yǎng)檢查時，為了獲得是否是結(jié)核癥的診斷結(jié)果，僅菌的分離培養(yǎng)就需要3 4周時間。而且還存在著為了鑒定菌種而進行的各種生物化學的試驗還需要2 3周時間的問題。另外堪薩斯分枝桿菌的鑒定也要通過生物化學的試驗進行。通過生物化學的試驗鑒定堪薩斯分枝桿菌的主要鑒定方法是利用細菌暴露于光就生產(chǎn)色素的性質(zhì)，但由于幾個其它的分枝桿菌屬的菌種也表現(xiàn)出與堪薩斯分枝桿菌同樣的生物化學的特性，所以通常利用發(fā)色性鑒定堪薩斯分枝桿菌也存在問題。近年來，一直在開發(fā)于基因水平檢測菌的技術(shù)。例如，研究了作為有用的手段利用聚合酶鏈反應(PCR)等核酸擴增技術(shù)的診斷技術(shù)。該方法具有靈敏度高，可以檢測數(shù)個菌、時間短(最長4日)的優(yōu)點。而且，運用通常的PCR法無論是活菌還是死菌都可同樣檢測。然而無論菌數(shù)多少都被判定為陽性，由于不知道菌數(shù)，有無感染性的診斷變得不確實。加之靈敏度過高，具有容易出現(xiàn)假陽性的判定等問題。就堪薩斯分枝桿菌來說，有從堪薩斯分枝桿菌的基因組文庫獲得DNA探針(pMKl-9)的研究(非專利文獻I)。該DNA探針(pMKl-9)雖然可以與堪薩斯分枝桿菌的DNA形成互補的雜化體，但與其它種的分枝桿菌也同樣可形成雜化體，所以對堪薩斯分枝桿菌不特異。在堪薩斯分枝桿菌的鑒定中還有著眼于使用pMKl-9探針和與堪薩斯分枝桿菌的rRNA基因特異雜交結(jié)合的市售的DNA探針(ACCUPROBE ，GenProbe, San Diego，加利福尼亞州)的研究(非專利文獻2)。然而，在該研究中報告了 pMKl-9探針和市售的DNA探針(ACCU-PR0BETM)中的任一個都不能檢測相當數(shù)量的堪薩斯分枝桿菌株種。另外，在堪薩斯分枝桿菌的檢測中還有使用市售的DNA探針(ACXU-PR0BETM)進行評價的其它研究(非專利文獻3)。這些研究者們的實驗中，ACXU-PROBE 是100 %種特異的，對于其它的分枝桿菌種沒有表現(xiàn)出交叉反應，但只可檢測出堪薩斯分枝桿菌株中的73 %。

有報告稱可以從堪薩斯分枝桿菌的臨床分離體純化堪薩斯分枝桿菌特異的DNA雜化體形成探針(P6123)(非專利文獻4)。該探針(p6123)對實驗中使用的所有堪薩斯分枝桿菌株都可形成雜化體，也包括對Ross等人的DNA探針(pMKl-9)沒有反應的亞類。美國專利第5，500，341號(專利文獻2)公開了由P6123探針純化的堪薩斯分枝桿菌特異的增殖引物。另外，B.Boddinghaus等人報道了特異增殖的、與分枝桿菌DNA雜交結(jié)合的,從16S的rRNA純化分離的分枝桿菌屬特異的寡核苷酸(非專利文獻5)。另外還進行了例如有關對堪薩斯分枝桿菌檢測有效的DNA區(qū)域的鑒定的研究(例如專利文獻I等)，但現(xiàn)狀是還沒有確立對堪薩斯分枝桿菌特異的診斷法。以上所述可知現(xiàn)狀是希望確立新的特異檢測非結(jié)核性抗酸菌的方法。專利文獻I特開平11-155589號公報專利文獻2美國專利第5，500,341號公報專利文獻3特開昭60-281號公報非專利文獻I
Z.H.Huang 等人，J.Clin.Microbiol.，1991，29，p.212非專利文獻2]B.C.Ross 等人，J.Clin.Microbiol.，1992，30，p.2930非專利文獻3Tortoli 等人，Eur.J Clin.Microbiol.1nfect.Dis.，1994,13，p.2非專利文獻4]M.Yang 等人，J.Clin.Microbiol.，1993，31，p.2769非專利文獻5]B.Boddinghaus 等人，J.Clin.Microbiol.，1990，28，p.1非專利文獻6]F.Poly 等人，J.Bacteriology, 2004,186，14，p.4781-479
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明是鑒于上述所述狀況形成的發(fā)明，目的在于提供排除診斷上假陽性的新的堪薩斯分枝桿菌檢測用引物、以及使用該引物的簡便、迅速且精度高的堪薩斯分枝桿菌的檢測方法。用于解決課題的手段本發(fā)明是以解決上述課題為目的形成的發(fā)明，構(gòu)成以下。(1)含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列(其中，A表示腺嘌呤、C表示胞嘧啶、G表示鳥嘌呤、T表示胸腺嘧啶。另外，任意位置的T可以被替換為尿嘧啶(U)。下同)的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸。(2)含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部，并且含有與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的堪薩斯分枝桿菌檢測用引物。(3)含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部，并且含有與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的堪薩斯分枝桿菌檢測用探針。(4)堪薩斯分枝桿菌的檢測方法，其特征是使用含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為引物和/或探針。(5)堪薩斯分枝桿菌檢測用試劑盒，其包含作為引物和/或探針的含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸。本發(fā)明者等就到現(xiàn)在為止已確定的堪薩斯分枝桿菌和其它生物的各種基因，反復進行了各種間的各基因序列同源性的理論檢證與實驗檢證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在通過使用微陣列法的方法得到的來自堪薩斯分枝桿菌的核酸序列的片段中，存在著與堪薩斯分枝桿菌的基因序列的特定區(qū)域特異雜交，對堪薩斯分枝桿菌的檢測有用的堿基序列。以這些見識作為基礎再進行銳意研究，結(jié)果得到了對堪薩斯分枝桿菌特異的寡核苷酸(序列號1、序列號2、序列號3、序列號4所示的核酸序列)，發(fā)現(xiàn)這些核酸序列對堪薩斯分枝桿菌的檢測有用。然后再以這些序列為基礎開發(fā)堪薩斯分枝桿菌檢測用引物和探針，直至確立了使用這些引物和探針的堪薩斯分枝桿菌的檢測方法。發(fā)明的效果通過使用本發(fā)明的引物或/和探針的堪薩斯分枝桿菌的檢測方法，與通過現(xiàn)有的菌的培養(yǎng)檢查等鑒定菌種的方法進行比較，前者可以極其迅速且高精度進行堪薩斯分枝桿菌的檢測。通過用本發(fā)明的檢測方法進行堪薩斯分枝桿菌的檢測，與通過使用現(xiàn)有的引物或/和探針的PCR法進行的診斷方法比較，診斷上的假陽性可能被排除，可以更高精度進行堪薩斯分枝桿菌的檢測和診斷。另外，通過使用本發(fā)明的檢測方法，也可以進行堪薩斯分枝桿菌菌體的定量。附圖的簡單說明

圖1候補克隆I的堿基序列和設計的引物的所在位置(箭頭指示)。圖2候補克隆2的堿基序列和設計的引物的所在位置(箭頭指示)。圖3候補克隆3的堿基序列和設計的引物的所在位置(箭頭指示)。圖4候補克隆4的堿基序列和設計的引物的所在位置(箭頭指示)。圖5在實驗例I中，使用來自堪薩斯分枝桿菌基因組得到的PCR產(chǎn)物、使用堪薩斯分枝桿菌的KATS2序列、以及日本專利申請2004-129272號說明書中以序列號8表示的序列(本說明書中以序列號81表示。)得到的以Cy3/Cy5的熒光強度為基礎制作的散點圖(scatter plot)。圖6實施例1中得到的電泳結(jié)果。其中各泳道的數(shù)字分別表示使用以下各個樣品時的結(jié)果。M4:分子量標記(標記4)、 a:大腸桿菌(Escherichia coli)、b:結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis ;人型結(jié)核菌)、c:堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)、d:海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)、e:猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)、f:療病分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)、g:戈氏分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)、h:斯氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)、1:鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)、j:胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare)、k:胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)、1:蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi)、m:無色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum)、n:地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)、O:次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)p:偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)、q:龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)、r:胺腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)、s:外來分枝桿菌(Mycobacterium peregrinum)。圖7表示實施例4中進行的實時PCR檢測結(jié)果，繪制對應于各PCR用DNA樣品的基因組的拷貝數(shù)U軸、對數(shù)值)的Ct值(y軸)的校正曲線。符號說明圖5中的各記號分別如以下所示。
(1)被判斷為對堪薩斯分枝桿菌特異性高的候補克隆、(2)使用特開平11-155589號所述的堪薩斯分枝桿菌的KAS序列的結(jié)果(3)使用日本專利申請2004-129272號說明書中記載的來自結(jié)核分枝桿菌的序列號8(本說明書中為序列號81)時的結(jié)果(a)表示Cy5熒光強度/Cy3熒光強度的比率≥10.0的線(b)表示Cy5熒光強度/Cy3熒光強度的比率≥5.0的線(c)表示Cy5熒光強度/Cy3熒光強度的比率≥2.0的線(a’ )表示Cy3熒光強度/Cy5熒光強度的比率≥10.0的線(b’)表示Cy3熒光強度/Cy5熒光強度的比率≥5.0的線(c’)表示Cy3熒光強度/Cy5熒光強度的比率≥2.0的線。用于實施發(fā)明的最好方式本發(fā)明中所謂堪薩斯分枝桿菌基因指的是堪薩斯分枝桿菌具有的全基因組序列內(nèi)的任意的核酸序列單位(區(qū)域)?？八_斯分枝桿菌的全基因組序列還沒有被破譯。作為本發(fā)明涉及的寡核苷酸，如含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或全部、或者含有其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸(以下有時略記為本發(fā)明的寡核苷酸)。本發(fā)明涉及的序列號1所示的核酸序列的寡核苷酸大小為517個堿基、序列號2所示的核酸序列的寡核苷酸大小為596個堿基、序列號3所示的核酸序列的寡核苷酸大小為636個堿基、序列號4所示的核酸序列的寡核苷酸大小為726個堿基。作為本發(fā)明涉及的含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或者全部的寡核苷酸，例如(1)含有與序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列具有約70%以上、優(yōu)選約80%以上、更優(yōu)選約90%以上、更優(yōu)選約95%以上同源性的堿基序列的寡核苷酸、或(2)特征為包含序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列中連續(xù)的10個堿基以上、優(yōu)選20個堿基以上的寡核苷酸等。作為含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分的寡核苷酸如含有序列號5 79所示的核酸序列的部分或全部，并且含有連續(xù)的10個堿基以上的寡核苷酸等。作為含有序列號I所示的核酸序列的部分的寡核苷酸的具體例子，如含有選自序列號5 12或序列號53 56所不的核酸序列的序列的寡核苷酸；作為含有序列號2所不的核酸序列的部分的寡核苷酸的具體例子，如含有選自序列號13 26或序列號57 64所示的核酸序列的序列的寡核苷酸；作為含有序列號3所示的核酸序列的部分的寡核苷酸的具體例子，如含有選自序列號27 40或序列號65 72所示的核酸序列的序列的寡核苷酸；作為含有序列號4所示的核酸序列的部分的寡核苷酸的具體例子，如含有選自序列號41 52或序列號73 79所示的核酸序列的序列的寡核苷酸。作為本發(fā)明涉及的含有與序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列互補的互補序列的部分或全部的寡核苷酸，例如具有與含有本發(fā)明的序列號1、序列號
2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的寡核苷酸雜交的堿基序列的部分或全部的寡核苷酸等。上述的所謂具有與含有本發(fā)明涉及的序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的寡核苷酸雜交的堿基序列的部分或全部的寡核苷酸具體的如具有與含有本發(fā)明的序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的寡核苷酸在高度嚴格的條件或嚴格的條件下雜交的堿基序列的部分或者全部的寡核苷酸等。其中這里所說的“高度嚴格的條件”具體的例如于50%甲酰胺中在42 70°C、優(yōu)選60 70°C的雜交、然后于0.2 2XSSC、0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)中在25 70°C清洗的條件。而所謂的“嚴格的條件”，具體的例如在6 X SSC或與它同等鹽濃度的雜交溶液中，于50 70°C溫度條件下雜交16小時，用6 X SSC或與它同等的鹽濃度的溶液等根據(jù)需要進行預清洗后，用IXSSC或與它同等的鹽濃度的溶液等清洗的條件。

所謂與本發(fā)明涉及的堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸為如具有與上述的堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列在高度嚴格的條件或嚴格的條件下雜交的堿基序列的寡核苷酸等。該高度嚴格的條件和嚴格的條件如上所述。作為含有與序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列互補的互補序列的部分的寡核苷酸，如“含有與含有序列號5 79所示的核酸序列的寡核苷酸互補的序列的部分或者全部，并且含有連續(xù)的10個堿基以上的寡核苷酸”。作為含有與序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列互補的互補序列的部分的寡核苷酸的具體例子，如含有與選自序列號5 79所示的核酸序列中的序列的寡核苷酸互補的序列的寡核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸既可以是脫氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核酸(RNA)。當為核糖核酸時，不用說可以將胸苷殘基(T)替換為尿苷殘基(U)。而在合成時，可以將任意位置的T變成U進行合成，含有尿苷殘基的DNA也可以。同樣含有將任意位置的U變?yōu)門的胸苷殘基的RNA也可以。另外，I個或者多個核苷酸缺失、插入或被替換，即使象次黃苷(I)那樣的修飾核苷酸也可以。為了獲得本發(fā)明的寡核苷酸，可以使用通過同行眾所周知的化學合成法制備的寡核苷酸。因此，與克隆的寡核苷酸或多核苷酸相比，可以容易、大量且便宜地獲得一定品質(zhì)的寡核苷酸。例如，使用通常進行DNA合成的DNA合成儀，根據(jù)通常的磷酰胺法合成寡核苷酸，通過使用陰離子交換柱層析的常規(guī)方法進行純化，可以得到作為目標的本發(fā)明的寡核苷酸。另夕卜，作為可達到本發(fā)明目的的探索(篩選)寡核苷酸的手段，有FEMSMicrobiology Letters 166:63-70,1998 或 Systematic and AppliedMicrobiology24:109-112,2001等報道的扣除法，有通過從作為目標的基因組DNA片段扣除與來自要區(qū)別的生物種的基因組DNA片段反應的片段，將候補序列濃縮的方法論。另外，就像特開平11-155589號公報(專利文獻I)報道的那樣，可以考慮利用所謂的制備來自作為目標的基因組DNA和來自要區(qū)別的生物種的基因組DNA的擴增產(chǎn)物的差異顯示的方法，即利用任意引物的聚合酶鏈反應(AP-PCR)的方法論。另外，通過利用稱之為所謂的微陣列法的方法也可以獲得本發(fā)明的寡核苷酸。該方法首先做成例如堪薩斯分枝桿菌基因組DNA的鳥槍法克隆，然后做成將來自得到的鳥槍法克隆的純化DNA配置于載玻片上的微陣列。另外，將作為目標的堪薩斯分枝桿菌的基因組DNA片段做成熒光標記(標記I)的片段。另一方面，也將來自要區(qū)別的生物種的基因組DNA片段做成熒光標記(標記2)的片段，進行對照實驗。即通過在同一反應體系使用各個標記I和標記2的競爭雜交法，檢定與微陣列上的序列的反應性(結(jié)合性)。通過這樣的操作，由于有可能選定與作為目標的堪薩斯分枝桿菌的基因組DNA片段(標記I)更特異反應的序列候補群(例如非專利文獻6等)，由此可選擇目標寡核苷酸。以下就使用微陣列法的本發(fā)明的寡核苷酸的選定方法的一個例子進行詳細說明。(I)全基因組鳥槍法文庫(Whole Genome Shotgun library)的制作對Venter 等人，Science.2001 年 2 月 16 日；291 (5507):1304-1351 所述的全基因組鳥槍法進行改變，用下述方法進行堪薩斯分枝桿菌的全基因組鳥槍法文庫的制作。首先用常規(guī)方法(例如高壓蒸氣滅菌處理和使用玻璃珠等進行菌體的破碎處理)對堪薩斯分枝桿菌菌株進行處理，再按照常規(guī)方法進行DNA的提取、純化。將得到的純化DNA樣品在例如終濃度20%甘油存在下、5kPa 9kPa壓力下、霧化處理約I 5分鐘，進行DNA的片段化處理。通過這樣處理，可以有效回收500 IOOObp大小目標級分。將得到的級分利用市售的提取柱進行純化。然后將得到的級分(DNA片段)按照常規(guī)方法通過連接整合到載體DNA，得到重組DNA (堪薩斯分枝桿菌的全基因組鳥槍法文庫)。作為為此目的使用的載體DNA，當以后轉(zhuǎn)化的宿主細胞為大腸桿菌時，為例如PBS [例如pBSII sk+載體(Stratagene公司)]、pQE-TRI質(zhì)粒(Qiagen公司生產(chǎn))、pBluescript、pET、pGEM_3Z、pGEX等載體。在連接之前，可預先任意用DNA聚合酶進行處理，將DNA片段的末端進行平端處理等。然后，用得到的重組DNA轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎玫睫D(zhuǎn)化體。作為為此目的使用的宿主細胞，例如大腸桿菌(E.coli)，優(yōu)選JM109、DH5a、T0P10等。作為宿主細胞，此外也可使用質(zhì)粒和噬菌體DNA導入效率高的Competent Cell (感受態(tài)細胞)。例如大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞(Takara Bio公司生產(chǎn))等。

轉(zhuǎn)化可以根據(jù)例如D.M.Morrison 的方法(Method in Enzymology, 68, 326-331,1979)等進行。而當使用市售的感受態(tài)細胞時，可以根據(jù)該制品的說明書進行轉(zhuǎn)化。為了挑選導入整合了目標DNA片段的重組DNA的轉(zhuǎn)化體，例如利用用于轉(zhuǎn)化的載體的性質(zhì)的方法。例如，如果使用含有氨芐青霉素抗性基因的載體，通過在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上對轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)，對得到的克隆進行選擇，可以容易獲得導入整合了目標DNA片段的重組DNA的轉(zhuǎn)化體(堪薩斯分枝桿菌基因組的全基因組鳥槍法克隆)的文庫。(2)微陣列制作接下來用下述方法制作微陣列。即根據(jù)常規(guī)方法從上述(I)得到的堪薩斯分枝桿菌基因組的全基因組鳥槍法克隆純化DNA，作為PCR用樣品使用將該DNA懸浮添加到PCR用反應液中，使用適當?shù)囊颷市售的引物也可以。例如M13 PrimerMl (Takara Bio公司生產(chǎn))和引物M13 Primer RV(TakaraBio公司生產(chǎn))等]，根據(jù)常規(guī)方法進行PCR后，對得到的PCR產(chǎn)物進行純化。然后根據(jù)常規(guī)方法將PCR產(chǎn)物點印到微陣列用載玻片上，然后對該載玻片進行150mJ/cm2的UV照射，將PCR產(chǎn)物(含有來自目標的堪薩斯分枝桿菌的DNA)固定在載玻片上,做成微陣列。另外，根據(jù)需要，作為陽性對照，可使用例如對結(jié)核分枝桿菌(人型結(jié)核菌)等結(jié)核菌特異的序列的DNA或堪薩斯分枝桿菌基因組具有的序列的DNA等，作為陰性對照，使用例如來自大腸桿菌的DNA等，分別同樣地進行DNA的片段化、連接載體以及進行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，同樣進行PCR，將得到的PCR產(chǎn)物固定在載玻片上，也制作它們各自的微陣列。(3)目標基因組DNA的熒光色素標記另外，對從堪薩斯分枝桿菌菌株提取、純化的基因組DNA以及對照用基因組(例如牛型結(jié)核菌等的結(jié)核菌)DNA通過使用己氨基-UTP的間接標記法，分別用Cy3和Cy5進行
標記以例如對DeRisi研究室(www.microarrays, org)發(fā)表的方法進行改變的間接標記法為例進行說明。該方法使用帶有氨基的a UTP，通過酶延伸反應做成將該a UTP摻入到分子內(nèi)的DNA鏈。然后通過使熒光色素(琥珀酰亞胺體)化學鍵合在該氨基上，就可以對DNA進行標記了。首先對起始材料(來自堪薩斯分枝桿菌的基因組DNA和對照用基因組DNA)根據(jù)常規(guī)方法進行熱變性處理[可以使用BioPrime DNA labelingsystem(Invitrogene公司生產(chǎn))等市售試劑盒]。然后添加DTT 2iil、dATP/dCTP/dGTP的混合液、d!TP、Ha-dUTP、Klenow酶，于37°C進行3小時左右的延伸反應。將得到的反應產(chǎn)物裝到超濾柱中，以14000rpm離心4分鐘左右后，將濃縮液回收到微管中，用真空干燥離心機等使其完全干燥。然后向干燥的上述反應產(chǎn)物中加NaHCO3，混合后常溫下靜置2 3分鐘。另外，制備將Cy3 (或 Cy5)溶于 DMSO 的溶液(Cy-dye Solution Cy3、Cy-dyeSolution Cy5)。分別將該Cy-dye Solution Cy3加到使用對照用基因組DNA得到的上述反應產(chǎn)物中，而將Cy-dye Solution Cy5加到使用堪薩斯分枝桿菌基因組得到的上述反應產(chǎn)物中，于40°C溫育60分鐘左右(避光)。再分別向各個反應產(chǎn)物中加4M NH2OH(使用前制備)，攪拌后通過溫育15分鐘左右(避光)，得到各個基因組DNA的標記產(chǎn)物。然后將得到的標記產(chǎn)物加到超濾柱中，于14000rpm下離心4分鐘左右后，將濃縮液回收到微管中，用真空干燥離心機使其完全干燥。對于得到的各個干燥狀態(tài)的基因組DNA的標記產(chǎn)物，制備終濃度為0.04MTris-醋酸(pH8.1)、0.1M醋酸鉀、0.03M醋酸鎂四水合物組成的溶液，然后使干燥狀態(tài)的基因組DNA的標記產(chǎn)物懸浮混合到該溶液中。于94°C加熱處理15分鐘，可得到100個堿基 300個堿基的基因組DNA的標記產(chǎn)物片段化的生成物(Cy3標記產(chǎn)物、Cy5標記產(chǎn)物)。將各個Cy3標記產(chǎn)物和Cy5標記產(chǎn)物加到超濾柱中，于14000rpm下離心4分鐘左右后，將濃縮液回收到微管中，用真空干燥離心機等使其完全干燥。向微管中加入含有鮭精DNA(10mg/mL)0.5 ii L、甲酰胺5 ii L的40 ii L ArrayHyb雜交緩沖液(SIGMA公司生產(chǎn))，將全量調(diào)整到40 50 ill的試劑溶液(是后面使用的微陣列的蓋玻片為24X55mm大小時的組成)，將上述得到的Cy3標記產(chǎn)物和Cy5標記產(chǎn)物在同一溶液中懸浮混合后，于95°C溫育5分鐘，制備Cy3Cy5標記產(chǎn)物溶液。然后在用于接下來的
(4)的微陣列雜交之前保存在70°C。(4)微陣列雜交(在陣列上的DNA-DNA雜交)將上述(3)制備的Cy3Cy5標記產(chǎn)物溶液都加到上述⑵制作的微陣列(DNA芯片)上，蓋上蓋玻片，但不要進入氣泡。將它裝到雜交盒中，密閉于鋪有蒸餾水弄濕的無塵紙(kimtowel)等的Tupper等容器內(nèi)，于65°C反應8小時以上(避光)，進行雜交。雜交后，通過于室溫下將微陣列連同蓋玻片一起浸入到2XSSC-0.1% SDS溶液中，于溶液中輕輕地搖動微陣列，使蓋玻片脫離。用1XSSC、0.03% SDS溶液(600C )清洗10分鐘，用0.2 X SSC溶液(42°C )清洗10分鐘，用0.05 X SSC溶液(室溫)清洗10分鐘后，將微陣列迅速移到新的干的管架中，立刻于SOOrpm下離心5分鐘使其干燥。(5)熒光強度的測定；從信號檢測至數(shù)量化使用熒光解讀掃描儀，測定上述(4)中的微陣列雜交處理的微陣列上的熒光強度，測定Cy3和Cy5的2通道的熒光強度，得到熒光檢測數(shù)據(jù)。熒光信號的數(shù)量化使用市售的DNA芯片發(fā)現(xiàn)圖像解析軟件等，按照軟件的操作步驟，可進行點自動識別、背景計算、熒光強度比的規(guī)一化。雜交中使用的Cy5標記產(chǎn)物是對來自堪薩斯分枝桿菌的基因組進行了標記的產(chǎn)物，Cy3標記產(chǎn)物是對對照用基因組DNA進行了標記的產(chǎn)物。因此，測定Cy3與Cy5的各個熒光強度的結(jié)果，如果Cy5的熒光一方明顯被檢測到，就意味著對象的微陣列的PCR產(chǎn)物與堪薩斯分枝桿菌雜交了，判斷為對堪薩斯分枝桿菌的特異性高。另一方面Cy3的熒光一方如果明顯被檢測到的話，意味著對象的微陣列的PCR產(chǎn)物與對照用基因組DNA雜交了，而有時檢測到同樣程度的強度的Cy3和Cy5的熒光，或什么也沒有檢測到時，判斷為對堪薩斯分枝桿菌的特異性低。另外如果在微陣列上點加陽性對照(例如對結(jié)核分枝桿菌特異的DNA片段，對堪薩斯分枝桿菌特異的DNA片段等)和陰性對照(例如來自大腸桿菌的DNA片段等)，測定各自的Cy3Cy5熒光強度，如果看到其熒光強度的傾向，可以作為熒光掃描測定中的I個數(shù)據(jù)評價基準。另外，為了篩選用于堪薩斯分枝桿菌特異檢測的候補序列，可以DNA芯片上檢測到的Cy3/Cy5的突光強度比(Ratio)為基礎,做成散點圖(scatterplot),像下面那樣進行解析。在解 析中，使用的陽性對照序列中，對堪薩斯分枝桿菌特異的DNA片段的Cy3/Cy5比的數(shù)值成為用于特異性評價的有用的基準值。即，從進行篩選的候補中選擇根據(jù)Cy3/Cy5比的數(shù)值解析的結(jié)果得到的顯著的堪薩斯分枝桿菌特異性信號(Cy5的熒光強度強時)，并且與上述對堪薩斯分枝桿菌特異的陽性對照點相比，比率數(shù)值大的克隆。再根據(jù)利用例如ABI PRISM310毛細管測序儀(Applied bio公司)等儀器的常規(guī)方法，確定得到的候補克隆的堿基序列。作為本發(fā)明涉及的堪薩斯分枝桿菌檢測用引物，如含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的引物(以下有時記為本發(fā)明的引物)。另外，本發(fā)明的引物考慮要適合PCR、核酸雜交等條件，考慮解鏈溫度(Tm值)等因素后從含有序列號I 4所示的核酸序列的部分或者全部的寡核苷酸、或含有其互補序列的部分或者全部的寡核苷酸中選擇適當區(qū)域的適當長度后使用，優(yōu)選為維持作為引物序列的特異性所必需的堿基數(shù)的具有10 50個堿基、更優(yōu)選10 35個堿基、更優(yōu)選18 25個堿基長度的寡核苷酸。引物的設計方法可以使用引物設計一般使用的軟件，例如引物設計用的Web toolPrimer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research.)等進行設計?？捎糜诒景l(fā)明的引物的含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所不的核酸序列的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸(本發(fā)明的寡核苷酸)的具體例子與上述的本發(fā)明的寡核苷酸的說明中所述相同。作為象這樣的引物的具體例子，例如含有序列號5 52所示的核酸序列的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部，并且含有與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸。作為本發(fā)明的引物更優(yōu)選的具體例子，如含有選自序列號5 52所示的核酸序列中的序列的引物、或含有與選自序列號5 52所示的核酸序列中的序列互補的序列的引物。其中，如含有選自序列號5、6、13 16、27 30、41 44所示的核酸序列中的序列的引物，或含有與選自序列號5、6、13 16、27 30、41 44所示的核酸序列中的序列互補的序列的引物。 而具有序列號5 12所示的核酸序列的引物是以序列號I所示的核酸序列為基礎設計的引物。具有序列號13 26所示的核酸序列的引物是以序列號2所示的核酸序列基礎設計的引物。具有序列號27 40所示的核酸序列的引物是以序列號3所示的核酸序列為基礎設計的引物。具有序列號41 52所示的核酸序列的引物是以序列號4所示的核酸序列為基礎設計的引物。圖1中，序列號I所示的核酸序列上的具有序列號5和6所示的核酸序列的引物的所在位置分別以lc_platel_Fwl和lc_platel_Rvl用箭頭標出。圖2中，序列號2所示的核酸序列上的具有序列號13、14、15和16所示的核酸序列的引物的所在位置分別以 6c_platel_Fwl、6c_platel_Rvl、6c_platel_Fw2、6c_platel_Rv2用箭頭標出。圖3中，序列號3所示的核酸序列上的具有序列號27、28、29和30所示的核酸序列的引物的所在位置分別以 8d_platel_Fwl、8d_platel_Rvl、8d_platel_Fw2、8d_platel_Rv2用箭頭標出。圖4中，序列號4所示的核酸序列上的具有序列號41、42、43和44所示的核酸序列的引物的所在位置分別以 9c_platel_Fwl、9c_platel_Rvl、9c_platel_Fw2、9c_platel_Rv2用箭頭標出。另外，序列號I所示的核酸序列上的具有序列號7 12所示的核酸序列的引物的所在部位分別表示如下。序列號I (lc_platel_Fw3):33 位 51 位、序列號8 (lc_platel_Fw4):212 位 231 位、序列號9 (lc_platel_Fw5):315 位 334 位、序列號10 (lc_platel_Rv3):185 位 204 位、序列號11 (lc_platel_Rv4):411 位 430 位、序列號12 (lc_platel_Rv5):461 位 481 位。序列號2所示的堿基序列上的具有序列號17 26所示的核酸序列的引物的所在部位分別如下所示。序列號17 (6c_platel_Fw3):4 位 21 位、序列號18 (6c_platel_Fw4):48 位 67 位、
序列號19 (6cplatel_Fw5):229 位 247 位、序列號20 (6c—platel—Fw6):279 位 296 位、序列號21 (6c_platel_Fw7):380 位 399 位、序列號22 (6c—platel—Rv3):166 位 184 位、序列號23 (6c—platel—Rv4): 195 位 214 位、序列號24 (6c—platel—Rv5):368 位 387 位、序列號25 (6c—platel—Rv6):428 位 445 位、序列號26 (6c_platel_Rv7):523 位 542 位。序列號3所示的堿基序列上的具有序列號31 40所示的核酸序列的引物的所在部位分別如下所示。序列號31 (8d—platel—Fw3):5 位 22 位、序列號32 (8d—platel—Fw4):54 位 72 位、序列號33 (8d—platel—Fw5):207 位 226 位、序列號34 (8d—platel—Fw6):289 位 308 位、序列號35 (8d—platel—Fw7):472 位 490 位、

序列號36 (8d—platel—Rv3):151 位 169 位、序列號37(8d—platel—Rv4):220 位 239 位、序列號38 (8d—platel—Rv5):335 位 353 位、序列號39 (8d—platel—Rv6):408 位 427 位、序列號40 (8d_platel_Rv7):616 位 635 位。序列號4所示的堿基序列上的具有序列號45 52所示的核酸序列的引物的所在部位分別如下所示。序列號45 (9c—platel—Fw3):17 位 36 位、序列號46 (9c—platel—Fw4):117 位 135 位、序列號47 (9c—platel—Fw5):405 位 424 位、序列號48 (9c—platel—Fw6):492 位 512 位、序列號49 (9c—platel—Rv3):182 位 201 位、序列號50 (9c—platel—Rv4):263 位 281 位、序列號51 (9c—platel—Rv5):528 位 547 位、序列號52 (9c_platel_Rv6):654 位 673 位。其中上述的序列號后的0內(nèi)表示本發(fā)明中命名的引物的名稱。獲得本發(fā)明的引物的方法如上述獲得本發(fā)明的核苷酸的方法中所述那樣。另外，本發(fā)明的引物也可以用標記物質(zhì)標記。作為用標記物質(zhì)對本發(fā)明的引物進行標記中使用的標記物質(zhì)，只要是放射性同位素或酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物素等眾所周知的標記物質(zhì)，無論哪一種都可以使用。例如，作為放射性同位素，如32p、33p、35S等，作為酶，如堿性磷酸酶、西洋辣根過氧化物酶等，作為焚光物質(zhì)，如Cyanine Dye系的Cy3、Cy5 (Amasham Bioscience公司)、焚光素等，作為發(fā)光物質(zhì)，如含有Acridinium Ester的化學發(fā)光試劑等。當本發(fā)明的引物用放射性同位素標記時，如在合成引物時通過摻入用放射性同位素標記的核苷酸而標記引物的方法，和合成引物后用放射性同位素標記的方法等。具體來說，如一般常用的隨機引物法、切口平移法、通過T4多核苷酸激酶進行的5'-末端標記法、使用末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酰酶的3'-末端標記法、RNA標記法等。當本發(fā)明的引物用酶標記時，可以使用使堿性磷酸酶、西洋辣根過氧化物酶等酶分子與欲進行標記的引物直接共價結(jié)合等該領域中常規(guī)方法的直接標記法。當通過熒光物質(zhì)進行標記時，例如可以通過該領域中常用方法的標記手法將熒光素標記的核苷酸摻入到引物中。另外，用帶有連接臂的核苷酸作為序列的寡核苷酸的一員進行替換的方法(例如、參照Nucleic AcidsRes.,1986年,第14卷,p.6115)也可以將核苷酸用熒光物質(zhì)進行標記。此時，也有將5位帶有連接臂的尿苷通過特開昭60-500717號公報報道的合成法由脫氧尿苷化學合成，在上述寡核苷酸鏈中導入熒光物質(zhì)的方法。用發(fā)光物質(zhì)標記的方法以及用生物素標記的方法可以按照通常該領域進行的對核苷酸進行發(fā)光標記或生物素標記的常法進行。作為本發(fā)明涉及的堪薩斯分枝桿菌檢測用探針，例如含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部、并且含有與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的探針(以下有時稱為本發(fā)明的探針)。在本發(fā)明的探針中使用的含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部、并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸(本發(fā)明的寡核苷酸)的具體例子與上述的本發(fā)明的寡核苷酸的說明中所述的例子相同。本發(fā)明的探針在符合PCR(包括實時PCR)、核酸雜交等條件下，可以由含有序列號I 4所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸，或含有其互補序列的部分或全部的寡核苷酸計算解 鏈溫度(Tm值)等，選用適當區(qū)域的適當長度。但是，如果要使探針具有充分的特異性，希望在考慮為維持作為探針序列的特異性所必需的堿基數(shù)之后進行設計。例如，作為在核酸雜交法(例如，Southern雜交等)等使用的探針，如10 700個堿基、優(yōu)選具有100 600個堿基、更優(yōu)選200 500個堿基長度的探針。例如，作為實時PCR擴增體系(例如TaqMan 法、Molecular Beacon法等)等中使用的探針，如具有10 50個堿基、優(yōu)選15 40個堿基、更優(yōu)選20 30個堿基長度的探針。作為象這樣的探針的具體例子，如可從含有序列號5 79所示的核酸序列的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部、并且含有與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的探針中選擇。作為本發(fā)明的探針的優(yōu)選的具體例子，如含有選自序列號5 79所示的核酸序列中的序列的探針。其中優(yōu)選含有選自序列號5、6、13 16、27 30、41 44、53、57 59、65 67、73 75所不的核酸序列中的序列的探針。特別優(yōu)選含有選自序列號53、57 59、65 67、73 75所示的核酸序列中的序列的探針。而序列號53 79所示的核酸序列是通過使用本發(fā)明的引物的PCR擴增的核酸序列。表I 一并給出了正向引物和反向引物的組合、通過使用這些組合的PCR擴增的核酸序列的序列號。例如，序列號53所示的核酸序列是通過使用序列號5所示的核酸序列的寡核苷酸作為正向引物，序列號6所示的核酸序列的寡核苷酸作為反向引物，通過PCR擴增的序列。表1
正向引* S向引*被3的讀師S向引*被g的
565331__36__68
7__10__54__32__37__69
8__11__55__33__38__70
9__1_2__56__34__39__71
13__14__57__35__40__72
15__16__58__41__42__73
13__16__59__43__44__74
17__22__60__41__44__75
18__23__61__45__49__76
1924__62__46__5077
20__25__63__47__51__78
2126__6448__52__79
27__28__65
29__30__66獲得本發(fā)明的探針的方法如上述獲得本發(fā)明的核苷酸的方法中所述。本發(fā)明的探針可以用標記物質(zhì)進行標記。作為用于對本發(fā)明的探針用標記物質(zhì)進行標記的標記物質(zhì)，只要是放射性同位素或酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物素等眾所周知的標記物質(zhì)，可以使用任一個。對本發(fā)明的探針進行標記的標記物質(zhì)的具體例子以及標記方法就像本發(fā)明的引物的標記方法說明中所述。另外，作為下述的實時PCR檢測法中使用的標記探針，如通過用在實時檢測法中通常使用的標識物質(zhì)對本發(fā)明的探針進行了標記的探針。例如，5'末端使用報告熒光物質(zhì)(羧基熒光素(FAM)、六氯熒光素(HEX)、四氯熒光素(TET)等)標記的，3'末端使用猝滅劑色素[(例如羧基四甲基若丹明(TAMRA)等熒光物質(zhì)、Black Hole Quencher色素(BHQ)，4-((4-二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(DABCYL)等非熒光物質(zhì)]標記的本發(fā)明的探針。作為本發(fā)明涉及的堪薩斯分枝桿菌檢測中使用的樣品，如喀痰、血液、咽頭粘液、胃液、支氣管洗液、經(jīng)支氣管采取物、胸水等穿刺液、尿、膿等各種臨床材料。另外也可以是從檢體分離、培養(yǎng)的培養(yǎng)菌體、從這些菌體分離、純化的核酸、或通過核酸擴增檢測系統(tǒng)等擴增的核酸。為了從上述樣品中提取、純化DNA，可以根據(jù)從檢體提取抗酸菌(結(jié)核菌)DNA中使用的常用方法進行。
如以菌體作為樣品時，例如通過SDS等表面活性劑、硫氰酸胍(GTC)等蛋白變性劑對菌體進行處理，破壞指定結(jié)核菌的膜結(jié)構(gòu)的方法、用玻璃珠等對菌體進行物理破碎的方法等。以嘻痰作為樣品時,作為前處理,可以通過美國疾病管理預防中心(Centers forDisease Control and Prevention,簡稱 CDC)推薦的 NALC (N_ 乙酸 _L_ 半胱氨酸)-NaOH法(Kent PT, Kubica GP, Pubric HealthMycobacteriology,A Guide for the Level IIILaboratory, U.S.Departmentof Health and Human Services, Public Health Service,Center for DiseaseControl, Atlanta, U.S.A.，1985 年，p.31-55)進行檢體的勻衆(zhòng)化。然后，可以通過一般的DNA制備法(酚/氯仿提取、乙醇沉淀法等，Rapid andsimple method for purification of nucleic acids,J.Clin.Microbiol.,1990 年 3 月；28(3),495-503, Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, vander Noordaa J)進 行DNA的提取和純化。對于從檢體中分離、培養(yǎng)的培養(yǎng)菌體用作檢測堪薩斯分枝桿菌的樣品時的例子，有例如收集小川培養(yǎng)基上的菌落，懸浮在滅菌蒸餾水中，離心分離收集菌體后，再懸浮在蒸餾水中，高壓滅菌釜處理后，經(jīng)菌體的粉碎處理(通過玻璃珠進行物理破碎等)，再離心分離回收上清。從所得的上清中可以提取純化DNA。對于DNA的提取、純化，由于市售有各種試劑盒，因此可以使用這些試劑盒進行，也可以根據(jù)該領域中的常規(guī)方法(例如，酚/氯仿提取法、使用乙醇或異丙醇等使沉淀的方法等)進行。例如，可以使用Qiagen公司生產(chǎn)的離子交換樹脂類型的DNA提取純化試劑盒Genomic-tip等進行DNA的提取、純化。作為本發(fā)明涉及的堪薩斯分枝桿菌的檢測方法，例如(A)將含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4中所述的核酸序列的部分或全部，或含有其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸(本發(fā)明的寡核苷酸)作為引物使用的方法。(B)將本發(fā)明的寡核苷酸經(jīng)標記物質(zhì)標記后的產(chǎn)物作為標記探針使用的方法等。以下分別就各個方法進行說明。(A)將本發(fā)明的寡核苷酸作為引物使用的方法作為(A)的方法，如使用本發(fā)明的引物，以樣品中的核酸作為模板進行核酸擴增反應，對得到的引物延伸物進行檢測的方法，具體的例子，如使用本發(fā)明的引物與樣品中的核酸雜交，通過DNA聚合酶等進行核酸擴增[例如PCR;專利文獻3、LAMP (Loop-mediatedIsothermalAmplif i cat ion)法(Tsugunori Notomi 等人，Nucleic Acid Res.,28, e63,2000)> ICAN(Isothermal and Chimeric primer-1nitiated Amplification ofNucleicacids)法(臨床病理，51 (11), 1061-1067, 2003 年 11 月)、LCR(ligasechain reaction)法(特開平 4-211399 號)、SDA(strand displacementamplification)法(特開平 8-19394號)]，使引物延伸的方法，由此可使堪薩斯分枝桿菌的核酸序列的特定區(qū)域的序列擴增，通過測定得到的引物延伸物可以檢測堪薩斯分枝桿菌。PCR中使用的本發(fā)明的引物的具體例子如上述那樣的例子。優(yōu)選的具體例子，作為正向引物的是含有序列號5、7 9、13、15、17 21、27、29、31 35、41、43、45 48所示的核酸序列的部分或全部、或者含有其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸，作為反向引物的是如含有序列號6、10 12、14、16、22 26、28、30、36 40、42、44、49 52所示的核酸序列的部分或
全部、或者含有其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸。更優(yōu)選的具體例子，作為正向引物的是如含有選自序列號5、7 9、13、15、17
21、27、29、31 35、41、43、45 48所示的核酸序列中的序列的引物，作為反向引物的是如含有選自序列號5,10 12、14、16、22 26、28、30、36 40、42、44、49 52所示的核酸序列中的序列的引物。更優(yōu)選的具體例子，作為正向引物的是如含有選自序列號5、13、15、27、29、41、43所示的核酸序列的序列的引物，作為反向引物的是如選自序列號6、14、16、28、30、42、44所示的核酸序列中的序列的引物。作為優(yōu)選的正向引物和反向引物的組合，如上述表I給出的組合。其中特別優(yōu)選的正向引物和反向引物的組合，如(I)正向引物是具有序列號5所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物是具有序列號6所示的核酸序列的寡核苷酸的組合，(2)正向引物是具有序列號13所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物是具有序列號14所示的核酸序列的寡核苷酸的組合，(3)正向引物是具有序列號15所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物是具有序列號16所示的核酸序列的寡核苷酸的組合，(4)正 向引物是具有序列號13所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物是具有序列號16所示的核酸序列的寡核苷酸的組合，(5)正向引物是具有序列號27所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物是具有序列號28所示的核酸序列的寡核苷酸的組合，(6)正向引物是具有序列號29所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物是具有序列號30所示的核酸序列的寡核苷酸的組合，(7)正向引物是具有序列號27所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物是具有序列號30所示的核酸序列的寡核苷酸的組合，(8)正向引物是具有序列號41所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物是具有序列號42所示的核酸序列的寡核苷酸的組合，(9)正向引物是具有序列號43所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物是具有序列號44所示的核酸序列的寡核苷酸的組合，(10)正向引物是具有序列號41所示的核酸序列的寡核苷酸，反向引物是具有序列號44所示的核酸序列的寡核苷酸的組合，等等。使用上述引物的PCR的條件、操作法等根據(jù)該領域中通常使用的常用方法進行。作為對得到的引物延伸物進行測定的方法，如(A-1)進行聚合酶鏈反應后，對得到的引物延伸物進行電泳，根據(jù)其結(jié)果進行測定的方法，(A-2)通過實時PCR法進行的方法，(A-3)進行使用標記引物的PCR，對得到的引物延伸物的標記進行測定的方法等。以下就各個方法進行說明。(A-1)進行聚合酶鏈反應后，對得到的引物延伸物進行電泳，根據(jù)其結(jié)果進行測定的方法
作為該方法，如“以包括如下步驟為特征的堪薩斯分枝桿菌的檢測方法:(i)作為引物(本發(fā)明的引物)使用含有序列號1、序列號2、序列號3、或序列號4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部、并且與堪薩斯分枝桿菌的基因的核酸序列雜交的寡核苷酸，以樣品中的核酸作為模板進行PCR，(ii)對上述(i)得到的引物延伸物進行電泳，根據(jù)該結(jié)果檢測堪薩斯分枝桿菌”。作為進行電泳，根據(jù)其結(jié)果檢測堪薩斯分枝桿菌的方法，例如(A-1-1)通過確認作為目標的寡核苷酸大小(堿基對數(shù))的引物延伸物級分進行判定的方法、(A-1-2)通過使用標記探針的雜交進行判定的方法等。電泳法的條件、操作方法等可以根據(jù)該領域中通常使用的常用方法進行。(A-1-1)通過確認作為目標的堿基對數(shù)的引物延伸物級分進行判定的方法上述的通過確認作為目標寡核苷酸大小(堿基對數(shù))的引物延伸物級分進行判定的方法，例如，首先進行PCR，對得到的引物延伸物進行電泳。由在PCR使用的正向引物和反向引物對擴增產(chǎn)物的大小(堿基對數(shù))進行預測，預測得到的泳動級分的大小是否與擴增產(chǎn)物相當通過常用方法進行確認。例如，將得到的級分用溴乙錠等染色后，通過肉眼判斷核酸種類的方法由該擴增產(chǎn)物的特征的大小進行檢測等方法。作為通過(A-1-1)的方法進行的具體的判定方法，例如以下的方法。(1)作為正向引物使用具有序列號5所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號6所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將167堿基對的級分或確認具有序列號56所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(2)作為正向引物使用具有序列號7所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號10所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號54所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(3)作為正向引物使用具有序列號8所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號11所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號55所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(4)作為正向引物使用具有序列號9所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號12所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號56所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(5)作為正向引物使用具有序列號13所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號14所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將216個堿基對的級分或確認具有序列號57所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(6)作為正向引物使用具有序列號15所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號16所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將168個堿基對的級分或確認具有序列號58所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(7)作為正向引物使用具有序列號13所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號16所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將336個堿基對的級分或確認具有序列號59所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(8)作為正向引物使用具有序列號17所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號22所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號60所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(9)作為正向引物使用具有序列號18所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號23所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號61所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(10)作為正向引物使用具有序列號19所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號24所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號62所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(11)作為正向引物使用具有序列號20所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號25所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號63所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(12)作為正向引物使用具有序列號21所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號26所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號64所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(13)作為正向引物使用具有序列號27所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號28所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，就得到的引物延伸物進行電泳，將156個堿基對的級分或確認具有序列號65所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。

(14)作為正向引物使用具有序列號29所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號30所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，就得到的引物延伸物進行電泳，將156個堿基對的級分或確認具有序列號66所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(15)作為正向引物使用具有序列號27所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號30所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將358個堿基對的級分或確認具有序列號67所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(16)作為正向引物使用具有序列號31所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號36所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號68所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(17)作為正向引物使用具有序列號32所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號37所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號69所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(18)作為正向引物使用具有序列號33所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號38所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號70所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。
(19)作為正向引物使用具有序列號34所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號39所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號71所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(20)作為正向引物使用具有序列號35所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號40所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號72所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(21)作為正向引物使用具有序列號41所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號42所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將163個堿基對的級分或確認具有序列號73所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(22)作為正向引物使用具有序列號43所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號44所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將158個堿基對的級分或確認具有序列號74所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(23)作為正向引物使用具有序列號41所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號44所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將387個堿基對的級分或確認具有序列號75所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(24)作為正向引物使用具有序列號45所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號49所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號76所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(25)作為正向引物使用具有序列號46所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號5 0所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號77所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(26)作為正向引物使用具有序列號47所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號51所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號78所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。(27)作為正向引物使用具有序列號48所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號52所示的核酸序列的寡核苷酸進行PCR后，對得到的引物延伸物進行電泳，將確認具有序列號79所示的核酸序列的寡核苷酸的級分的產(chǎn)物判定為陽性的方法。上述方法中，優(yōu)選(I)、(5) (7)、(13) (15)、(21) (23)的方法。(A-1-2)通過使用標記探針的雜交進行判定的方法作為通過使用標記探針的雜交進行判定的方法，例如將電泳后得到的電泳級分與用標記物質(zhì)標記的本發(fā)明探針的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記確認與該標記探針雜交的級分是否存在來判定陽性的方法。使用的探針和標記探針的標記物質(zhì)的具體例子、以及探針的標記方法如上所述。作為通過(A-1-2)的方法進行的具體的判定方法，例如下述的方法。(I)作為正向引物使用具有序列號5所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號6所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號53所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(2)作為正向引物使用具有序列號7所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號10所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號54所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(3)作為正向引物使用具有序列號8所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號11所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號55所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(4)作為正向引物使用具有序列號9所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號12所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號56所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(5)作為正向引物使用具有序列號13所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號14所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號57所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(6)作為正向引物使 用具有序列號15所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號16所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號58所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(7)作為正向引物使用具有序列號13所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號16所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號59所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(8)作為正向引物使用具有序列號17所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號22所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號60所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(9)作為正向引物使用具有序列號18所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號23所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號61所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(10)作為正向引物使用具有序列號19所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號24所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號62所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(11)作為正向引物使用具有序列號20所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號25所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號63所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的 標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(12)作為正向引物使用具有序列號21所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號26所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號64所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(13)作為正向引物使用具有序列號27所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號28所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號65所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(14)作為正向引物使用具有序列號29所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號30所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號66所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(15)作為正向引物使用具有序列號27所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號30所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號67所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(16)作為正向引物使用具有序列號31所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號36所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號68所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。
(17)作為正向引物使用具有序列號32所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號37所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號69所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(18)作為正向引物使用具有序列號33所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號38所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號70所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(19)作為正向引物使用具有序列號34所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號39所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號71所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(20)作為正向引物使用具有序列號35所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號40所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號72所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(21)作為正向引物使用具有序列號41所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號42所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號73所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。

(22)作為正向引物使用具有序列號43所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號44所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號74所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(23)作為正向引物使用具有序列號41所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號44所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號75所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(24)作為正向引物使用具有序列號45所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號49所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號76所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(25)作為正向引物使用具有序列號46所不的核酸序列的寡核苷酸,作為反向引物使用具有序列號50所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號77所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(26)作為正向引物使用具有序列號47所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號51所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號78所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。(27)作為正向引物使用具有序列號48所示的核酸序列的寡核苷酸，作為反向引物使用具有序列號52所示的核酸序列的寡核苷酸，進行PCR后，對于得到的引物延伸物進行電泳，將得到的級分與用標記物質(zhì)標記的具有含有序列號79所示的核酸序列的部分或全部的核酸序列的寡核苷酸的標記探針進行雜交，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性的方法。上述方法中優(yōu)選(I)、(5) (7)、(13) (15)、(21) (23)的方法。若對于本發(fā)明涉及的堪薩斯分枝桿菌的檢測方法通過以例如作為正向引物使用具有序列號5所示的核酸序列，作為反向引物使用具有序列號6所示的核酸序列的寡核苷酸的PCR、以及電泳后，確認目標堿基對數(shù)的引物延伸物級分的方法進行檢測的情況(上述的(A-1-1)中的(I)的方法)為例進行詳細說明，如下所述。首先根據(jù)上述的方法，從要檢測有無堪薩斯分枝桿菌的樣品中得到純化DNA樣品。然后，用上述方法從本發(fā) 明涉及的核苷酸使用DNA合成儀根據(jù)亞磷酰胺法合成具有序列號5表示的序列的寡核苷酸(以下記為Ic_platel_FWl。)以及具有序列號6所示的核酸序列的寡核苷酸(以下記為Ic_platel_RVl)。制備含有Ic_platel_Fwl 以及 Ic_platel_Rvl、l.0 4.0mM MgCl2、80mM KC1、500 u g/ml BSA、0.1 %膽酸鈉、0.005 0.2%聚氧乙烯辛基酚醚、各0.1 0.6mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 10 80 單位 /ml 的 Taq DNA 聚合酶的 IOmM Tris-HCl (pH8.9)緩沖液，作為PCR用反應液。將純化DNA樣品添加到PCR用反應液中作為PCR用樣品使用，通過DNA熱循環(huán)儀進行20-40個循環(huán)的PCR。將得到的PCR后的反應液進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。然后進行溴乙錠染色后，檢測紫外線下的熒光。而分子量標記也與反應液同時電泳，通過相對遷移率的比較，算出檢測的DNA片段的長度?？深A測在作為正向引物使用Ic_platel_Fwl、以及作為反向引物使用Ic_platel_Rvl的PCR中，堪薩斯分枝桿菌的核酸序列中的167個堿基對的DNA片段(序列號53)被復制。其中，被確認的167個堿基對的熒光帶的產(chǎn)物判定為陽性。(A-2)利用實時PCR法的方法在本發(fā)明的堪薩斯分枝桿菌的檢測方法中，也可以使用實時擴增檢測系統(tǒng)(參照例如美國專利第5210015號、美國專利第5538848號所述)。
作為利用實時擴增檢測系統(tǒng)的檢測系統(tǒng)的例子，例如實時PCR檢測系統(tǒng)。在本發(fā)明的堪薩斯分枝桿菌的檢測方法中可以使用例如TaqMan 實時PCR法(例如參照美國專利第5538848號所述)、MGB Eclipse ProbeSystem法(例如參照美國專利第 5，801，155 號所述)、Molecular BeaconsProbe Technology 法(例如參照美國專利第 5925517 號所述)、LUXFluorogenic Primer 法(Invitrogen 公司)、Quenchingprobe-PCR(QP)法(例如參照美國專利第6，492，121號所述)等各種實時PCR檢測法。更具體地講，通過使用5'末端用例如FAM等熒光色素(報告分子)、3'末端用例如TAMRA等猝滅色素標記的探針的實時PCR法(例如參照美國專利第5538848號所述)，可以高靈敏度并且定量地檢測目標的微量DNA。即，用含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部、并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為引物(本發(fā)明的引物)，使用含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或者全部或其互補序列的部分或者全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸(本發(fā)明的寡核苷酸)的5'末端用報告突光色素標記的、3'末端用猝滅色素標記的寡核苷酸作為標記探針，用樣品中的核酸作為模板進行PCR，通過檢測對從該標記探針游離的標記物質(zhì)來進行。上述的實時PCR法的原理如下所述。S卩，使用5'末端用熒光色素(報告分子)、3'末端用猝滅色素標記的與目的基因的特定區(qū)域雜交的寡核苷酸探針。該探針在通常的狀態(tài)下報告的熒光被猝滅色素抑制。在使該熒光探針完全與目的基因雜交的狀態(tài)下，由其外側(cè)使用DNA聚合酶進行PCR。一旦DNA聚合酶推進延伸反應，其外切核酸酶活性催化熒光探針從5'端水解，報告色素游離，發(fā)熒光。實時PCR法通過對該熒光強度進行實時監(jiān)測，可以正確地定量模板DNA的初期量。作為本發(fā) 明涉及的實時PCR檢測系統(tǒng)中使用的5'末端用熒光色素(報告分子)、3'末端用猝滅色素標記的探針中使用的探針，可以是上述的本發(fā)明的探針。實際上，可以使用具有通過選擇的正向引物和反向引物的組合進行實時PCR時得到的擴增產(chǎn)物的堿基序列的探針、或具有進一步由該序列設計的堿基序列的探針。例如，在使用序列號5和序列號6的引物進行實時PCR時使用的探針如經(jīng)該實時PCR擴增具有預想的序列號53的堿基序列的核苷酸，或具有由序列號53的堿基序列設計的序列(例如序列號80)的寡核苷酸。而作為對Y末端進行標記的報告熒光物質(zhì)，如FAM、HEX、TET、Cy5、VIC等，其中優(yōu)選FAM。作為對3'末端進行標記的猝滅色素，如TAMRA等熒光物質(zhì)、BHQ (例如BHQ2)、DABCYL等非熒光物質(zhì)，其中優(yōu)選TAMRA。作為本發(fā)明涉及的實時PCR檢測系統(tǒng)中使用的正向引物和反向引物，如上述PCR法中使用的引物，其中優(yōu)選的具體例子以及優(yōu)選的組合如上所述。實時PCR檢測系統(tǒng)中使用的其它的脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、DNA聚合酶等試劑可以使用通常實時PCR中使用的試劑，實時PCR的方法除了使用本發(fā)明的引物和探針以外，可根據(jù)實時PCR的一般程序進行。就利用本發(fā)明涉及的實時PCR檢測系統(tǒng)的堪薩斯分枝桿菌的檢測方法的一個例子說明如下。首先根據(jù)上述的方法，從要檢測的堪薩斯分枝桿菌的樣品中獲得純化DNA樣品。然后使用DNA合成儀，通過亞磷酰胺法合成序列號5所示的序列(IC_platel_FWl)、序列號6所示的序列(Ic_platel_Rvl)的寡核苷酸。根據(jù)作為引物使用Ic_platel_Fwl和Ic_platel_Rvl經(jīng)PCR擴增的序列號53的核酸序列，設計用作探針的序列(例如序列號80)，合成該序列的寡核苷酸。通過常規(guī)方法在該寡核苷酸的5'末端結(jié)合報告色素FAM,在3’末端結(jié)合報告粹滅物TAMRA,得到突光標記探針。使用上述制備的Ic_platel_Fwl作為正向引物，Ic_platel_Rvl作為反向引物，例如像下述那樣進行實時PCR。即，制備含有各I μΜ的引物Ic_platel_Fwl、以及引物Ic_platel_Rvl、100 IOOOnM 的熒光標記探針、1.0 4.0mM MgCl2、80mM KCl、500yg/ml BSA、0.1% 膽酸鈉、0.005 0.2% TritonX-100、各 0.2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP、10 80 單位 /ml 的 TaqDNA聚合酶的IOmMTris-HCl緩沖液(pH8.9)，作為反應液。將向反應液20 μ I中加有純化DNA樣品Ing的溶液作為PCR用樣品，然后加入到96孔反應板的孔中，使用適當?shù)膶崟rPCR檢測儀器等進行實時PCR。反應反復進行30 50個循環(huán)，每I循環(huán)都測定報告色素的發(fā)光量。在堪薩斯分枝桿菌的判定中，測定到報告色素的發(fā)光量的情況可判定為堪薩斯分枝桿菌陽性。在實時PCR法中由于可做成校正曲線，所以可得到樣品中堪薩斯分枝桿菌的基因組DNA數(shù)(拷貝數(shù))。而該數(shù)值與堪薩斯分枝桿菌的數(shù)成比例，所以也可得到樣品中的堪薩斯分枝桿菌的數(shù)。校正曲線的作成方法可以是根據(jù)實時PCR法通常運用的常規(guī)方法。例如，作為標準使用拷貝數(shù)已知的堪薩斯分枝桿菌的基因組DNA樣品，制備稀釋系列濃度(拷貝數(shù))的PCR用DNA樣品。然后使用各稀釋系列的PCR用DNA樣品根據(jù)上述方法進行實時PCR，測定報告色素的發(fā)光量。對于各稀釋系列的每個PCR用DNA樣品，做成將測定的發(fā)光量的測定值(Rn、y軸)對PCR的 各循環(huán)數(shù)(x軸)作圖的擴增曲線。然后，選擇發(fā)光量指數(shù)函數(shù)擴增的Rn部分，畫臨界線(Threshold Iine(Th))。將Th與各PCR用DNA樣品的擴增曲線交叉的點作為臨界循環(huán)(Threshold cycle (Ct))值。然后將Ct值(y軸)對所用的各PCR用DNA樣品的拷貝數(shù)的對數(shù)值(X軸)作圖，可將相對于各Ct得到的近似曲線作為校正曲線。為了對樣品中的堪薩斯分枝桿菌的基因組DNA數(shù)(拷貝數(shù))進行定量，首先從要檢測堪薩斯分枝桿菌的樣品中分離純化DNA后，對得到的DNA樣品進行實時PCR，同樣做成擴增曲線。得到做成校正曲線時的Th與得到的擴增曲線交叉的Ct值。通過將該Ct值應用于校正曲線，由此可以獲得樣品中的堪薩斯分枝桿菌的基因組DNA量(拷貝數(shù))。本發(fā)明在核酸擴增步驟中可以利用RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測法。例如，NASBA(基于核酸序列的擴增)法(日本專利第2650159號)、3SR(自我維持的序列擴增)法(特公平7-114718號)、TAS (基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng))法(特表平2-500565號:國際公開W088/10315號)、TMA(轉(zhuǎn)錄介導的擴增)法(特開平11-46778號)等，其中利用逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶的協(xié)同作用(在逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶協(xié)同作用那樣的條件下反應)的特定溫度核酸擴增法適于測定系統(tǒng)的自動化。(A-3)對使用標記引物進行PCR得到的引物延伸物的標記進行測定的方法
作為該方法，如使用將本發(fā)明的引物用上述方法標記的標記引物，以樣品中的核酸作為模板進行PCR，通過測定得到的引物延伸物的標記，當可檢測到標記時，判定為堪薩斯分枝桿菌陽性的方法。作為該方法中使用的正向引物和反向引物，如在上述的PCR法中使用的引物，其中優(yōu)選的具體例子和優(yōu)選的組合如上所述。當利用上述方法進行PCR之后，除去游離的標記引物，測定引物延伸物的標記，可以檢測到標記時，判定為堪薩斯分枝桿菌陽性。作為除去游離的標記引物的方法，將經(jīng)PCR反應得到的反應物中的引物延伸物通過使核酸沉淀的常規(guī)方法(使用乙醇沉淀法、異丙醇的沉淀法等)沉淀后，除去沒有沉淀的含有游離的標記弓I物的上清的方法等。另外，如將經(jīng)PCR反應得到的反應物 在適當?shù)臈l件下通過凝膠層析處理后使引物延伸物與游離的標記引物分離的方法，通過電泳法分離的方法等。(B)使用本發(fā)明的寡核苷酸經(jīng)標記物質(zhì)標記后作為標記探針的方法作為本發(fā)明的堪薩斯分枝桿菌的檢測方法，如作為標記探針使用含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸(本發(fā)明的寡核苷酸)經(jīng)標記物質(zhì)標記的寡核苷酸，使該標記探針與樣品中的核酸雜交，除去游離的標記探針后，對雜交的復合體的標記進行檢測的方法。具體的例如(B-1)使本發(fā)明的寡核苷酸與固相載體結(jié)合，用作捕捉探針，與樣品中的核酸雜交，使來自樣品中的堪薩斯分枝桿菌的核酸固定在固相上的檢測法(例如參照特開昭62-265999 號所述)，(B-2)使用(B-1)的捕捉探針和對本發(fā)明的探針進行標記的標記探針與樣品中的核酸雜交，使捕捉探針和來自堪薩斯分枝桿菌的核酸與標記探針的復合體在固相載體上形成，對標記探針的標記進行測定的夾心分析(例如參照特開昭58-40099號所述)方法，(B-3)使用用生物素標記的本發(fā)明的探針，與樣品中的核酸雜交后，通過抗生物素蛋白結(jié)合載體捕捉樣品中的來自堪薩斯分枝桿菌的核酸的方法等。另外，在本發(fā)明的堪薩斯分枝桿菌的檢測方法中使用的試劑中，作為通常該領域中使用的試劑類，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑等，可以使用不抑制共存的試劑等的穩(wěn)定性，不抑制PCR和雜交反應的試劑。而其濃度也適宜從該領域通常使用的濃度范圍選擇。緩沖液的具體例子，例如Tris緩沖液、磷酸緩沖液、巴比妥緩沖液、硼酸緩沖液、優(yōu)良緩沖液等、實施通常的PCR和雜交反應時使用的緩沖液，其pH也沒有特別限定，通常優(yōu)選5 9的范圍。根據(jù)需要，可使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等)、酶相應的底物(dNTP、rNTP等)、以及雙鏈嵌入劑(溴乙錠、SYBR Green等)或FAM和TAMRA等標記檢測物質(zhì)等。作為本發(fā)明涉及的堪薩斯分枝桿菌檢測用試劑盒，如“包含作為引物(本發(fā)明的引物)或/和探針(本發(fā)明的探針)的含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的堪薩斯分枝桿菌檢測用試劑盒”。引物可以是用標記物質(zhì)標記的引物。該標記物質(zhì)的具體例子如上所述。在含有本發(fā)明的引物的試劑盒中也可包括含有一組正向引物和反向引物的引物組成。作為其優(yōu)選的實施方式，例如下述的例子。(I)包含作為構(gòu)成試劑的含有序列號5所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的正向引物和含有序列號6所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的反向引物。(2)包含作為構(gòu)成試劑的含有序列號13所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的正向引物和含有序列號14所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的反向引物。(3)包含作為構(gòu)成試劑的含有序列號15所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的正向引物和含有序列號16所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的反向引物。(4)包含作為構(gòu)成試劑的含有序列號13所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的正向引物和含有序列號16所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的反向引物。(5)包含作為構(gòu)成試劑的含有序列號27所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的正向引物和含有序列號28 所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的反向引物。(6)包含作為構(gòu)成試劑的含有序列號29所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的正向引物和含有序列號30所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的反向引物。(7)包含作為構(gòu)成試劑的含有序列號27所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的正向引物和含有序列號30所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的反向引物。(8)包含作為構(gòu)成試劑的含有序列號41所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的正向引物和含有序列號42所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的反向引物。(9)包含作為構(gòu)成試劑的含有序列號43所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的正向引物和含有序列號44所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的反向引物。
(10)包含作為構(gòu)成試劑的含有序列號41所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的正向引物和含有序列號44所示的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的反向引物。上述試劑盒還可以包含用標記物質(zhì)標記的本發(fā)明的寡核苷酸作為標記探針。另外，如“含有作為探針的本發(fā)明寡核苷酸的堪薩斯分枝桿菌檢測用試劑盒”。該探針可以是用標記物質(zhì)標記的探針。構(gòu)成這些試劑盒的構(gòu)成試劑的優(yōu)選方式和具體例子如上所述。另外，在本發(fā)明的堪薩斯分枝桿菌的檢測用試劑盒中，也可包含例如緩沖劑、穩(wěn)定齊U、防腐劑等不抑制共存的試劑等的穩(wěn)定性、不抑制PCR和雜交反應的試劑。而其濃度也適宜從該領域通常使用的濃度范圍選擇。緩沖液的具體例，例如Tris緩沖液、磷酸緩沖液、巴比妥緩沖液、硼酸緩沖液、優(yōu)良緩沖液等、實施通常的PCR和雜交反應時使用的緩沖液，其pH也沒有特別限定，通常優(yōu)選5 9的范圍。根據(jù)需要，也可包含核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等)、酶相應的底物(dNTP、rNTP等)、以及雙鏈嵌入劑(溴乙錠、SYBR Green等)或FAM和TAMRA等標記檢測物質(zhì)等。以下給出實施例，對本發(fā)明進行更具體的說明，但本發(fā)明并不受這些例子的任何限定。另外，在實施例中使用的細菌無論那一個都是臨床分離株，培養(yǎng)后，通過菌落的形狀和現(xiàn)有的各種生物化學試 驗等，菌種都已經(jīng)被鑒別。
實施例實驗例1.來自堪薩斯分枝桿菌基因組的克隆的選擇(I) DNA樣品的制備首先，使小川培養(yǎng)基上的堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)菌落懸浮在純化水中，高壓滅菌釜處理(120°C，2個大氣壓，20分鐘)后，經(jīng)菌體的粉碎處理(通過直徑2mm玻璃珠物理破碎)，離心分離，得到上清。由所得的上清，使用Qiagen公司制的離子交換樹脂型DNA提取純化試劑盒Genomic-tip進行DNA的提取、純化。獲得來自堪薩斯分枝桿菌的基因組DNA。將所得的純化DNA最后配制成400ng/ μ I (IOmM Tris-HCl緩沖液、pH8.9)，作為
DNA樣品。另外，作為陽性對照制備對特開平11-155589號所述的堪薩斯分枝桿菌的KATS2、以及對日本專利申請2004-129272號說明書中以序列號8給出的結(jié)核分枝桿菌(人型結(jié)核菌)特異的序列(本說明書中以序列號81表示)，作為陰性對照使用根據(jù)大腸桿菌的DNA提取方法的常規(guī)方法對DNA進行提取、純化的來自大腸桿菌的DNA，同樣制備DNA樣品，同樣進行以下處理。(2)全基因組鳥槍法文庫的制作以上述⑴得到的DNA樣品24 μ g作為材料，用以下的方法(對Science.2001年2月16日；291(5507) =1304-51, Venter等人所述的全基因組鳥槍法進行了改變)進行全基因組鳥槍法文庫的制作。首先，利用霧化器(Invitrogene公司生產(chǎn)),在終濃度20%的甘油存在下，于5kPa 9kPa壓力下進行約10分鐘處理，使DNA樣品片段化，可以有效回收目標500 IOOObp大小的級分。將得到的級分利用Qiagen公司生產(chǎn)的提取柱進行純化。然后，使用Takara Bio公司生產(chǎn)的DNA Blunting Kit,利用T4DNA聚合酶的5' —3'聚合酶活性和3' —5'外切核酸酶活性，將得到的DNA片段的末端平端化。然后將它與已平端化末端處理完的pBSII sk+載體(Stratagene公司)進行連接反應,制作在pBSII sk+載體(amp 中整合了 DNA片段的重組DNA。使用Takara Bio公司生產(chǎn)的大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，根據(jù)該制品說明書，用上述得到的重組DNA進行大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化，將得到的轉(zhuǎn)化體于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素、0.2mM IPTG、40 μ g/ml X-Gal的LB-瓊脂培養(yǎng)基進行平板培養(yǎng)后，挑出白色菌落，獲得導入整合了目的DNA片段的重組DNA的轉(zhuǎn)化體(堪薩斯分枝桿菌基因組的全基因組鳥槍法克隆)的文庫。(3)微陣列制作用下述方法，通過使用上述(2)得到的堪薩斯分枝桿菌基因組的全基因組鳥槍法克隆進行PCR，制備固定于載玻片上的探針材料。制備含有各ly]\^9$*M13Primer Ml (Takara Bio 公司生產(chǎn))和引物 M13PrimerRV(Takara Bio 公司生產(chǎn))、1.5mM MgCl2、80mM KCl,500y g/ml BSA、0.1 %膽酸鈉、0.1 %Triton X-1OO (聚氧乙烯辛基酚醚，Rohm&Haas公司商品名)、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和Taq DNA聚合酶(Nippon Gene公司生產(chǎn))40單位/ml的IOmMTris-HCl緩沖液(pH8.9)，作為PCR用反應液。根據(jù)常規(guī)方法從上述(I)中得到的堪薩斯分枝桿菌基因組的全基因組鳥槍法克隆純化DNA，把它懸浮添加到PCR用反應液20 μ I后的溶液用作為PCR用樣品(作為模板)，利用MJ Research公司的DNA熱循環(huán)儀(DNA Engine PTC200)，按照下述的反應條件進行30個循環(huán)的PCR。PCR反應條件:熱變性:94°C、0.5分鐘退火:55°C、1分鐘聚合反應:75°C、0.5分鐘。將得到的PCR產(chǎn)物純化后，與固定緩沖液(終濃度3x SSC)混合。使用點印用裝置(GTMAS Stamp II ;日本激光電子公司生產(chǎn))，被點印的PCR產(chǎn)物的終濃度按照300ng/μ L那樣進行調(diào)整，將裝置內(nèi)的濕度設定為55%，在載玻片(CMTGAPS-1I ；Corning公司生產(chǎn))上點印得到的PCR產(chǎn)物(點徑150-250 μ m)。將點印完了的載玻片移到 UV 交聯(lián)儀(UVStratalinker 1800 ；Stratagene 公司制)，進行 150mJ/cm2 的 UV照射，將PCR產(chǎn)物(目的DNA)固定，做成微陣列。(4)目標基因 組DNA的熒光色素標記與微陣列雜交i)目標基因組DNA的熒光色素標記首先，利用BioPrime DNA labeling system(Invitrogene 公司生產(chǎn))，將來自堪薩斯分枝桿菌(ATCC12478)的基因組以及對照用基因組(牛型結(jié)核菌、ATCC19274)DNA各2ug與各個制品中的隨機引物溶液20μ L進行混合，進行熱變性(95°C、5分鐘)處理。然后，向各個熱變性處理物中添加0.1M DTT 2 μ 1、dATP/dCTP/dGTP (各5mM)的混合液 2 μ 1、2.5mM dTTP 0.8 μ l、5mM Ha-dUTP 1.6 μ 1、Klenow 酶(40U/ μ L) I μ 1，按照總體積最終達到50 μ L那樣加去離子滅菌水，于37°C進行3小時的延伸反應。將microconeYM-30 (Millipore公司生產(chǎn))的超濾柱裝到附帶的1.5ml管中，將上述反應產(chǎn)物加到柱上，于HOOOrpm離心4分鐘后，將濃縮液回收到微管中，用真空干燥離心機(CentriVap離心濃縮機；LABC0NC0公司生產(chǎn))完全干燥。向得到的干燥反應產(chǎn)物中加10 μ I 50mM NaHCO3,并混合，于常溫下靜置2 3分鐘。另外，制備將Img 的 Cy3 (Amersham Bioscience 株式會社)或 Cy5 (AmershamBioscience 株式會社)溶于 105 μ I DMSO 的溶液中。將該 10 μ I Cy-dye Solution Cy3 加到使用對照用基因組(牛型結(jié)核菌)得到的上述反應產(chǎn)物中，將10μ I Cy-dye SolutionCy5加到使用堪薩斯分枝桿菌基因組得到的上述反應產(chǎn)物中，分別于40°C溫育60分鐘左右(避光)。再分別向各個反應產(chǎn)物中加10 μ I 4Μ NH2OH(使用前制備)，攪拌后通過溫育15分鐘左右(避光)，得到各個標記產(chǎn)物，即Cy3標記的對照用基因組(牛型結(jié)核菌)DNA和Cy5標記的堪薩斯分枝桿菌基因組DNA。將microconeYM-30 (Millipore公司生產(chǎn))的超濾柱裝到附帶的1.5ml管中，將上述得到的基因組DNA的標記產(chǎn)物加到柱上，于HOOOrpm下將得到的標記產(chǎn)物離心4分鐘后，將濃縮液回收到微管中，用真空干燥離心機(CentriVap離心濃縮機；LABC0NC0公司生
產(chǎn))完全干燥。 ii)標記產(chǎn)物的片段化步驟對于上述(4) i)得到的干燥狀態(tài)的基因組DNA的標記產(chǎn)物，添加制備的40 μ L終濃度為0.04Μ Tris-醋酸(pH8.1)、0.1M醋酸鉀、0.03Μ醋酸鎂四水合物組成的溶液，使其懸浮混合。然后于94°C加熱處理15分鐘，可得到100個堿基 300個堿基的基因組DNA的標記產(chǎn)物片段化的生成物。另外使用BcaBEST DNA聚合酶(Takara Bio公司生產(chǎn))和rBst DNA聚合酶(EPICENTRE公司生產(chǎn))研究標記效率(堿基/染料)，結(jié)果確認在對照用基因組(牛型結(jié)核菌)DNA的約20個堿基中摻入了 I分子染料，在堪薩斯分枝桿菌基因組DNA的約10個堿基中摻入了 I分子染料。將各個Cy3標記產(chǎn)物溶液和Cy5標記產(chǎn)物溶液加到microcone YM-10 (Millipore公司生產(chǎn))的超濾柱中，于HOOOrpm下離心4分鐘后，將濃縮液回收到微管中，用真空干燥離心機(CentriVap離心濃縮機；LABC0NC0公司生產(chǎn))使其完全干燥。然后向微管中加以下試劑(以下使用的微陣列用的蓋玻片為24X 55mm時)，使上述得到的Cy3標記產(chǎn)物與Cy5標記產(chǎn)物懸浮于同一溶液中，并混合。 ArrayHyb雜交緩沖液(SIGMA公司生產(chǎn));40 μ L鮭精DNA (10mg/mL) ;0.5 μ L甲酰胺；5μ L
總共40 50 μ L懸浮混合后，于95°C溫育5分鐘，在雜交前保存在70°C。iii)微陣列雜交 將上述(4) ii)制備的Cy3標記產(chǎn)物和Cy5標記產(chǎn)物的混合溶液都加到上述(3)制作的微陣列(DNA芯片)上，蓋上蓋玻片，但不要進入氣泡。將它裝到雜交盒中，置于用蒸懼水弄濕的無塵紙(kimtowel)上的Tupper中密閉，于65°C反應8小時以上,進行雜交(避光)。雜交后，通過于室溫下將DNA芯片連同蓋玻片一起浸入到2 X SSC-0.1% SDS溶液中，于溶液中輕輕地搖動DNA芯片，使蓋玻片脫離。然后用1XSSC、0.03% SDS溶液(60°C )清洗10分鐘，用0.2 X SSC溶液(42 °C )清洗10分鐘，用0.05 X SSC溶液(室溫)清洗10分鐘后，將DNA芯片迅速移到新的干的管架中，立刻于SOOrpm下離心5分鐘使其干燥。(5)熒光強度的測定；從信號檢測至數(shù)量化使用突光解讀掃描儀(Protein Array Scanner ；日本激光電子公司生產(chǎn))，測定上述(4)iii)中得到的微陣列上的熒光強度，得到使用2通道(Cy3、Cy5)的熒光檢測數(shù)據(jù)。熒光信號的數(shù)量化使用日立軟件公司生產(chǎn)的DNASISTM-Array (DNA芯片發(fā)現(xiàn)圖像解析軟件)，按照軟件的操作步驟，可進行點自動識別、背景計算、熒光強度比的規(guī)一化。另外，確定置信界限線，通過對該界限線以下區(qū)域的數(shù)據(jù)不處理，求歸一化的可置信的熒光強度比。另外，在微陣列上點印上陽性對照(對結(jié)核分枝桿菌特異的DNA片段、堪薩斯分枝桿菌的KATS2序列片段)以及陰性對照(來自大腸桿菌的DNA片段)。為了篩選用于特異檢測堪薩斯分枝桿菌的候補序列，以在DNA芯片上檢測的Cy3/Cy5的突光強度比(Ratio)為基礎,進行散點圖(scatterblock)解析。結(jié)果如圖5所示。作為比較，使用特開平11-155589號所述的堪薩斯分枝桿菌的KATS2序列、以及日本專利申請2004-129272號說明書所述的來自結(jié)核分枝桿菌的序列號8 (在本說明書中為序列號81)，進行同樣處理，對Cy3和Cy5的熒光進行檢測的結(jié)果也一并表示在圖5中。在圖5中，給出了整個散點圖以及對繪制集中的(虛線圈起的)部分放大的圖。散點圖用雙對數(shù)圖表示，縱軸表示相對于橫軸Cy3熒光強度的Cy5熒光強度。在圖5中，(2)和(3)以外的點表示各微陣列上使用PCR產(chǎn)物的結(jié)果，作為(2)以圓圈表示的點是使用特開平11-155589號所述的堪薩斯分枝桿菌的KAS序列的結(jié)果，作為(3)以圓圈表示的點表示使用日本專利申請2004-129272號說明書所述的來自結(jié)核分枝桿菌的序列號8 (本說明書中為序列號81)時的結(jié)果。圖5上的各條線的意思如下。(a)表示Cy5熒光強度/Cy3熒光強度的比率彡10.0的線(b)表示Cy5熒光強度/Cy3熒光強度的比率彡5.0的線(c)表示Cy5熒光強度/Cy3熒光強度的比率彡2.0的線(a’ )表示Cy3熒光強度/Cy5熒光強度的比率彡10.0的線(b’)表示Cy3熒光強度/Cy5熒光強度的比率彡5.0的線(c’)表示Cy3熒光強度/Cy5熒光強度的比率彡2.0的線。S卩，表示處于(a)的線之上的點，Cy5的熒光強度與Cy3的熒光強度比較，強10倍以上，處于(b)的線之上的點，Cy5的熒光強度與Cy3的熒光強度比較，強5 10倍以上，處于(C)的線之上的點，Cy5的熒光強度與Cy3的熒光強度比較，強2 5倍以上。而處于(a’)的線之下的點，Cy3的熒光強度與Cy5的熒光強度比較，強10倍以上，處于(b’)的線之下的點，Cy3的熒光強度與Cy5的熒光強度比較，強5 10倍以上，處于(c’ )的線之下的點，Cy3的熒光強度與Cy5的熒光強度比較，強2 5倍以上。如圖5表明的那樣，由于(3)的點處于線(b’ )與線(c’ )之間，表示Cy3的熒光強度比Cy5的熒光強度強5 10倍，可知該點與牛型結(jié)核菌基因組DNA雜交。另外，由于
(2)的點處于線(c)與線(b)之間，表示Cy5的熒光強度比Cy3的熒光強度強2 5倍，可知該點與堪薩斯分枝桿菌的基因組DNA雜交。而當作為陰性對照使用大腸桿菌的基因組DNA時，散點圖上的點由于Cy5熒光強度/Cy3熒光強度的比率在I付近，熒光強度處于非常低的位置，圖5沒有表示。圖5中，由進行篩選的各微陣列的PCR產(chǎn)物中，由于用圓圈圈起來的⑴中顯示的8個點(由于點重疊，可看到5個，實際有8個點)檢測到比⑵更強的Cy5熒光，所以判斷與(2)(特開平11-155589號所述的堪薩斯分枝桿菌的KATS2序列)相比對堪薩斯分枝桿菌的特異性高。因此將這8個克隆選作為候補克隆。(6)確定候補克隆的堿基序列對上述(5)中選擇的8個候補克隆，用下面的方法確定堿基序列。S卩，使用 Big Dye Terminator 試劑盒(Applied Biosystems 公司生產(chǎn))，根據(jù)制品說明書，按照以下的步驟進行序列解析。候補DNA (候補克隆)；2 μ L(IOOng)M13Primer Ml ； I μ L(5pmol)
premix ；8 μ L向上述混合物中加去離子滅菌水使總體積達到20 μ L，通過[Research公司的DNA熱循環(huán)儀(DNA Engine PTC200)于下面的反應條件下進行30個循環(huán)的測序反應。96 0C 2 分鐘一(96 0C 10 秒一50 °C 5 秒一60 °C 4 分鐘)X 25 — 4°C將得到的測序反應產(chǎn)物經(jīng)QIAGEN公司制的凝膠過濾柱純化后，使用MJ Research公司制的測序儀(BaseStation)，按照儀器附帶的操作說明書完成所有候補序列的序列解讀。將得到的結(jié)果在數(shù)據(jù)庫(NCBI BLAST)中進行檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然也來源于基因組序列未破譯的生物種堪薩斯分枝桿菌，但就數(shù)據(jù)庫上來說，候補的所有8個克隆都是未登錄的新的序列。實施例1.候補克隆的堪薩斯分枝桿菌特異性評價對于實驗例I得到的8個候補克隆，通過利用PCR擴增系統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測實施評價實驗，研究這些候補克隆是否可以在使用基因擴增檢測系統(tǒng)的堪薩斯分枝桿菌特異的檢測系統(tǒng)中利用。(I)PCR引物的合成首先，根據(jù)確定的候補克隆I的序列的解析結(jié)果，使用引物設計用的Web toolPrimer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research.)設計 PCR 擴增檢測用的弓丨物序列。使用設計的“CGGCCATTGTTCTACAGTCT”(序列號5，以下稱為lc_platelFwl)和“TAGAGATCCATCGCTTTGGT”(序列號 6、以下稱為 lc_platel_Rvl)，進行如下的 PCR。使用 ABI公司DNA合成儀392型，用亞磷酰胺法合成設計的寡核苷酸。合成方法根據(jù)ABI公司手冊，可通過將寡核苷酸的氨水溶液于55°C加熱過夜實施各種寡核苷酸的去保護。然后通過使用Pharmacia公司制FPLC進行陰離子交換柱層析純化合成的寡核苷酸。而由序列的解析結(jié)果得到的候補克隆I的堿基序列如序列號I所示。(2)樣品的制備使用以下給出的細菌，用下面的方法對DNA進行提取和純化，得到DNA樣品。細菌都是臨床分離株，培養(yǎng)后，菌種已經(jīng)通過菌落的形狀和現(xiàn)有的各種生物化學的試驗等被鑒別。a:大腸桿菌(Escherichia coli)b:結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis ;人型結(jié)核菌)c:堪薩斯分枝桿菌(Mycobacter ium kansasii)d:海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)e:猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)f:療病分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)g:戈氏分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)h:斯氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)1:鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)j:胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare)k:胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)1:蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi)m:無色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum)η:地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)ο:次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)p:偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)q:龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)r:胺腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)s:外來分枝桿菌(Mycobacterium peregrinum)首先，對于分枝桿菌(Mycobacterium)屬細菌，將小川培養(yǎng)基上的菌落懸浮于純化水中，高壓蒸氣滅菌處理(120°02氣壓、20分鐘)后，經(jīng)菌體的粉碎處理(通過直徑2mm玻璃珠物理破碎)，離心分離，獲得上清。使用Qiagen公司制的離子交換樹脂型DNA提取純化試劑盒Genomic-tip從得到的上清進行DNA的提取、純化。而對于大腸桿菌，根據(jù)大腸桿菌的DNA提取方法的常規(guī)方法，提取、純化DNA。將得到的純化DNA制備成最終Ing/ μ I (IOmM Tris-HCl緩沖液、ρΗ8.9)，作為DNA樣品。(3) PCR使用以候補克隆的堿基序列(序列號I)為基礎，用上述方法設計、合成的引物序列l(wèi)c—platel—Fwl和lc—platel—Rvl，如下那樣進行PCR。而候補克隆I的堿基序列上的各引物的所在位置如圖1所示。首先，制備含有各I μ M 的引物 lc—platel—Fwl 和引物 lc—platel—Rvl、1.5mMMgCl2、80mM KCU500u g/ml BSA、0.1 % 膽酸鈉、0.1 % TritonX-100 (聚氧乙烯辛基酚醚、Rohm&Haas 公司商品名)、各 0.2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 Taq DNA 聚合酶(NipponGene公司生產(chǎn))40單位/ml的IOmM Tris-HCl緩沖液(ρΗ8.9)，作為PCR用反應液。使用在20 μ I的PCR用反應液中添加IngDNA樣品的溶液作為PCR用樣品，運用MJResearch公司的DNA熱循環(huán)儀(DNA Engine PTC200)，在下面反應條件下進行30個循環(huán)的PCR0PCR反應條件:熱變性:94t:、0.5分鐘退火:55t:、l分鐘聚合反應:75°C、0.5分鐘。(4)電泳將上述(3)中得到的PCR后的反應液5μ I進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳的電壓條件為恒電壓100V，電泳30分鐘。操作方法以及其它條件根據(jù)生物實驗指導2卷，ρ53-63(秀潤社、中山廣樹著)所述的一般用的方法。然后經(jīng)溴乙錠染色后，用UV樣品攝影裝置FAS-1II系統(tǒng)(東洋紡織公司生產(chǎn))檢測紫外線下的熒光。另外，分子量標記也與反應液同時電泳，通過比較相對迀移率，算出檢測的DNA片段的長度。而分子量標記使用Χ174/HaeIII消化物(標記4、Nippon Gene公司生產(chǎn))。得到的電泳的結(jié)果如圖6所示。圖6中，各泳道的數(shù)字分別表示使用以下各個樣品時的結(jié)果。

M4:分子量標記(標記4)a:大腸桿菌(Escherichia coli)b:結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis ;人型結(jié)核菌)c:堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)d:海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)e:猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)f:療病分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)g:戈氏分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)h:斯氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)1:鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)j:胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare)k:胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)1:蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi)m:無色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum)η:地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)ο:次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)p:偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)q:龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)r:胺腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)s:外來分枝桿菌(Mycobacterium peregrinum)通過使用正向引物lc—platel—Fwl和反向引物lc—platel—Rvl的PCR可預測到位于堪薩斯分枝桿菌基因組中的候補序列I的167個堿基對的DNA片段(序列號53)被復制。因此，可將確認有167個堿基對的熒光帶的判定為陽性。就像圖6的結(jié)果表明的那樣，使用本發(fā)明的引物lc_platel_Fwl和引物lc_platel_Rvl進行的PCR的結(jié)果可以確認只有堪薩斯分枝桿菌作為樣品時(c),可確認167個堿基對的熒光帶，判定為陽性。而相反，當以其它分枝桿菌屬細菌和其它屬的細菌大腸桿菌的樣品為樣品時(a和b、d S)，不能確認該熒光帶，都判定為陰性。由以上實驗表明候補克隆I是具有對堪薩斯分枝桿菌特異的堿基序列的寡核苷酸，通過使用該序列為基礎設計的引物進行PCR的方法判斷可以特異檢測堪薩斯分枝桿菌。另外由于利用PCR等核酸擴增進行的檢測預期靈敏度高，沒有必要分離細菌，有可能可直接對臨床材料進行檢測，所以對于用以往的在細菌培養(yǎng)之后進行檢測的方法要經(jīng)培養(yǎng)數(shù)周的堪薩斯分枝桿菌的檢測，最長I日以內(nèi)也可完成檢測。實施例2.使用本發(fā)明的引物進行堪薩斯分枝桿菌的檢測I對于實驗例I (6)中得到的候補克隆2，以該堿基序列為基礎，通過與實施例1 (I)同樣的方法設計6c_platel_Fwl (候補序列13)作為正向引物和設計6c_platel_Rvl (候補序列14)作為反向引物，進行合成。然后使用與實施例1(2) (4)同樣的樣品和試劑，用同樣的方法進行PCR和電泳。另外，由序列解析結(jié)果得到的候補克隆2的堿基序列如序列號2所示，候補克隆2的堿基序列上的設計的各引物所在位置如圖2所示。 通過使用正向引物6c_platel_Fwl和反向引物6c_platel_Rvl的PCR,預測位于堪薩斯分枝桿菌基因組中的候補序列2的216個堿基對的DNA片段(序列號57)被復制。在此216個堿基對的熒光帶被確認的片斷判定為陽性。該結(jié)果表明，此時只有以堪薩斯分枝桿菌作為樣品時(C)可確認216個堿基對的熒光帶，判定為陽性。與此相反，當以其它分枝桿菌屬細菌或其它屬的細菌大腸桿菌的樣品作為樣品時(a和b、d s)，不能確認該熒光帶，都可判定為陰性。以上實驗表明候補克隆2也是具有對堪薩斯分枝桿菌特異的堿基序列的寡核苷酸，可知通過使用以此寡核苷酸為基礎設計的引物進行PCR的方法可以特異檢測堪薩斯分枝桿菌。實施例3.使用本發(fā)明的引物進行堪薩斯分枝桿菌的檢測2對于實驗例1(6)中得到的候補克隆3 8，以該堿基序列為基礎，通過與實施例1(1)同樣的方法進行引物的設計、合成。除了使用的各個引物以外，其它使用與實施例1(2) ⑷同樣的樣品和試劑，用同樣的方法進行PCR和電泳?？芍摻Y(jié)果在考慮對堪薩斯分枝桿菌的特異性時，候補序列3和4對堪薩斯分枝桿菌的特異性高，對該判定是有效的。另外，由序列解析結(jié)果得到的候補克隆3的堿基序列如序列號3所示，在候補克隆3的堿基序列上設計的各引物所在位置如圖3所示。另外，由序列解析結(jié)果得到的候補克隆4的堿基序列如序列號4所示，在候補克隆4的堿基序列上設計的各引物所在位置如圖4所示。實施例4.通過實時PCR擴增系進行堪薩斯分枝桿菌的檢測(1)堪薩斯分枝桿菌檢測用PCR引物的合成
使用與實施例1 (I)同樣的儀器，通過同樣的操作合成lc_platel_FWl (序列號5)和lc_platel_RVl (序列號6)的寡核苷酸。(2)堪薩斯分枝桿菌檢測用探針的制作由通過作為引物使用lc_platel_Fwl和lc_platel_Rvl的PCR擴增的序列號53的寡核苷酸序列(167個堿基對)設計用作探針的序列“ACTCAATGCCCTTCGATCCCGGCGAAC”，合成該序列的寡核苷酸(以下記為KANlc_FlRl_FAMTAM。序列號80)。在該寡核苷酸的5'末端結(jié)合報告色素FAM，3'末端結(jié)合報告猝滅物的TAMRA，得到標記的寡核苷酸探針(TaqManTM 突光探針，Applied Biosystems Japan 公司生產(chǎn))。(3) PCR用DNA樣品的制備對于由實驗例1(1)制備的堪薩斯分枝桿菌樣品得到的DNA樣品，通過測定吸光度測定樣品中的DNA量。通過將得到的DNA量與已知的堪薩斯分枝桿菌的基因組DNA量比較，確定樣品中的基因組DNA量(基因組拷貝數(shù))。得到IO8個拷貝/ μ I的基因組DNA。然后使用pH8.9的IOmM Tris-HCl緩沖液，制備將DNA樣品稀釋為105，IO4, IO3,IO2,10，5，2個拷貝/ μ L的稀釋系列樣品，作為PCR用DNA樣品。(4)實時 PCR
使用上述⑴制備的lc_platel_Fwl作為正向引物，lc_platel_Rvl作為反向引物，像下面那樣進行實時PCR。即制備含有各ΙμΜ的弓丨物lc_platel_Fwl和引物lc_platel_Rvl、195nM的上述(2)制備的熒光標記探針 KANlc_FlRl_FAMTAM、l.5mMMgCl2、80mM KCl,500y g/ml BSA,
0.1%膽酸鈉、0.1% TritonX-100、各 0.2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 以及 Taq DNA 聚合酶(NipponGene公司生產(chǎn))40單位/ml的IOmM Tris-HCl緩沖液(ρΗ8.9)，作為反應液。將在20 μ I反應液中加了各稀釋系列的DNA樣品I P L后的溶液作為PCR用樣品，將該樣品溶液加到96孔反應板(Applied Biosystems Japan公司生產(chǎn))的孔中，使用TaqMan1 M PCR專用熱循環(huán)儀檢測器(ABI7500、Applied Biosystems Japan公司生產(chǎn))進行實時PCR。反應于95°C保溫10分鐘后，按照95°C 15秒、60°C I分鐘的反應為一個循環(huán)，反復進行50個循環(huán)，每I循環(huán)都測定報告色素的發(fā)光量。而發(fā)光量可用測定中使用的熱循環(huán)儀將供測定的96孔反應板每塊板相對的熒光強度比數(shù)值化的功能求得。(5)結(jié)果由得到的實驗數(shù)據(jù)根據(jù)實時PCR法中運用的常規(guī)方法做成校正曲線。對于每個PCR用DNA樣品，制作將報告色素的發(fā)光量(Rn、y軸)對PCR的各循環(huán)數(shù)(X軸)作圖的擴增曲線。然后，選擇發(fā)光量呈指數(shù)函數(shù)擴增的Rn部，引入臨界線(Thresholdline) (Th)。Th和各個PCR用DNA試樣的擴增曲線的交叉點為臨界循環(huán)(Threshold cycle)(Ct)值。然后將Ct值(y軸)對所用的各PCR用DNA樣品的拷貝數(shù)的對數(shù)值(x軸，對數(shù)值)作圖，可將相對于各Ct得到的近似曲線作為校正曲線。得到的校正曲線如圖7所示。y = -3.348x+32.61R2 = 0.995以上實驗可判定由于通過實時PCR可檢測發(fā)光，所以通過在PCR中使用本發(fā)明涉及的寡核苷酸作為引物，由成為其擴增區(qū)域的序列設計標記探針，進行實時PCR，可以檢測堪薩斯分枝桿菌。
而根據(jù)能夠做成校正曲線，可判定如果通過使用本發(fā)明的引物和探針的實時PCR法，堪薩斯分枝桿菌的定量是可能的。另外，由圖7可知如果利用使用本發(fā)明的引物和探針的實時PCR法，即使作為初期量存在2個拷貝的堪薩斯分枝桿菌的基因組DNA的條件下，堪薩斯分枝桿菌的檢測也是可能的。另外，在利用實時PCR法時，由于對該熒光強度可實時監(jiān)測，所以可對模板DNA的初期量正確定量，可有效進行堪薩斯分枝桿菌的檢測。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性通過使用本發(fā)明的引物或/和探針的堪薩斯分枝桿菌的檢測方法，與通過現(xiàn)有的菌的培養(yǎng)檢查等鑒定菌種的方法比較，可極其迅速且高精度地進行堪薩斯分枝桿菌的檢測。另外通過使用本發(fā)明的檢測方法進行堪薩斯分枝桿菌的檢測，與現(xiàn)有的通過使用引物或/和探針的P CR法的診斷方法比較，有可能排除診斷上的假陽性，可更高精度地進行堪薩斯分枝桿菌的檢測和診斷。另外，通過使用本發(fā)明的檢測方法，可起到也能夠進行堪薩斯分枝桿菌菌體定量的效果。序列表P:\F~1665.txt
權(quán)利要求
1.由任一序列號2 4所示的核酸序列或其完全互補序列組成并且與堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)基因的核酸序列雜交的寡核苷酸。
2.由任一序列號2 4所示的核酸序列或其完全互補序列組成并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的用途，用于設計堪薩斯分枝桿菌檢測用引物或探針。
3.堪薩斯分枝桿菌檢測用引物，所述引物由以下寡核苷酸組成，所述寡核苷酸是由作為序列號2的部分的任一序列號13 26所示的核酸序列或其完全互補序列組成、由作為序列號3的部分的任一序列號27 40所示的核酸序列或其完全互補序列組成、由作為序列號4的部分的任一序列號41 52所示的核酸序列或其完全互補序列組成，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸。
4.權(quán)利要求3所述的引物，其中引物是用標記物質(zhì)標記的。
5.權(quán)利要求4所述的引物，其中標記物質(zhì)選自放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)或生物素。
6.堪薩斯分枝桿菌 檢測用探針，所述探針由以下寡核苷酸組成，所述寡核苷酸是由任一序列號2 4、13 52、57 79所示的核酸序列或其完全互補序列組成，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸。
7.權(quán)利要求6所述的探針，其中探針是用標記物質(zhì)標記的。
8.權(quán)利要求7所述的探針，其中標記物質(zhì)選自放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)或生物素。
9.權(quán)利要求7所述的探針，其中5’末端用報告熒光色素標記，3’末端用猝滅熒光色素
10.由以下寡核苷酸組成的引物的用途，用于檢測堪薩斯分枝桿菌，所述寡核苷酸是由作為序列號2的部分的任一序列號13 26所示的核酸序列或其完全互補序列組成、由作為序列號3的部分的任一序列號27 40所示的核酸序列或其完全互補序列組成、由作為序列號4的部分的任一序列號41 52所示的核酸序列或其完全互補序列組成，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸。
11.權(quán)利要求10所述的用途，其特征是使用所述引物，以樣品中的核酸作為模板進行核酸擴增反應，然后檢測得到的引物延伸物。
12.權(quán)利要求11所述的用途，其特征在于包括以下步驟: (1)使用所述引物，以樣品中的核酸作為模板進行核酸擴增反應， (2)對于(I)中得到的引物延伸物進行電泳，根據(jù)電泳結(jié)果檢測堪薩斯分枝桿菌。
13.權(quán)利要求12所述的用途，其中對電泳后得到的電泳級分確認目的堿基對數(shù)的引物延伸物級分。
14.權(quán)利要求12所述的用途，對于電泳后得到的電泳級分，用標記探針進行雜交，其中所述標記探針是用標記物質(zhì)標記的含有序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸，通過檢測該標記探針的標記，將確認與該標記探針雜交的級分判定為陽性。
15.權(quán)利要求14所述的用途，其中標記物質(zhì)選自放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)或生物素。
16.權(quán)利要求10所述的用途，其中引物是用標記物質(zhì)標記的，使用該引物，以樣品中的核酸為模板進行聚合酶鏈反應，然后測定得到的引物延伸物的標記。
17.權(quán)利要求16所述的用途，其中標記物質(zhì)選自放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)或生物素。
18.權(quán)利要求16所述的用途，其中在進行聚合酶鏈反應后，除去游離的標記引物，測定引物延伸物的標記。
19.權(quán)利要求18所述的用途，其中使經(jīng)聚合酶鏈反應得到的反應物中的引物延伸物沉淀后,通過除去上清,除去游離的標記引物。
20.權(quán)利要求18所述的用途，其中將經(jīng)聚合酶鏈反應得到的反應物通過凝膠層析處理除去游離的標記引物。
21.標記探針的用途，用于檢測堪薩斯分枝桿菌，所述標記探針是用標記物質(zhì)標記的由任一序列號2 4所示的核酸序列或其完全互補序列組成、由作為序列號2的部分序列的任一序列號57 64所示的核酸序列或其完全互補序列組成、由作為序列號3的部分序列的任一序列號65 72所示的核酸序列或其完全互補序列組成、由作為序列號4的部分序列的任一序列號73 79所示的核酸序列或其完全互補序列組成的寡核苷酸。
22.權(quán)利要求21所述的用途，其特征是使權(quán)利要求21所述的標記探針與樣品中的核酸雜交’除去游離的標記探針后，檢測雜交的復合體的標記。
23.權(quán)利要求21所述的用途，其中標記物質(zhì)選自放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)或生物素。
24.堪薩斯分枝桿菌檢測用試劑盒，其包含引物和/或探針，其中所述引物是由作為序列號2的部分的任一序列號13 26所示的核酸序列或其完全互補序列組成、由作為序列號3的部分的任一序列號27 40所示的核酸序列或其完全互補序列組成、由作為序列號4的部分的任一序列號41 52所示的核酸序列或其完全互補序列組成，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸，所述探針是由任一序列號2 4、13 52、57 79所示的核酸序列或其完全互補序列組成，并且與堪薩斯分枝桿菌基因的核酸序列雜交的寡核苷酸。
25.權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中引物和/或探針是用標記物質(zhì)標記的。
26.權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中標記物質(zhì)選自放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)或生物素。
27.權(quán)利要求25所述的試劑盒， 其中探針的5'末端用報告熒光色素標記，3'末端用粹滅色素標記。
全文摘要
本發(fā)明公開了含有序列號1、序列號2、序列號3或序列號4所示的核酸序列的部分或者全部、或其互補序列的部分或者全部，并且與堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)基因的核酸序列雜交的寡核苷酸、含有該寡核苷酸的堪薩斯分枝桿菌檢測用引物和探針、使用該引物和/或探針的堪薩斯分枝桿菌的檢測方法。使用本發(fā)明的堪薩斯分枝桿菌的檢測方法，與現(xiàn)有的通過菌的培養(yǎng)檢查等鑒定菌種的方法比較，可以極其迅速且高精度地進行堪薩斯分枝桿菌的檢測。另外與現(xiàn)有的通過使用引物或/和探針的PCR法的診斷方法比較，有可能排除診斷上的假陽性，可以更高精度地進行堪薩斯分枝桿菌的檢測和診斷。另外也可以進行堪薩斯分枝桿菌菌體的定量。
文檔編號C12Q1/04GK103103181SQ201310019369
公開日2013年5月15日 申請日期2006年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月13日
發(fā)明者石川友一 申請人:和光純藥工業(yè)株式會社