專利名稱：檢測(cè)常見(jiàn)食品過(guò)敏原的基因芯片及檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因芯片及包含該芯片的檢測(cè)用試劑盒，尤其是涉及一種常見(jiàn)食品中過(guò)敏原基因芯片及檢測(cè)用試劑盒。
背景技術(shù)：
食物過(guò)敏是人們對(duì)某些食物產(chǎn)生的一種不良反應(yīng)，在醫(yī)學(xué)上屬于一種變態(tài)反應(yīng)。 據(jù)國(guó)外的一些流行病學(xué)調(diào)查表明，占總?cè)丝?4%以及3歲以下嬰幼兒的6% 7%的人群對(duì)某些食物產(chǎn)生過(guò)敏。嬰幼兒患者在5 6歲時(shí)大約80%對(duì)牛乳、雞蛋、花生、小麥、大豆產(chǎn)生免疫耐受，大約20%對(duì)魚(yú)及甲殼類(lèi)水產(chǎn)動(dòng)物的過(guò)敏會(huì)消除，對(duì)其余的往往是終生過(guò)敏。在成年人，果蔬過(guò)敏的發(fā)病率成快速上升的趨勢(shì)，主要是因?yàn)榇嬖诠?花粉的免疫交叉反應(yīng)。我國(guó)尚未進(jìn)行大規(guī)模調(diào)查，但早些時(shí)候的小范圍調(diào)查表明在北京、廣州及勝利油田，居民食物過(guò)敏的發(fā)生率為3. 4% 5. 0%。食物過(guò)敏反應(yīng)的臨床表現(xiàn)包括蕁麻疹、皰疹樣皮炎、口腔過(guò)敏綜合征、腸病綜合征、哮喘及過(guò)敏性鼻炎等不同形式的臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致過(guò)敏性休克，危及生命?；颊咴陂L(zhǎng)期的忌食過(guò)敏食物過(guò)程中，往往會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)攝入的缺失，如I 9 歲兒童的食物過(guò)敏患者，鈣、鐵、鋅、維生素D、維生素E的攝入量小于RDA的有67%。因此， 食物過(guò)敏已被視為一種嚴(yán)重的公共營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生問(wèn)題，引起了全球廣泛的關(guān)注。食物過(guò)敏是指食物進(jìn)人人體后，機(jī)體對(duì)之產(chǎn)生異常免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體生理功能的紊亂或組織損傷，進(jìn)而引發(fā)一系列臨床癥狀食物變態(tài)反應(yīng)具有特異性，各種免疫病生理機(jī)制均可涉及。食物過(guò)敏反應(yīng)的一個(gè)共同特點(diǎn)是必須有致敏原的預(yù)先接觸及前接觸，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)，當(dāng)再次接觸該致敏原時(shí)，才誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)川。食物過(guò)敏是臨床上最常見(jiàn)，最重要的過(guò)敏性疾患之O
食物過(guò)敏發(fā)病機(jī)制，IgE介導(dǎo)的食物變態(tài)反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制食物過(guò)敏原進(jìn)人易感者體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的速發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，其過(guò)程首先是B淋巴細(xì)胞分泌致敏原特異的IgE抗體，敏化的IgE型抗體和致敏原在肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞表面交連，使肥大細(xì)胞釋放組織胺致敏介質(zhì)，從而產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。致敏蛋白具有對(duì)T-細(xì)胞和B-細(xì)胞的識(shí)別區(qū)，產(chǎn)生專一性的IgE型抗體。因此，致敏原含有兩類(lèi)抗原決定簇，即T細(xì)胞抗原決定簇和B 細(xì)胞抗原決定簇。抗原決定簇一般為小于16個(gè)氨基酸殘基的短肽。非IgE型介導(dǎo)的食物變態(tài)反應(yīng)I1、II1、IV型超敏反應(yīng)均可涉及，但目前尚缺乏直接證據(jù)。牛奶誘發(fā)的血小板減少可涉及II型超敏反應(yīng)。食物誘發(fā)吸收不良綜合征、食物誘發(fā)小腸結(jié)腸炎涉及III和IV型超敏反應(yīng)。非IgE型介導(dǎo)的食物變態(tài)反應(yīng)誘發(fā)癥狀所需食物量較IgE型介導(dǎo)型大。
近來(lái)有報(bào)道部分食物變態(tài)反近來(lái)有報(bào)道部分食物變態(tài)反應(yīng)患者血清中IgG 4增高而IgE及其他IgG不一定增高。有人認(rèn)為IgG 4只是一種同種細(xì)胞 趨化抗體，在抗原激發(fā)下可使嗜堿性粒細(xì)胞釋放介質(zhì)，但亦有研究結(jié)果不支持上述討論。IgG 4在食物變態(tài)反應(yīng)中的作用尚無(wú)定論，有待進(jìn)一步研究。
食物的種類(lèi)成千上萬(wàn)，其中只有一部分容易引起過(guò)敏。同族的食物常具有類(lèi)似的致敏性，尤以植物性食品更為明顯，如對(duì)花生過(guò)敏的患者對(duì)其它豆科類(lèi)植物也會(huì)有不同程度的過(guò)敏。各國(guó)家、各地區(qū)的飲食習(xí)慣不同，機(jī)體對(duì)食物的適應(yīng)性也就有相應(yīng)的差異，因而致敏的食物也不同，比如西方人認(rèn)為羊肉極少引起過(guò)敏，但在中國(guó)羊肉比豬肉的致敏性高； 西方人對(duì)巧克力、草莓、無(wú)花果等過(guò)敏較多，在中國(guó)則極少見(jiàn)到。根據(jù)西方的資料，易引起過(guò)敏的食物為牛奶、雞蛋、巧克力、小麥、玉米、堅(jiān)果類(lèi)、花生、橘子、檸檬、草莓、洋蔥、豬肉，某些海產(chǎn)及魚(yú)類(lèi)，蛤蛘、火雞及雞等。在中國(guó)容易引起過(guò)敏的食物有以下幾類(lèi)1.牛奶及奶制品是嬰幼兒最常見(jiàn)的食物，也是誘發(fā)嬰幼兒濕疹和哮喘的最常見(jiàn)食物變應(yīng)原。牛奶中含有甲種乳蛋白、乙種乳蛋白和酪蛋白等成分，其中甲種乳蛋白是牛奶中最強(qiáng)的變應(yīng)原成分。雖然甲種乳蛋白經(jīng)高溫處理后，其變應(yīng)原性可明顯減弱，但對(duì)于高度牛奶過(guò)敏的患者仍然可以誘發(fā)較為嚴(yán)重的癥狀。過(guò)去認(rèn)為甲種乳蛋白具有較高的種屬特異性，故曾對(duì)牛奶過(guò)敏的兒童考慮采用山羊奶來(lái)替代，但近年研究證實(shí)許多不同種屬的動(dòng)物奶食品中的某些抗原性是相似的對(duì)于牛奶過(guò)敏的兒童，山羊奶并不是可靠的替代食品特別是對(duì)牛奶嚴(yán)重過(guò)敏的兒童，其食物處方中也不應(yīng)含山羊奶等。
2.雞蛋以及蛋制品可以誘發(fā)各個(gè)年齡段患者的過(guò)敏癥狀，其中蛋清的卵白蛋白是誘發(fā)過(guò)敏的主要成分，蛋黃則很少誘發(fā)過(guò)敏。
3.研究已證實(shí)蝦類(lèi)蟹類(lèi)、魚(yú)類(lèi)和貝類(lèi)等均可誘發(fā)過(guò)敏癥狀，特別是鮐魚(yú)、鱒魚(yú)和鮭魚(yú)等魚(yú)肉顏色偏紅的魚(yú)類(lèi)極易誘發(fā)過(guò)敏癥狀。蝦、蟹等甲殼綱海產(chǎn)品也含有較高的變應(yīng)原成分這些食物的變應(yīng)原常耐熱，熟食也常常誘發(fā)過(guò)敏。
4.花生、芝麻和棉籽等油料作物主要與這些食物含較高的蛋白有關(guān)，一旦制成油制品則很少誘發(fā)過(guò)敏。在臨床上經(jīng)常可以遇到花生引發(fā)過(guò)敏性休克和哮喘的患者。黃豆、 綠豆、紅豆、黑豆等均可誘發(fā)過(guò)敏。
5.面包師哮喘(Baker, s asthma)即與接觸面粉有關(guān)。堅(jiān)果類(lèi)包括胡桃、山胡桃、 開(kāi)心果、榛子、松子和栗子等，蔬菜包括蕓豆、青豆、白羽扇豆、蘑菇、西紅柿、辣椒、韭菜、大蒜、茄子、白菜和蕨菜等，新鮮水果如桃子、蘋(píng)果、香蕉、草莓、菠蘿、李子、櫻桃和椰子等常?？烧T發(fā)過(guò)敏癥狀。肉類(lèi)及其肉制品常見(jiàn)的包括牛肉、羊肉、豬肉、雞、肉、兔肉和鴨肉等， 不常見(jiàn)的肉類(lèi)包括狗肉、鵝肉、鱉肉和鳥(niǎo)肉等也可誘發(fā)過(guò)敏，如對(duì)鳥(niǎo)肉的過(guò)敏往往發(fā)生在有鳥(niǎo)蛋綜合征的患者。咖啡、啤酒、葡萄酒、白酒、花粉制成的保健品、巧克力和某些可食昆蟲(chóng)(如螞蚱、蠶、蛹和豆蟲(chóng)等)均可誘發(fā)過(guò)敏癥狀。當(dāng)前食物過(guò)敏原檢測(cè)方法主要有免疫學(xué)法和核酸擴(kuò)增法，然而無(wú)論ELISA方法還是核酸檢測(cè)方法，通常只能同時(shí)檢測(cè)I種過(guò)敏原，而在實(shí)際食品檢測(cè)中，需要對(duì)過(guò)敏原進(jìn)行篩查檢測(cè)，即對(duì)多種過(guò)敏原進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多的食品基因組核酸序列被公布，人們對(duì)食物過(guò)敏原的認(rèn)識(shí)已經(jīng)從外部形態(tài)結(jié)構(gòu)及生化特性深入到核酸、 基因水平。在此基礎(chǔ)上，人們建立了許多新的檢測(cè)技術(shù)，如核酸探針(Nuclear acid probe) 和聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)等，由 于具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、 操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速等特點(diǎn)，己逐步應(yīng)用于食品中過(guò)敏原的檢測(cè)。在這樣的背景下，生物芯片技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，已為過(guò)敏原快速檢測(cè)提供了良好的技術(shù)平臺(tái)。在過(guò)敏原檢測(cè)領(lǐng)域，目前國(guó)內(nèi)外均建立了許多基于PCR方法的檢測(cè)技術(shù)，但由于PCR 技術(shù)只能針對(duì)某一種或幾種過(guò)敏原，而食品中存在的過(guò)敏原種類(lèi)很多，這就需要同時(shí)對(duì)大多數(shù)常見(jiàn)食品過(guò)敏原進(jìn)行檢測(cè)，PCR的這種局限性大大增加了檢測(cè)的工作量，不適用于食品過(guò)敏原分析等領(lǐng)域大量樣品的快速檢測(cè)。而基因芯片技術(shù)以其高通量、高特異性、高敏感、操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速的特點(diǎn)為過(guò)敏原檢測(cè)提供了一種強(qiáng)有力的技術(shù)平臺(tái)。為此，本發(fā)明中以 DNA為檢測(cè)目標(biāo)，選取8種食物樣品，建立一種用于檢測(cè)食品中過(guò)敏原新型基因芯片，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)存在的費(fèi)時(shí)、耗力，分辨能力差的缺陷，擴(kuò)展檢測(cè)范圍，提高檢測(cè)靈敏度和特異性，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，縮短檢測(cè)周期。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所述的基因芯片包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針， 該寡聚核苷酸探針包含下述DNA片段中的至少一種①芹菜的MTD基因②雞的線粒體DNA③魚(yú)的線粒體DNA④花生的Arahl基因⑤芝麻的Sal基因⑥大豆(豆芽)Lectin基因⑦小麥的GAG56D基因⑧杏仁的Prudul基因所述寡聚核苷酸探針優(yōu)選具有SEQ ID NO: 1-8所示的核苷酸序列，或不同于SEQ ID NO: 1-8但編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1_8所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列。
上述的優(yōu)選序列及功能如下所示SEQ ID (5，-3，)NO:1 ATTACATGCTGAGTCACGATGAGCGTG 用于檢測(cè)芹菜過(guò)敏原；NO:2 TTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGAC 用于檢測(cè)魚(yú)過(guò)敏原；NO:3 AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG 用于檢測(cè)花生過(guò)敏原 NO:4 TTCCCGCAGCCCCAACAACCGCAACAA 用于檢測(cè)小麥過(guò)敏原 NO:5 TCGCAGGTGCAACATGCGACCCCAGCA 用于檢測(cè)芝麻過(guò)敏原 NO:6 CCTTTCATCCTCATTTCTATGAATCCG 用于檢測(cè)雞過(guò)敏原；NO:7 CACAAAAAGGCTTGCAGATGGGCTTGC 用于檢測(cè)大豆過(guò)敏原；NO: 8 GAGAAAATCAGTTATGAGATTAAGTT 用于檢測(cè)杏仁過(guò)敏原；本發(fā)明的基因芯片，可用于常見(jiàn)食品過(guò)敏原芹菜、雞、魚(yú)、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁的檢測(cè)。
本發(fā)明所述的基因芯片的制備方法，主要包含步驟1)按照SEQID NO: 1-8所示的核苷酸序列，根據(jù)芹菜、雞、魚(yú)、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁中的過(guò)敏原基因設(shè)計(jì)并制備出用于PCR擴(kuò)增的 引物；2)制備待測(cè)樣品的基因組DNA，使用步驟I)中的引物，對(duì)待測(cè)樣品基因組DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到靶序列；3)標(biāo)記步驟2)中得到的靶序列；4)將標(biāo)記后的靶序列與SEQID NO: 1-8所示的核苷酸序列基因芯片雜交；5)用生物芯片掃描儀獲取雜交信號(hào)并分析雜交結(jié)果。
其中，步驟I)中所述的引物包括SEQ ID NO: 9-24所示的核苷酸序列的至少一種，各條引物探針的寡核苷酸序列由5’端至3’端的組成及其對(duì)應(yīng)擴(kuò)增作用是Pl (SEQ ID N0:9) TTTGATCCACCGACTTACAGCC用于擴(kuò)增芹菜過(guò)敏原MTD基因的上游引物；P2(SEQIDNO:10)ATAAAAACAGATAACGCTGACTCATCAC用于擴(kuò)增芹菜過(guò)敏原MTD基因的下游引物；P3(SEQIDN0:11)ATAACAGCGCAATCCTCTCCC用于擴(kuò)增魚(yú)線粒體DNA的上游引物；P4(SEQIDNO:12)GCTGCACCATTAGGATGTCCT用于擴(kuò)增魚(yú)線粒體DNA的下游引物；P5(SEQIDNO:13)GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG用于花生Arahl基因的上游引物；P6(SEQIDNO:14)CGCTGTGGTGCCCTAAGG用于擴(kuò)增花生Arahl基因的下游引物；P7(SEQIDNO:15)CAACAAITTTCTCAGCCCCAACA用于擴(kuò)增小麥GAG56D基因的上游引物；P8 (SEQ ID NO: 16) TTCTTGCATGGGTTCACCTGTT 用于擴(kuò)增小麥 GAG56D 基因的下游引物；P9 (SEQ ID NO: 17) CCAGAGGGCTAGGGACCTTC用于擴(kuò)增芝麻Sal基因的上游引物；PlO (SEQ ID NO: 18) CTCGGAATTGGCATTGCTG用于擴(kuò)增芝麻Sal基因的下游引物；Pll (SEQ ID NO: 19) CTCTACCCTTGCTGAAAC用于擴(kuò)增雞線粒體DNA基因的上游引物 P12 (SEQ ID NO: 20) TGATGAGGCTTACTGTGC用于擴(kuò)增雞線粒體DNA基因的下游引物 P13 (SEQ ID NO:21) ACCTTGGTACTGGTGCTAC 用于擴(kuò)增大豆 Lectin 基因的上游引物 P14 (SEQ ID N0:22)ACCTTGGCTACTTTATTGTT 用于擴(kuò)增大豆 Lectin 基因的下游引物 P15 (SEQ ID N0:23) TTTGGTTGAAGGAGATGCTC 用于擴(kuò)增杏仁 Pru dul 基因的上游引物 P16 (SEQ ID N0:24)TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG 用于擴(kuò)增杏仁 Pru dul 基因的下游引物本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)食品中過(guò)敏原的試劑盒，該試劑盒包括上述的基因芯片，所述的基 因芯片包含SEQ ID NO: 1-8的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列的至少一種；還包含PCR擴(kuò)增的引物，該引物具有SEQ ID NO: 9_24的核苷酸序列的至少一種， 其中，用于擴(kuò)增芹菜、雞、魚(yú)、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁的PCR引物分別根據(jù)MTD基因、 mitochondrion DNA、線粒體 16s、Arahl 基因、Sal 基因、Lectin 基因、GAG56D 基因、Pru dul 基因設(shè)計(jì)。
本發(fā)明所述的試劑盒還包括雜交盒、雜交液等。
本發(fā)明所述的試劑盒，可用于常見(jiàn)食品過(guò)敏原芹菜、雞、魚(yú)、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁至少一種致病菌的檢測(cè)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用上述技術(shù)方案的有益效果在于現(xiàn)有芯片技術(shù)研究所設(shè)計(jì)的引物和探針基本都位于16s rRNA基因，本發(fā)明將在具有明顯進(jìn)化優(yōu)勢(shì)的過(guò)敏原特異基因上，設(shè)計(jì)特異探針和引物，有效的避免了分辨能力較低，無(wú)法區(qū)分到種的弊端，同時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)范圍已基本涵蓋了日常生活中常見(jiàn)食品過(guò)敏原，大大彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)芯片檢測(cè)范圍欠缺的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的檢測(cè)靈敏度高，提供的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法敏感性高，檢測(cè)精度高， 可以檢測(cè)到lng/μ I的DNA模板見(jiàn)(圖11、圖12、圖13)。對(duì)常見(jiàn)致病菌可以進(jìn)行全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確的檢測(cè)與鑒定。
本發(fā)明所述的基因芯片可特異地檢測(cè)8種常見(jiàn)食品過(guò)敏原芹菜、雞、魚(yú)、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁。該檢測(cè)方法大約需24小時(shí)。在一張片基上可同時(shí)檢測(cè)8個(gè)樣品，減少了成本，實(shí)現(xiàn)高通量，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品的目的，特別適合于檢測(cè)那些多元混合的樣品。
由上述的技術(shù)方案可見(jiàn)，本發(fā)明將芯片技術(shù)引入食物過(guò)敏原快速檢測(cè)中，建立了一種快速、靈敏、高通量、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性強(qiáng)的全新的食物過(guò)敏原檢測(cè)基因芯片及其檢測(cè)方法，利用本發(fā)明的基因芯片可以達(dá)到對(duì)8種主要的食品進(jìn)行檢測(cè)的目的，由于操作簡(jiǎn)便， 準(zhǔn)確性高，能一次完成多種型別的檢測(cè)，重復(fù)性強(qiáng)，因此對(duì)于醫(yī)院監(jiān)測(cè)過(guò)敏原有重要的應(yīng)用價(jià)值，實(shí)現(xiàn)對(duì)食物過(guò)敏原的快速準(zhǔn)確的檢測(cè)。


圖1為本發(fā)明的基因芯片結(jié)構(gòu)外形示意圖；圖2為本發(fā)明芯片的單一點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為為利用本發(fā)明的基因芯片檢測(cè)芹菜過(guò)敏原的雜交結(jié)果示意圖；圖4為利用本發(fā)明的基因芯片檢測(cè)魚(yú)肉過(guò)敏原雜交結(jié)果示意圖；圖5為利用本發(fā)明的基因芯片檢測(cè)花生過(guò)敏原雜交結(jié)果示意圖；圖6為利用本發(fā)明的基因芯片檢測(cè)小麥的雜交結(jié)果示意圖；圖7為利用本發(fā)明的基因芯片檢測(cè)芝麻的雜交結(jié)果示意圖；圖8為利用本發(fā)明的基因芯片檢測(cè)雞肉過(guò)敏原的雜交結(jié)果示意圖；圖9為利用本發(fā)明的基因芯片檢測(cè)大豆過(guò)敏原的雜交結(jié)果示意圖；圖10為利用本發(fā)明的基因芯片檢測(cè)杏仁過(guò)敏原的雜交結(jié)果示意圖；圖11為以大豆(I ng/uL)為例檢測(cè)靈敏度的雜交結(jié)果示意圖；圖12圖11的延續(xù)(10 ng/uL)；圖13圖11的延續(xù)(100 ng/uL)。
具體實(shí)施方式
為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下面特舉較佳實(shí)施例， 并配合說(shuō)明書(shū)附圖，作詳細(xì)說(shuō)明如下。本發(fā)明所用到的各種試劑均有市售。
實(shí)施例1探針的設(shè)計(jì)和制備1.序列獲得芹菜的MTD基因，雞的mitochondrion DNA，魚(yú)的線粒體16s，花生的Arahl基因，芝麻的 Sal基因，大豆(豆芽)Lectin基因，小麥的GAG56D基因，杏仁的Pru dul基因均從GenBank 公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到。
2.探針設(shè)計(jì)舉例(I)芹菜的MTD基因探針將芹菜的MTD基因基因序列導(dǎo)入Glustal X軟件中，選取一條代表序列在公共數(shù)據(jù)NCBI中作blastn比對(duì)，確定可否作為特異靶點(diǎn) 以及特異靶點(diǎn)的位置。將序列導(dǎo)入01igoArray2. O軟件中。參數(shù)設(shè)定如下:_n 20 ；-1 30 ；-L 40 ；-D 3000 ；-t79；-T 90 ；-s 65°C ；-χ 65°C ；-Ν 2 ；-ρ 33, -P 65 ；-m GGGGG CCCCC TTTTT AAAAA ；-g 15。 運(yùn)行程序在線設(shè)計(jì)探針。
3.探針合成將下表I中的探針序列的5’端延長(zhǎng)N個(gè)T并氨基化后委托探針合成公司(北京奧科公司)合成，備用。
4.探針篩選將合成好的探針溶解并適量稀釋后用基因芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)在玻璃片基上制成基因芯片，通過(guò)雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探針篩選，最終得到用于制備本發(fā)明基因芯片所需的特異的探針。
其它探針的設(shè)計(jì)方法與芹菜MTD基因探針設(shè)計(jì)方法相同，使用的設(shè)計(jì)參數(shù)也相同。
本發(fā)明通過(guò)多次雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探針篩選，得到的優(yōu)選的探針如表I所示表1:本發(fā)明基因芯片上選用的寡核苷酸探針序列及可檢測(cè)出的食物過(guò)敏原
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)常見(jiàn)食品中過(guò)敏原的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其特征在于該寡聚核苷酸探針包含下述DNA片段中的至少一種①芹菜MTD基因②雞線粒體DNA③魚(yú)的線粒體16SDNA④花生的Arahl基因⑤芝麻的Sal基因⑥大豆的Lectin基因⑦小麥的GAG56D基因⑧杏仁的Prudul基因 ⑨① ⑧中選取的DNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述寡聚核苷酸探針具有SEQID NO: 1-8所示的核苷酸序列，或不同于SEQ ID NO: 1_8但編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1-8 所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列與SEQ ID NO: 1-8所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的基因芯片在制備檢測(cè)常見(jiàn)食品芹菜、雞、魚(yú)、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁中過(guò)敏原試劑盒方面的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述基因芯片的制備方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行1)根據(jù)權(quán)利要求1所述的常見(jiàn)食品過(guò)敏原的特異基因設(shè)計(jì)并制備出用于PCR擴(kuò)增的引物；2)制備待測(cè)樣品的基因組DNA，使用步驟I)中的引物，對(duì)待測(cè)樣品基因組DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到靶序列；3)標(biāo)記步驟2)中得到的靶序列；4)將標(biāo)記后的靶序列與權(quán)利要求1所述的基因芯片雜交；5)用生物芯片掃描儀獲取雜交信號(hào)并分析雜交結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟I)中所述的引物包括SEQID NO: 9-24所示的核苷酸序列的至少一種。
6.一種檢測(cè)食品中常見(jiàn)過(guò)敏原的試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的基因芯片。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述的基因芯片包含SEQID NO: 1-8所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)核苷酸序列的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于還包含PCR擴(kuò)增的引物，該引物具有 SEQ ID NO: 9-24的核苷酸序列的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于還包含雜交盒、雜交液。
10.權(quán)利要求6所述的試劑盒在制備檢測(cè)常見(jiàn)食品芹菜、雞、魚(yú)、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁中過(guò)敏原方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種常見(jiàn)食品中過(guò)敏原的基因芯片及檢測(cè)用試劑盒，其主要針對(duì)芹菜、雞、魚(yú)、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁等8種常見(jiàn)食品過(guò)敏原。該基因芯片包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，上述寡聚核苷酸探針包含從芹菜MTD基因、雞線粒體DNA、魚(yú)的線粒體16S、花生的Arah1基因、芝麻的Sal基因、大豆的Lectin基因、小麥的GAG56D基因、杏仁的Prudul基因上選取的DNA片段。利用本發(fā)明的基因芯片及檢測(cè)試劑盒可以常見(jiàn)食品中過(guò)敏原，且操作簡(jiǎn)便，高通量，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)，可用于食品過(guò)敏癥的臨床檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103060462SQ20131001925
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者王磊, 曹勃陽(yáng), 劉向前, 陳敏, 馮露 申請(qǐng)人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司