專利名稱：一種用于軟骨損傷修復(fù)的改良脂肪干細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用基因技術(shù)改造干細(xì)胞以提高它的性能及分泌蛋白的表達(dá)，并且這種改良后的細(xì)胞可以應(yīng)用于軟骨損傷的修復(fù)。
背景技術(shù)：
軟骨損傷是比較難以治愈的病變，尤其是淺層性的軟骨損傷。多種原因可以造成軟骨損傷，如外力沖擊、自生免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、老齡化導(dǎo)致的機(jī)體退化等。軟骨的自我修復(fù)能力很弱，即使是很小的軟骨缺損也很難愈合。因軟骨組織內(nèi)無(wú)血液供應(yīng)，軟骨內(nèi)基質(zhì)合成活躍度低。但如果傷口深到軟骨下骨層，傷口反而有自我愈合的能力，這是因?yàn)檐浌窍鹿莾?nèi)的血液滲透出來(lái)形成的血塊附帶有干細(xì)胞，其有可能被激活以促進(jìn)傷口的愈合。在臨床治療中，可通過鉆孔至軟骨下層導(dǎo)致出血或微骨折的方式來(lái)治療軟骨缺損。干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制與更新能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，可以分化成多種功能細(xì)胞。干細(xì)胞獨(dú)特的性質(zhì)使其成為再生醫(yī)學(xué)和疾病治療的研究熱點(diǎn)，理論上干細(xì)胞療法可以治療包括軟骨損傷的組織器官損傷疾病。據(jù)美國(guó)官方的某個(gè)臨床試驗(yàn)登記網(wǎng)站顯示，與軟骨修復(fù)相關(guān)的干細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)就有上百個(gè)。在科研界，針對(duì)干細(xì)胞應(yīng)用于軟骨損傷的治療效果也有不少樂觀的報(bào)道。脂肪組織中含有一種具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體，被稱作脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ASC),這種細(xì)胞具有自我更新和分化能力。大量的文獻(xiàn)證實(shí)了 ASCs不僅能分化成間充質(zhì)細(xì)胞如脂肪、軟骨、成骨、肌肉，還能分化成神經(jīng)、血管來(lái)源的細(xì)胞。過去10年，脂肪干細(xì)胞在器官組織損傷的修復(fù)應(yīng)用中逐漸受到重視。自體脂肪干細(xì)胞的使用相比其它來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞有較好的安全性，因其來(lái)源于自體組織，不會(huì)出現(xiàn)排異反應(yīng)，是理想的移植物。雖然針對(duì)于干細(xì)胞用于軟骨損傷修復(fù)的研究報(bào)道較多，但無(wú)論是動(dòng)物試驗(yàn)還是臨床研究，其治療效果差異很大?？赡茉蚴侵靖杉?xì)胞的活性差異所致，治療前的處理方法、來(lái)源部位以及伴隨干細(xì)胞注射的生長(zhǎng)因子的不同均會(huì)造成脂肪干細(xì)胞的活性差異。很多關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞在組織修復(fù)及填充的臨床試驗(yàn)表明，干細(xì)胞主要通過兩種方式發(fā)揮作用:1.分化成目標(biāo)組織的細(xì)胞以替代損傷組織；2.分泌各種生長(zhǎng)因子來(lái)促進(jìn)受損部位的修復(fù)，包括促進(jìn)附近干細(xì)胞的激活和轉(zhuǎn)化，這個(gè)作用方式有時(shí)候發(fā)揮的作用更大。有研究表明，某些生長(zhǎng)因子即使單獨(dú)使用也有促進(jìn)軟骨自我修復(fù)的功能。然而一般情況下，大部分干細(xì)胞移植到損傷部位后存活的時(shí)間只有1-2周，這表明干細(xì)胞發(fā)揮作用的時(shí)間是比較短的。如果在這段時(shí)間內(nèi)組織的損傷沒有修復(fù)，干細(xì)胞的治療效果就不能達(dá)到。針對(duì)這種短效作用的特點(diǎn)，目前臨床試 驗(yàn)上一般采用多次干細(xì)胞治療的方式或同時(shí)添加生長(zhǎng)因子來(lái)提高干細(xì)胞的治療效果。雖然這些生長(zhǎng)因子可以通過注射的方式使用，但是它們的半衰期很短，需要一次性注射量很大或需反復(fù)注射來(lái)達(dá)到理想的作用濃度，這給臨床治療造成不便。考慮讓細(xì)胞作為載體使其長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)這些生長(zhǎng)因子的方式是比較理想的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于軟骨損傷修復(fù)的改良脂肪干細(xì)胞。為了能滿足臨床治療中軟骨修復(fù)的要求，脂肪干細(xì)胞要具備穩(wěn)定的活性，并能針對(duì)性的促進(jìn)有軟骨修復(fù)能力的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)因子的分泌?；诖罅康南嚓P(guān)研究，我們選擇讓細(xì)胞表達(dá)TGF-0 3或BMP4。TGF-β 3屬于TGF-β家族，不但能誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞成軟骨分化，還能提高生長(zhǎng)速度。臨床研究也表明TGF-β 3在促進(jìn)軟骨修復(fù)過程中有更多的膠原II和蛋白聚糖產(chǎn)生，作為歸巢效應(yīng)的誘導(dǎo)因子，TGF-β 3還可以促進(jìn)鄰近的細(xì)胞向傷處遷移，同時(shí)TGF- β 3本身也可以激活損傷部位附近的間充質(zhì)干細(xì)胞。ΒΜΡ4屬于BMP家族蛋白，同時(shí)也屬于TGF-β多肽家族，它具有促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成軟骨分化的功能。研究表明，在脂肪干細(xì)胞成軟骨分化過程中，ΒΜΡ4具有促進(jìn)細(xì)胞成團(tuán)并使之具有軟骨細(xì)胞形態(tài)的作用。此外ΒΜΡ4還可以促進(jìn)軟骨蛋白形成，實(shí)現(xiàn)較快的透明狀軟骨修復(fù)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，通過病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式改良脂肪干細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備方法為:1)ΒΜΡ-4的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建:人ΒΜΡ-4的cDNA通過PCR從相應(yīng)的噬菌體克隆擴(kuò)增出來(lái)，ΒΜΡ4-1 (CCGCTCGAGGCGGCCGCCCACCATGCTGATGGTCGTTTTATTATG)和 BMP4-2 (TCCATCGATAGATCTATCCTCAAGGACTGCCTG)引物被用來(lái)擴(kuò)增表達(dá)BMP4的構(gòu)架，cDNA克 隆到pBluescript II KS后，通過測(cè)序cDNA雙鏈的方法來(lái)驗(yàn)證克隆序列；2)表達(dá)TGF-P3的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建:將TGF-P3cDNA從plasmidpTGF- β 3 (GenBank:ΝΜ_009368, ATCC, Manassas, VA)中擴(kuò)出，克隆到 pBluescript IIKS，通過測(cè)序cDNA雙鏈的方法來(lái)驗(yàn)證克隆序列；3)這些載體通過共轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞GP-293 (CLONTECH, California, USA)的方式被轉(zhuǎn)換成復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒，pVSVG表達(dá)血管炎病毒糖蛋白，用作病毒包膜。病毒載體的滴度是5XIO5—2XIO6的CFUs/ml。改良后的脂肪干細(xì)胞能選擇性的表達(dá)TGF-β 3或ΒΜΡ-4生長(zhǎng)因子。 表達(dá)TGF- β 3或ΒΜΡ-4的脂肪干細(xì)胞可以單獨(dú)使用，也可混合使用。改良后的脂肪干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共同培養(yǎng)，比例是2: I。改良的脂肪干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)在成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中向軟骨細(xì)胞分化的能力比普通的脂肪干細(xì)胞高，產(chǎn)生更多的II型膠原，形成的軟骨球更大更致密，同時(shí)，移植的干細(xì)胞可以在體內(nèi)存活周期延長(zhǎng)達(dá)10周，延長(zhǎng)了生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)損傷部位的修復(fù)作用，促進(jìn)軟骨的生長(zhǎng)和傷口的較快愈合。


圖1:脂肪干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)形成的軟骨塊，脂肪干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞在成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中共培養(yǎng)4周后，進(jìn)行的切片經(jīng)過阿爾新藍(lán)染色，結(jié)果表明轉(zhuǎn)導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞促進(jìn)形成的軟骨塊更致密光滑。A)，C):普通脂肪干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)形成的軟骨快，A)放大培數(shù)100X，B)放大倍數(shù)400。B)，D):BMP+TGF-^3脂肪干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共同培養(yǎng)形成的軟骨塊，C)放大培數(shù)100X，D)放大倍數(shù)400。圖2:脂肪干細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)后能持續(xù)的顯著表達(dá)BMP-4和TGF-β 3，轉(zhuǎn)導(dǎo)后脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)基中ΒΜΡ-4蛋白水平通過Western Blot方法來(lái)估計(jì)，TGF-β 3由相應(yīng)的ELISA試劑盒檢驗(yàn)(R&D System, Inc., Minneapolis, Minnesota, USA), 一周后，BMP-4 的分泌濃度達(dá)到每24小時(shí)產(chǎn)生120ng/106細(xì)胞，之后繼續(xù)保持這個(gè)水平范圍。TGF-β 3的濃度達(dá)到每24小時(shí)產(chǎn)生220ng/106細(xì)胞。圖3:轉(zhuǎn)導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)產(chǎn)生的II型膠原有顯著增加，4周后，通過qPCR的方法來(lái)檢測(cè)II型膠原的mRNA表達(dá)，為了便于在不同樣本間進(jìn)行比較，我們采用mRNA相對(duì)于GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的相對(duì)表達(dá)量，在共培養(yǎng)的條件下,II型膠原表達(dá)的更多。圖4:轉(zhuǎn)導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞和軟骨共培養(yǎng)能促進(jìn)糖胺聚糖(Glycosaminoglycans)的產(chǎn)生，培養(yǎng)基質(zhì)的切片去石蠟化后用含1，9_氯化二甲基亞甲基藍(lán)(DMMB)的PBE溶液染色，然后用分光光度測(cè)定GAG的含量，經(jīng)過矯正，在軟骨數(shù)目相同情況下，與轉(zhuǎn)導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞共同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的GAG比與普通脂肪干細(xì)胞共同培養(yǎng)高出2-3倍，GAG的含量增加表明了基質(zhì)含量的增強(qiáng)。
具體實(shí)施例方式為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖詳予說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的授權(quán)之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。1.人脂肪干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)I)在軟骨取樣前10天左右，從患者大腿或腹部提取大約20ml脂肪，進(jìn)行脂肪間質(zhì)血管部分細(xì)胞分離和培養(yǎng)傳代:無(wú)菌條件下取脂肪組織，小心去除附著的纖維和血管，用滅菌的PBS充分洗脫以去除雜質(zhì)和血細(xì)胞[I]。I型膠原蛋白酶(lmg/mL)消化(放入37°C震顫水浴槽中60min)，產(chǎn)物通過100 μ m的尼龍篩過濾去除雜質(zhì)，470 X g離心5min，去除漂浮的脂肪細(xì)胞及上清液，DMEM培養(yǎng)液(DMEM，Invitrogen ;含10%胎牛血清、0.2mM抗壞血酸，1001^*1111-1青霉素和1001^*1111-1鏈霉素)重懸細(xì)胞，470X g離心5min。去除上清液，重懸沉淀細(xì)胞，在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中孵育。24小時(shí)后，用顯微鏡觀察，沒貼壁的細(xì)胞用PBS 洗去，培養(yǎng)液換成 Keratinocyte-SFM (Invitrogen,含 0.2mM 抗壞血酸,0.09mM I丐，5ng/mLrEGF, and5% FBS)。細(xì)胞生長(zhǎng)至75 % 90 %融合時(shí)傳代，每2 3d更換培養(yǎng)液。2)脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)2周后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。2.軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)I)在征得風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者同意后，活檢期間，通過關(guān)節(jié)鏡手術(shù)，從非負(fù)重區(qū)取一塊所需量軟骨組織，例如膝關(guān)節(jié)股骨髁間窩。為了得到純度高的軟骨細(xì)胞，沒有其它類型細(xì)胞的污染，在距離滑膜5mm遠(yuǎn)的地方取一小塊軟骨，重IOOmg左右，大約米粒大小。2)用精細(xì)剪刀將其剪成lmm3的小塊，用PBS沖洗后置于II型膠原酶(0.15% )中，370C條件下消化20-22小時(shí)。用軟骨細(xì)胞增殖培養(yǎng)基配置膠原酶溶液。該培養(yǎng)基成分是 Dulbecco’ s Modified Eagle Medium(DMEM),并添加 10% FBS, I %非必需氨基酸,0.2mM抗壞血酸-2-磷酸(AsAP), 0.4mM脯氨酸，100U/mL青霉素，100mg/mL鏈霉素。3)將軟骨細(xì)胞收集起來(lái)，計(jì)數(shù)，不需要進(jìn)行平板細(xì)胞培養(yǎng)，直接混合準(zhǔn)備好的脂肪干細(xì)胞共同培養(yǎng)。3.逆轉(zhuǎn)錄病毒制備

1)ΒΜΡ-4的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建:人BMP-4的cDNA通過PCR從相應(yīng)的噬菌體克隆擴(kuò)增出來(lái)，BMP4-1 (CCGCTCGAGGCGGCCGCCCACCATGCTGATGGTCGTTTTATTATG)和 BMP4-2 (TCCATCGATAGATCTATCCTCAAGGACTGCCTG)引物被用來(lái)擴(kuò)增表達(dá)BMP4的構(gòu)架。cDNA克隆到pBluescript II KS后，通過測(cè)序cDNA雙鏈的方法來(lái)驗(yàn)證克隆序列。2)表達(dá)TGF- β 3的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建:將TGF- β 3cDNA從plasmidpTGF- β 3 (GenBank:NM_009368, ATCC, Manassas, VA)中擴(kuò)出，克隆到 pBluescript II KS,通過測(cè)序cDNA雙鏈的方法來(lái)驗(yàn)證克隆序列。3)這些載體通過共轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞GP-293 (CLONTECH，California, USA)的方式被轉(zhuǎn)換成復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒。PVSVG表達(dá)血管炎病毒糖蛋白，用作病毒包膜。病毒載體的滴度，估計(jì)是5 X105—2 XIO6的CFUs/ml。4.逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)脂肪干細(xì)胞I)將脂肪干細(xì)胞接種于IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿，5X106cell/皿(總共IOml完全培養(yǎng)基)，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h待細(xì)胞密度達(dá)70% -80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)。2)這些細(xì)胞分別用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。在MOI為5，聚凝胺(polybrene)為8微克
/毫升。2周培養(yǎng)后使用。 5.轉(zhuǎn)導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)將軟骨細(xì)胞和未感染或感染后的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)，以觀察干細(xì)胞性能的增強(qiáng)對(duì)軟骨形成的影響。表達(dá)BMP-4和TGF-0 3的脂肪干細(xì)胞以1:1比例混合。在共培養(yǎng)體系中，脂肪干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的比例是2: I。將細(xì)胞混合后，500g離心5分鐘，形成一個(gè)扁平的塊狀物。在成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在相應(yīng)的時(shí)間段取樣進(jìn)行分析。
權(quán)利要求
1.一種用于軟骨損傷修復(fù)的改良脂肪干細(xì)胞，其特征在于，通過病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式改良脂肪干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式，其逆轉(zhuǎn)錄病毒制備方法為: DBMP-4的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建:人BMP-4的cDNA通過PCR從相應(yīng)的噬菌體克隆擴(kuò)增出來(lái)，BMP4-1(CCGCTCGAGGCGGCCGCCCACCATGCTGATGGTCGTTTTATTATG)和BMP4-2 (TCCATCGATAGATCTATCCTC AAGGACTGCCTG)引物被用來(lái)擴(kuò)增表達(dá) BMP4 的構(gòu)架，cDNA克隆到pBluescript II KS后,通過測(cè)序cDNA雙鏈的方法來(lái)驗(yàn)證克隆序列； 2)表達(dá)TGF-β3的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建:將TGF-β 3 cDNA從plasmidpTGF-β 3 (GenBank:NM_009368, ATCC, Manassas, VA)中擴(kuò)出，克隆到 pBluescript II KS,通過測(cè)序cDNA雙鏈的方法來(lái)驗(yàn)證克隆序列；3)這些載體通過共轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞GP-293(CLONTECH，California, USA)的方式被轉(zhuǎn)換成復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒，PVSVG表達(dá)血管炎病毒糖蛋白，用作病毒包膜。病毒載體的滴度是5 XIO5—2 XIO6 的 CFUs/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞，其特征在于，改良后的脂肪干細(xì)胞能選擇性的表達(dá)TGF- β 3或ΒΜΡ-4生長(zhǎng)因子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脂肪干細(xì)胞，其特征在于，表達(dá)TGF-4或ΒΜΡ-7的脂肪干細(xì)胞可以單獨(dú)使用，也可混合使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞，其特征在于，改良后的脂肪干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共同培養(yǎng)，比例是2: I。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的脂肪干細(xì)胞，其特征在于，改良的脂肪干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)在成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中向軟骨細(xì)胞分化的能力比普通的脂肪干細(xì)胞高，產(chǎn)生更多的II型膠原，形成的軟骨球更大更致密，同時(shí)，移植的干細(xì)胞可以在體內(nèi)存活周期延長(zhǎng)達(dá)10周，延長(zhǎng)了生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)損傷部位的修復(fù)作用，促進(jìn)軟骨的生長(zhǎng)和傷口的較快愈合。
全文摘要
本發(fā)明通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-4)或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β3)，這種性能增強(qiáng)的干細(xì)胞具有很好的增殖能力和軟骨修復(fù)能力，是一種很好的用于軟骨損傷修復(fù)的工具。考慮到BMP-4和TGF-β3對(duì)干細(xì)胞的調(diào)節(jié)和營(yíng)養(yǎng)作用，本發(fā)明通過病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法讓干細(xì)胞充分的表達(dá)這些營(yíng)養(yǎng)因子，這些改良的脂肪干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)在成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中向軟骨細(xì)胞分化的能力比普通的脂肪干細(xì)胞高，產(chǎn)生更多的II型膠原，形成的軟骨球更大更致密，同時(shí)，移植的干細(xì)胞在體內(nèi)存活周期延長(zhǎng)，延長(zhǎng)了生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)損傷部位的修復(fù)作用，促進(jìn)軟骨的生長(zhǎng)和傷口的較快愈合。
文檔編號(hào)C12N15/867GK103087992SQ20131001596
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者付擎昊, 康賢通, 章戴榮 申請(qǐng)人:廣州萊德爾生物科技有限公司