專利名稱：來自貼壁胎盤干細(xì)胞的肝細(xì)胞和軟骨細(xì)胞；以及CD34⁺、CD45^-胎盤干細(xì)胞富集的細(xì)胞群的制作方法
來自貼壁胎盤干細(xì)胞的肝細(xì)胞和軟骨細(xì)胞； 以及CD34+、 CD45—胎盤干細(xì)胞富集的細(xì)胞群
本申請(qǐng)要求2007年2月12日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/901,066; 2007 年2月12日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/901,076; 2007年3月7日提交的美 國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/905,664 ; 2007年3月8日^是交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?60/906,064;和2007年8月28日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/966,577的權(quán)益， 各申請(qǐng)的公開內(nèi)容在此通過引用并入本文。
1. 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明提供了與來自胎盤的干細(xì)胞有關(guān)的方法和組合物。本發(fā)明提供 了由人貼壁胎盤干細(xì)胞產(chǎn)生肝細(xì)胞的方法，以及這類肝細(xì)胞在治療和干預(yù) 例如肝臟的創(chuàng)傷、炎性疾病和退行性疾病中的用途。本發(fā)明還提供了與納 米纖維支架和貼壁胎盤干細(xì)胞的組合有關(guān)的組合物和方法，以及使用它們 修復(fù)軟骨的方法。最后，本發(fā)明提供了與來自胎盤的非貼壁CD34+CD45— 干細(xì)胞有關(guān)的組合物和方法。
2.
背景技術(shù)：
人們已經(jīng)4是出將體干細(xì)胞用于多種治療應(yīng)用，包括例如在細(xì)胞補(bǔ)給治 療動(dòng)物模型中的應(yīng)用。只有在使用了倫理上可接受來源的自體干細(xì)胞、且 只有在實(shí)現(xiàn)了對(duì)自身更新和程序干細(xì)胞成熟為特定細(xì)胞類型的最終確定的 控制的情況下，移植干細(xì)胞的治療潛能才能轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。許多研究已經(jīng)描述過胚胎干細(xì)胞沿肝細(xì)胞系的分化(參見例如Sharma, N. S.等，Sw/ec/wo/o幻,'在5/oe"gz'"eer/wg, 94 (6): 1053-93 (2006); Maguire， T. 等，6/otec/ "o/ogy & 6/oe"g/ween'"g, 93(3):581-591(2006)和Chen Y等，Ce〃 r脂—"L 2006;15(10):865-71)。另外，還研究了人骨髓來源間充質(zhì)細(xì)胞分 化為功能肝細(xì)胞的能力，其取得了一定程度的成功(Ong SY, Dai H， Leong KW, 775匿2006年10月1曰^ Ong SY, Dai H， Leong KW腸願(yuàn)fer油 (22):4087-97 (2006)(電子公開2006年4月17日)；Sato Y, Araki H, Kato J, Nakamura K，脅od〗06(2):756-63 (2005)(電子公開2005年4月7曰)。
肝病日漸成為重大發(fā)病率和死亡率的原因。環(huán)境和致病因素所致的肝 臟功能破壞對(duì)健康的個(gè)體構(gòu)成重大的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。因此替換這類損壞器 官中損壞或殺死的肝細(xì)胞成為重要的臨床目標(biāo)。然而，倫理上可接受來源 的、能夠分化成為肝細(xì)胞的干細(xì)胞依然難以獲得。本發(fā)明提供了這樣那樣 未滿足的需求。
3.發(fā)明概述
一方面，本發(fā)明提供了由貼壁胎盤干細(xì)胞產(chǎn)生肝細(xì)胞的方法和組合物， 以及利用這類肝細(xì)胞治療疾病、病癥或不適的方法，例如涉及肝臟的創(chuàng)傷、 炎癥和系統(tǒng)性疾病的那些，例如與肝炎癥相關(guān)的疾病、病癥或不適。在一 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生肝細(xì)胞的方法，包括在足以使胎盤千細(xì)胞 呈現(xiàn)肝細(xì)胞特征的條件和時(shí)間下培養(yǎng)所述胎盤干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中， 所述特征是產(chǎn)生白蛋白或表達(dá)編碼白蛋白的基因。在另 一具體實(shí)施方案中， 所述特征是產(chǎn)生脲。在另一具體實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)包括將所述干細(xì)胞 與丁酸鈉接觸。在另一具體實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)包括將所述干細(xì)胞膠囊化在褐藻膠-聚-L-賴氨酸之中。在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過 胎盤來源干細(xì)胞分化而產(chǎn)生的肝細(xì)胞。本發(fā)明還提供了治療患有與異常肝 臟功能相關(guān)的疾病、病癥或不適的患者的方法，包括向所述患者體內(nèi)導(dǎo)入 這樣的肝細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述疾病、病癥或不適是肝硬化。 在某些實(shí)施方案中，所述疾病或不適由例如因酒精或毒素如蘑菇毒素?cái)z取 所致的肝臟毒性而引起。在某些實(shí)施方案中，所述疾病或不適是病毒感染， 例如甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎感染。在某些實(shí)施方案中，所述 疾病或不適是爆發(fā)性或亞爆發(fā)性肝炎。另一方面，本發(fā)明提供了確定化合 物是否具有肝臟毒性活性的方法，包括將通過胎盤來源干細(xì)胞分化而產(chǎn)生 的肝細(xì)胞與所述化合物接觸，并確定所述化合物是否對(duì)肝細(xì)胞具有毒性。
在另一實(shí)施方案中，胎盤干細(xì)胞為細(xì)胞角蛋白18陽性。在另一實(shí)施方 案中，本發(fā)明提供了胎盤干細(xì)胞群或由之分化的細(xì)胞群，其中至少50%、
70%、 80%、 90%、 95%或99%為細(xì)胞角蛋白18陽性。在另一實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供了含有胎盤干細(xì)胞或由之分化的細(xì)胞的細(xì)胞群，其中至少50%、 70%、 80%、 90%、 95%或99%的所述胎盤干細(xì)胞或由之分化的細(xì)胞為細(xì)胞 角蛋白18陽性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離胎盤干細(xì)胞、或胎 盤干細(xì)胞群、或由之分化的細(xì)胞的方法，其包括選擇一種或多種細(xì)胞角蛋 白18+胎盤干細(xì)胞，和從其它胎盤細(xì)胞中分離所述一種或多種干細(xì)胞。
另 一方面，本發(fā)明提供了含有多種膠囊化在褐藻膠之中的細(xì)胞的組合 物，其中所述細(xì)胞由胎盤干細(xì)胞分化而來。在一實(shí)施方案中，所述細(xì)胞表 達(dá)至少一種不為胎盤干細(xì)胞所表達(dá)、或表達(dá)程度與胎盤干細(xì)胞具有可檢測(cè) 差異的肝細(xì)胞標(biāo)記。在另一實(shí)施方案中，所述褐藻膠為珠子的形式。在具體實(shí)施方案中，所述珠子大小為大約200(im至大約800 pm。在另一具體實(shí) 施方案中，所述珠子平均大小為大約500 pm。
另 一 方面，本發(fā)明提供了含有人胎盤干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞或肝原性細(xì) 胞的小鼠，其中所述小鼠的生產(chǎn)方法包括步驟(a)用足以基本上殺死所有 內(nèi)源骨髓細(xì)胞的y輻射輻照所述小鼠；(b)向所述小鼠施用足夠的來自 NOD/SC.ID小鼠的骨髓或骨髓來源細(xì)胞，以重建小鼠的造血系統(tǒng)；和(c)向 所述小鼠移植多種肝細(xì)胞或肝原性細(xì)胞，其中所述肝細(xì)胞或肝原性細(xì)胞由 多種CD10+、 CD34\ CD105+、 CD17\ CD200+胎盤干細(xì)胞分化而來。在 一實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞還另外是細(xì)胞角蛋白18+的，且是至少一種 由分化的肝細(xì)胞所表達(dá)的其它細(xì)胞角蛋白陰性的。在另一實(shí)施方案中，所 述肝細(xì)胞或肝原性細(xì)胞施用至小鼠的耳殼。在另一實(shí)施方案中，所述肝細(xì) 胞或肝原性細(xì)胞用病毒感染。在具體實(shí)施方案中，所述病毒是甲型肝炎病 毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。在更 具體的實(shí)施方案中，所述病毒是乙型肝炎病毒。
另一方面，本發(fā)明提供了鑒定抗病毒劑的方法，包括將小鼠與感興趣 的化合物接觸，其中來自所述小鼠的血清具有可檢測(cè)水平的病毒，且其中 與來自所述小鼠、未接觸感興趣的化合物的血清相比，如果所述接觸導(dǎo)致 來自所述小鼠的血清中所述病毒的量可檢測(cè)的下降，則所述化合物為抗病 毒劑，且其中所述小鼠的生產(chǎn)方法包括步驟a.用足以基本上殺死所有內(nèi)源 骨髓細(xì)胞的y輻射輻照所述小鼠；b.向所述小鼠施用足夠的來自NOD/SCID 小鼠的骨髓或骨髓來源細(xì)胞，以重建小鼠的造血系統(tǒng)；和c.向所述小鼠移 植多種肝細(xì)胞或肝原性細(xì)胞，其中所述肝細(xì)胞或肝原性細(xì)胞多種CD10+、 CD34\ CD105+、 CD117\ CD200+胎盤干細(xì)胞分化而來。在所述方法的一實(shí)施方案中，所述病毒是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。在所述方法的具體實(shí)施方案中，檢測(cè)所述病毒的抗原或核酸。在更具體的實(shí)施方案中，所述病毒為乙型肝炎病毒。
在所述方法的具體實(shí)施方案中，其中檢測(cè)病毒抗原，所述抗原是HBeAg或HBsAg。在另一具體實(shí)施方案中，其中檢測(cè)病毒核酸，所述核酸為共價(jià)閉環(huán)形式的乙型肝炎病毒。在更具體的實(shí)施方案中，使用特異于所述共價(jià)閉環(huán)形式乙型肝炎病毒的引物通過PCR來檢測(cè)所述核酸。
另一方面，本發(fā)明提供了基質(zhì)以及含有這樣的基質(zhì)的組合物，其中所述基質(zhì)包含已經(jīng)向肝原性或軟骨原性系或者肝細(xì)胞或軟骨細(xì)胞分化的胎盤干細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)為三維支架。在另一更具體的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)包含膠原、明膠、層祐連蛋白、纖粘連蛋白、果膠、鳥氨酸或玻連蛋白。在另一更具體的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是或者包含納米纖維支架，例如電鍍納米纖維支架。在更具體的實(shí)施方案中，所述納米纖維支架包含聚L-乳酸(PLLA)、 I型膠原、偏二氟乙烯和三氟乙烯的共聚物(PVDF-TrFE)、聚己內(nèi)酯、聚(L-丙交酯-共-s-己內(nèi)酯)[P(LLA-CL)](例如75:25)，和/或聚(3-羥基丁酸-{3-羥基戊酸)(PHBV)和I型膠原的共聚物。在更具體的實(shí)施方案中，所述電鍍納米纖維支架促進(jìn)胎盤干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞或肝細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述電鍍納米纖維基質(zhì)或支架包含已經(jīng)分化為軟骨性細(xì)胞和/或軟骨細(xì)胞、或者肝性細(xì)胞和/或肝細(xì)胞的胎盤干細(xì)胞。在另一更具體的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是羊膜或羊膜來源的生物材料。在另一更具體的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)包含胞外膜蛋白。在另一更具體的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)包含合成化合物。在另一更具體的實(shí)施方
案中，所述基質(zhì)包含生物活性化合物。在另一更具體的實(shí)施方案中，所述
11生物活性化合物是生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、抗體或小于5,000道爾頓的有機(jī)分子。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含分離的貼壁CD10+、 CD34—、CD105+、 CD200+胎盤干細(xì)胞和電鍍納米纖維支架的組合物。在具體實(shí)施方案中，所述納米纖維支架包含纖維聚L-乳酸(PLLA)、聚乳酸乙醇酸(PLGA)、I型膠原、偏二氟乙歸和三氟乙烯的共聚物(PVDF-TrFE)、聚己內(nèi)酯、聚(L-丙交酯-共-s-己內(nèi)酯)[P(LLA-CL)](例如75:25)，和/或聚(3-羥基丁酸-#3-鞋基戊酸)(PHBV)和I型膠原的共聚物。在另一具體實(shí)施方案中，所述納米纖維支架包含平均厚度大約250納米至大約10 pm的纖維。在另一具體實(shí)施方案中，所述組合物與胎盤干細(xì)胞分化為軟骨原性細(xì)胞或軟骨細(xì)胞的條件接觸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備組合物的方法，包括將分離的貼壁CD10+、 CD34—、 CD105+、 CD200+胎盤干細(xì)胞與電鍍納米纖維支架接觸，其中所述納米纖維支架通過在大約20 kV、針距離收集器大約30cm、以大約0.05 mL/min至大約0.1 mL/min的流速電鍍PLLA或PLGA制備，其中所述PLLA或PLGA處于大約10% w/w至大約20。/。w/w的溶液中。
另 一 方面，本發(fā)明提供了分離的CD34+和CD45—月臺(tái)盤干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述CD34+、 CD45-干細(xì)胞是造血細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述CD34+、 CD45-干細(xì)胞在組織培養(yǎng)表面如在塑料上培養(yǎng)時(shí)是非貼壁的。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的富集CD34+和CD45-胎盤干細(xì)胞的細(xì)胞群。在具體實(shí)施方案中，所述群中至少50%、 70%、卯％或95%的細(xì)胞為CD34+CD45-胎盤干細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，與胎盤灌洗液(例如用750 mL 0.9%鹽溶液灌洗胎盤而得的灌洗液)相比，所述分離的細(xì)胞群包含更高比例的CD34+和CD45—胎盤干細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述分離的細(xì)胞群包含非CD34+和CD45—的干細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述非CD34+和CD45—的干細(xì)胞是CD34—貼壁胎盤干細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述貼壁胎盤干細(xì)胞為CD200+、 CD105+、 CD90+、 CD10+、 CD34—和/或CD45-的。在另一具體實(shí)施方案中，所述非CD34+和CD45-的干細(xì)胞為骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述非CD34+和CD45—的干細(xì)胞為CD34+、 CD45+造血干細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述非CD34+和CD45—的干細(xì)胞包含在臍帶血或胎盤血之中
在另 一具體實(shí)施方案中，所述分離的細(xì)胞群為來自胎盤灌洗液的多種總有核細(xì)胞(TNC)。在具體實(shí)施方案中，所述來自胎盤灌洗液的TNC包含來自至少或至多50、 100、 150、 200、 250、 300、 350、 400、 450或500 mL胎盤灌洗液的胎盤細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述來自胎盤灌洗液的TNC已經(jīng)過處理以除去至少 一種類型的非紅血細(xì)胞。
在另一實(shí)施方案中，CD34+、 CD45—造血胎盤干細(xì)胞是胎兒的(不是母體的)。在另一實(shí)施方案中，CD34+、 CD45—造血胎盤千細(xì)胞是母體的。在另一實(shí)施方案中，分離的造血胎盤干細(xì)胞群包含胎兒的(不是母體的)CD34+、CD45—造血胎盤干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，分離的造血胎盤干細(xì)胞群包含母體的CD34+、 CD45—造血胎盤干細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供了分離CD34+、 CD45—造血胎盤干細(xì)胞的方法。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離CD34+、 CD45-胎盤干細(xì)胞群的方法，包括從胎盤細(xì)胞群中選擇CD34+細(xì)胞以形成分離的CD34+胎盤細(xì)胞群，和從所述CD34+胎盤細(xì)胞群中去除CD45+細(xì)胞，由此產(chǎn)生CD34+、 CD45—胎盤干細(xì)胞群。在具體實(shí)施方案中，所述CD34+細(xì)胞的選擇通過免疫分離進(jìn)行。在另一具體實(shí)施方案中，所述CD45+細(xì)胞的去除是通過免疫分離進(jìn)行。在另 一具體實(shí)施方案中，所述選擇或所述去除通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行。
另一方面，本發(fā)明提供了增補(bǔ)細(xì)胞群的方法，包括添加多種CD34+、CD45—造血胎盤干細(xì)胞以創(chuàng)建增補(bǔ)細(xì)胞群，從而使所述增補(bǔ)細(xì)胞群比增補(bǔ)前包含明顯更多的CD34+、 CD45—細(xì)胞。在本發(fā)明的多個(gè)具體實(shí)施方案中，"明顯上更多"表示至少多1%、 2%、 3%、 4%、 5%、 6%、 7%、 8%、 9%或多至少10%。在其它具體實(shí)施方案中，待增補(bǔ)的細(xì)胞群包括臍帶血、胎盤血、外周血或其組合。在更具體的實(shí)施方案中，待增補(bǔ)的細(xì)胞群是臍帶血、胎盤血、外周血或其組合。在另 一更具體的實(shí)施方案中，待增補(bǔ)的細(xì)胞群包含從臍帶血、胎盤血、外周血或其組合分離的有核細(xì)胞。在其它具體實(shí)施方案中，待增補(bǔ)的干細(xì)胞群包括造血干細(xì)胞群、成人干細(xì)胞群或胚胎干細(xì)胞群。
如本發(fā)明中使用的，術(shù)語"SH2指與標(biāo)記CD105上的表位結(jié)合的抗體。因此，稱作SH2+的細(xì)胞為CD 105+的。
如本發(fā)明中使用的，術(shù)語"SH3和"SH4指與標(biāo)記CD73上存在的表位結(jié)合的抗體。因此，稱作SH3+和/或SH4+的細(xì)胞為CD73+的。
如本發(fā)明中使用的，術(shù)語"分離的干細(xì)胞"表示基本上與干細(xì)胞所來源的組織(如胎盤)中的其它、非干細(xì)胞分離的干細(xì)胞。如果在例如干細(xì)胞的收集和/或培養(yǎng)過程中，從干細(xì)胞中去除了至少50%、 60%、 70%、 80%、 90%、95%、或至少99%的與干細(xì)胞天然相伴的非干細(xì)胞或展示不同標(biāo)記譜的干細(xì)胞，則所述干細(xì)胞是"分離的"。
如本發(fā)明中使用的，術(shù)語"分離細(xì)胞的群"表示基本上與細(xì)胞群所來源的組織(如胎盤)中的其它細(xì)胞分離的細(xì)胞的群。如果在例如干細(xì)胞的收集和/或培養(yǎng)過程中，從干細(xì)胞中去除了至少50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、或至少99%的與細(xì)胞群或者細(xì)胞群來自的細(xì)胞天然相伴的細(xì)胞(即展示不同標(biāo)記譜的干細(xì)胞)，則所述干細(xì)胞是"分離的"。
如本發(fā)明中使用的，術(shù)語"胎盤干細(xì)胞"指來源于哺乳動(dòng)物胎盤的干細(xì)胞或前體細(xì)胞，例如多能細(xì)胞，不考慮形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)記、或原代培養(yǎng)后的傳代數(shù)。然而，本發(fā)明所用的術(shù)語"胎盤干細(xì)胞"不表示滋養(yǎng)層、細(xì)胞滋養(yǎng)層、胚胎生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞。如果細(xì)胞保留了干細(xì)胞的至少一種屬性，例如與一種或多種類型的干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記或基因表達(dá)譜；在培養(yǎng)中復(fù)制至少10-40次的能力；多能性，例如在體外、在體內(nèi)或在體內(nèi)和體外分化為三個(gè)胚層中的 一個(gè)或多個(gè)胚層的能力；缺乏成體(即分化的)細(xì)胞特征等等，則認(rèn)為所述細(xì)胞是"干細(xì)胞"。術(shù)語"胎盤干細(xì)胞"和"胎盤來源的干細(xì)胞"可互換使用。除非文中另有說明，術(shù)語"胎盤"包括臍帶。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開的貼壁胎盤干細(xì)胞在體外是多能的(即細(xì)胞在體外在分化條件下分化)，在體內(nèi)是多能的(即細(xì)胞在體內(nèi)分化)，或兩者兼而有之。
如本發(fā)明中使用的，當(dāng)特定標(biāo)記可檢測(cè)地高于背景時(shí)，則干細(xì)胞為該具體標(biāo)記"陽性"。例如，由于例如通過流式細(xì)胞儀，CD73在胎盤干細(xì)胞上以可檢測(cè)地大于背景(例如，與同型對(duì)照相比)的量可檢測(cè)，因此胎盤干細(xì)胞為CD73陽性。當(dāng)標(biāo)記能用于將細(xì)胞與至少一種其它細(xì)胞類型區(qū)分開時(shí)，或當(dāng)所述標(biāo)記在細(xì)胞中存在或表達(dá)時(shí)能用于選擇或分離所述細(xì)胞時(shí)，則所述細(xì)胞也為所述標(biāo)記陽性的。在例如抗體介導(dǎo)的檢測(cè)的上下文中，"陽性"作為特定細(xì)胞表面標(biāo)記存在的指示，表示所述標(biāo)記利用該標(biāo)記的特異性4元體如熒光標(biāo)記抗體可檢測(cè)；"陽性"也表示細(xì)胞以產(chǎn)生例如在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中可檢測(cè)地高于背景的信號(hào)的量攜帶該標(biāo)記。例如，在細(xì)胞用CD200特異性抗體
15可檢測(cè)地標(biāo)記，且來自所述抗體的信號(hào)可檢測(cè)地高于對(duì)照(例如背景)的情況下，則所述細(xì)胞為"CD200+的"。相反，相同上下文中的"陰性"表示與背景相比，利用該標(biāo)記特異性抗體不能檢測(cè)到細(xì)胞表面標(biāo)記。例如，當(dāng)細(xì)胞用
CD34特異性抗體不能可檢測(cè)地標(biāo)記時(shí)，則所述細(xì)胞為"CD34—的"。除非另有說明，利用抗體檢測(cè)分化簇("CD")標(biāo)記。如果利用RT-PCR可檢測(cè)到OCT-4,則OCT-4確定存在且細(xì)胞為"OCT-4+的"。
如本發(fā)明中使用的，"分離的"胎盤干細(xì)胞，例如貼壁胎盤干細(xì)胞或CD34+、 CD45-千細(xì)胞，表示去除了至少20%、 30%、 40%、 50o/o、 60%、 70%、80%、 90%、 95%或99%的在完整哺乳動(dòng)物胎盤中通常與干細(xì)胞相伴的細(xì)胞。當(dāng)來自器官的干細(xì)胞所存在的細(xì)胞群中包含少于50%的在完整器官中與干細(xì)胞通常相伴的細(xì)胞時(shí)，它是"分離的"。當(dāng)"模糊(dim)"與細(xì)胞標(biāo)記聯(lián)用時(shí)，表示所述標(biāo)記可檢測(cè)地高于背景存在，但落在高于背景大約5%至大約10%的范圍內(nèi)。
如本發(fā)明中使用的，"肝細(xì)胞"表示細(xì)胞從視覺上、生化上和/或基因表達(dá)模式上看起來是肝細(xì)胞，正如該術(shù)語通常為人所理解的那樣。如本發(fā)明中使用的，"肝原性細(xì)胞"指由胎盤干細(xì)胞或臍帶干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞，是展示終端分化肝細(xì)胞的 一 種或多種特征的細(xì)胞，所述特征未在胎盤干細(xì)胞或臍帶干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，或者未以相同的水平在向肝細(xì)胞或肝原性細(xì)胞分化之前的胎盤干細(xì)胞或臍帶干細(xì)胞(例如處于擴(kuò)增培養(yǎng)的胎盤干細(xì)胞或臍帶干細(xì)胞)中發(fā)現(xiàn)(例如，當(dāng)在等同條件下與測(cè)定特征的胎盤干細(xì)胞或臍帶干細(xì)胞相比時(shí)，在肝原性細(xì)胞中可檢測(cè)地更高或更低)。因而，本發(fā)明的多種組合物、方法和其它實(shí)施方案也涵蓋來源自胎盤干細(xì)胞、已經(jīng)完全或部分分化為肝細(xì)胞的細(xì)胞。4.


圖l:來自灌洗液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、或羊膜-絨毛膜盤(D)、或 臍帶干細(xì)胞(E)的胎盤干細(xì)胞的活力。X-軸上的數(shù)字表示從中獲得干細(xì)胞的胎盤。
圖2:通過FACSCalibur確定的來自灌洗液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、 或羊膜-絨毛膜盤(D)、或臍帶干細(xì)胞(E)的HLA ABC7CD457CD347CD133 + 細(xì)胞的百分比。X-軸上的數(shù)字表示從中獲得干細(xì)胞的胎盤。
圖3:通過FACS Aria確定的來自灌洗液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、或 羊膜-絨毛膜盤(D)、或臍帶干細(xì)胞(E)的HLA ABC7CD457CD347CD133+細(xì) 胞的百分比。X-軸上的數(shù)字表示從中獲得干細(xì)胞的胎盤。
圖4:在來源于胎盤灌洗液的千細(xì)胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的表達(dá)。
圖5:在來源于羊膜的干細(xì)胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的表達(dá)。
圖6:在來源于絨毛膜的干細(xì)胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD17、 CD200的表達(dá)。
圖7:在來源于羊膜-絨毛膜盤的干細(xì)胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的表達(dá)。
圖8:在來源于臍帶的干細(xì)胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD1丄7、 CD200的表達(dá)。圖9:在來源于灌洗液(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、或羊膜-絨毛膜盤(D)、 或臍帶(E)的干細(xì)胞中的HLA-G、 CDIO、 CD13、 CD33、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD117、 CD200的平均表達(dá)。
圖10:來自六個(gè)匹配的人胎盤灌洗液和臍帶單位的總細(xì)胞的平均百分 比。X軸Y-軸所示表型的總有核細(xì)胞的百分比。
5.發(fā)明詳述
5.1肝細(xì)胞的產(chǎn)生
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)理解，在本節(jié)及后面的討論中，多種組合 物和方法中有的許多可以針對(duì)或利用已沿著肝細(xì)胞系分化或已被沿著肝細(xì) 胞系分化的胎盤干細(xì)胞或臍帶干細(xì)胞進(jìn)行。
一方面，本發(fā)明提供了由胎盤來源細(xì)胞，特別是胎盤干細(xì)胞或臍帶干 細(xì)胞產(chǎn)生肝細(xì)胞和/或肝原性細(xì)胞的方法和組合物。如本發(fā)明中使用的，除 非另有說明，"胎盤干細(xì)胞"或"臍帶干細(xì)胞"表示貼壁干細(xì)胞?？梢酝ㄟ^灌洗 從哺乳動(dòng)物胎盤或臍帶中獲得干細(xì)胞(參見例如Hariri的美國專利號(hào) 7,045,148和7，255，879,在此通過引用并入本文)。也可以通過^5皮壞(例如浸 軟)胎盤或其部分從胎盤或臍帶獲得干細(xì)胞(參見例如下文6.2節(jié))。展示肝細(xì) 胞特4正的細(xì)胞，例如肝細(xì)胞和/或肝原性細(xì)胞，可以從胎盤干細(xì)胞獲得。這 些細(xì)胞可用于治療例如與肝硬化，包括但不限于因酒精攝取、肝毒素例如 在鵝膏屬(^w""/to)蘑菇發(fā)現(xiàn)的那些毒素的攝取所導(dǎo)致的，或因病毒感染例 如甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎感染所導(dǎo)致的硬化相關(guān)的疾病、病 癥或不適。在一實(shí)施方案中，可以如下從胎盤或臍帶中獲得可分化的細(xì)胞，如干 細(xì)胞。從胎盤，例如從人胎盤灌洗液，或從物理和/或酶促破壞的胎盤組織 中分離單核細(xì)胞的原代培養(yǎng)物(MNC)。在提供者知情同意的情況下在足月 嬰兒出生后獲得胎盤。簡(jiǎn)言之，為進(jìn)行灌洗，向臍血管插入導(dǎo)管，使其與
流體控制回路相連，并用含高葡萄糖、1 %肝素和青霉素/鏈霉素的Dulbecco' s 改良Eagle's培養(yǎng)基(DMEM, Gibco/BRL)以例如1 mL/min(室溫，長(zhǎng)達(dá)24小 時(shí))灌洗胎盤。然后收集胎盤灌洗液(750 mL)，離心，將細(xì)胞沉淀重懸于含 1。/o胎牛血清(FBS)的PBS中，然后借助LYMPHOPREP (Gibco/BRL)通過 差速梯度密度離心進(jìn)行分離?；厥蘸邪ㄙN壁胎盤干細(xì)胞在內(nèi)的單核細(xì) 胞的淡黃色層界面，重懸于DMEM/10% FBS，在纖粘連蛋白包被的Falcon 板(Sigma)上鋪板，并在37°C用5%潮濕C02孵育。在24小時(shí)孵育后，棄去 非貼壁細(xì)胞，保留貼壁細(xì)胞，并在新鮮培養(yǎng)基中擴(kuò)增；個(gè)體細(xì)胞集落在10-18 天顯出，并作為胎盤干細(xì)胞系擴(kuò)增。
人貼壁胎盤干細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)展示成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，為HLAI類陽性。 利用FACS分析發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞不表達(dá)造血標(biāo)記CD34或CD45。然而，它們 的確表達(dá)多能細(xì)胞標(biāo)記CD10 (CALLA)、 CD29 整聯(lián)蛋白)、CD54 (ICAM-I)、 CD90 (Thy-1)以及SH2 (CD 105)、 SH3 (CD73)和CD200。在標(biāo) 準(zhǔn)生長(zhǎng)條件下，胎盤干細(xì)胞的倍增時(shí)間為大約18-36小日于，且細(xì)胞在體外維 持這種表型大于40次群倍增。人貼壁胎盤干細(xì)胞有別于人胚胎干細(xì)胞或胚 胎生殖細(xì)胞，區(qū)別在于人胚胎干細(xì)胞或生殖細(xì)胞僅獲自嚢胚或胎兒性腺的 內(nèi)細(xì)胞群而不是胎盤。人貼壁胎盤干細(xì)胞還有別于來自例如骨髓、臍帶血 或外周血的間充質(zhì)干細(xì)胞或骨髓來源干細(xì)胞，區(qū)別在于胎盤干細(xì)胞在培養(yǎng) 時(shí)形成胚狀體樣體，而間充質(zhì)干細(xì)胞或骨髓來源干細(xì)胞不，且胎盤干細(xì)胞相對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞展示獨(dú)特的基因表達(dá)模式。參見2006年12月28日提 交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?1/648,813，其公開內(nèi)容在此通過引用并入本文。
胎盤干細(xì)胞通過在包含丁酸鈉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或通過將所述細(xì)胞月交 囊化在適宜的微膠囊聚合物如褐藻膠-聚-L-賴氨酸之中，從而向肝細(xì)胞分 化。肝細(xì)胞可以如上文所述由胎盤來源干細(xì)胞產(chǎn)生，并如下文所述維持或 培養(yǎng)。肝細(xì)胞分化可以利用流式細(xì)胞4義進(jìn)行評(píng)估，并如下文所述監(jiān)測(cè)特定 的基因表達(dá)或酶活性。
5.2胎盤干細(xì)胞和胎盤干細(xì)胞群
一方面，本發(fā)明提供的方法使用貼壁胎盤干細(xì)胞，即可從胎盤或其部 分(例如羊膜、絨毛膜、羊膜/絨毛膜盤、臍帶等)獲得的干細(xì)胞，其(l)貼壁 于組織培養(yǎng)基質(zhì)；和(2)在適當(dāng)?shù)姆只瘲l件下分化為 一 種或多種非胎盤細(xì)胞 類型，和/或具有組織特異性細(xì)胞特征的細(xì)胞。胎盤干細(xì)胞不來源于、亦不 可來源于血液(例如，胎盤血或臍帶血)或骨髓。
胎盤干細(xì)胞在起源上可以是胎兒或母體的(即，可以具有母親或胎兒的 基因型)。胎盤干細(xì)胞群，或包含胎盤干細(xì)胞的細(xì)胞群，可包含在起源上僅 為胎兒或母體的胎盤干細(xì)胞，或者可以兼而包含胎兒和母體起源的胎盤干 細(xì)胞的混合群。所述胎盤干細(xì)胞，和包含胎盤干細(xì)胞的細(xì)胞群可以通過下 文討論的形態(tài)學(xué)、標(biāo)記和培養(yǎng)特征來鑒定和選擇。
5.2.1物理和形態(tài)學(xué)特征
本發(fā)明公開方法所用的胎盤干細(xì)胞在進(jìn)行原代培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)貼壁 于組織培養(yǎng)基質(zhì)，例如組織培養(yǎng)容器表面(如組織培養(yǎng)塑料)上。培養(yǎng)中(例 如組織培養(yǎng)表面)的胎盤干細(xì)胞一 4殳呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣外觀，從中央細(xì)胞體延伸出大量胞質(zhì)突起。然而，所述胎盤干細(xì)胞與在相同條件下培養(yǎng)的成纖 維細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上不同，因?yàn)樘ケP千細(xì)胞比成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出更大量的此 類突起。形態(tài)學(xué)上，胎盤干細(xì)胞也與造血干細(xì)胞是可區(qū)分的，后者在培養(yǎng) 中通常呈現(xiàn)出更圓的或鵝卵石狀的形態(tài)。
5.2.2細(xì)月包表面、分子和遺傳標(biāo)記
可用于本發(fā)明所公開的方法和組合物的貼壁胎盤干細(xì)胞和貼壁胎盤干 細(xì)胞群，表達(dá)大量可用于鑒定和/或分離該干細(xì)胞或包含干細(xì)胞的細(xì)胞群的 標(biāo)記。本發(fā)明公開的胎盤干細(xì)胞和干細(xì)胞群(即，兩種或多種胎盤干細(xì)胞) 包括從胎盤或其任何部分(例如羊膜、絨毛膜、胎盤絨毛葉、臍帶等)直接 獲得的干細(xì)胞和含干細(xì)胞的細(xì)胞群。胎盤干細(xì)胞群還包括培養(yǎng)中的胎盤干 細(xì)胞群(即，兩種或多種)，以及容器例如袋子中的群。然而，胎盤干細(xì)胞不
是滋養(yǎng)層o
本發(fā)明公開的胎盤干細(xì)胞是多能的，他們能夠在體外分化為三個(gè)胚層 的代表性細(xì)胞，例如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)原性細(xì)胞、心臟 細(xì)胞等等。然而，本發(fā)明公開的胎盤干細(xì)胞無需在體內(nèi)分化才認(rèn)為是多能 或者有用。因此，術(shù)語"胎盤干細(xì)胞"涵蓋本發(fā)明公開的在體外而不在體內(nèi)分 化、在4本內(nèi)而不在4本外分化、或既在4本外又在《本內(nèi)分化的細(xì)胞。在一實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供的胎盤干細(xì)胞能夠在體外分化為三個(gè)胚層中一個(gè)或多
個(gè)胚層的代表性細(xì)胞，但在體內(nèi)如NOD-SCID小鼠中不分化。
貼壁(非造血)月臺(tái)盤干細(xì)胞一般表達(dá)標(biāo)記CD73、 CD105、 CD200、 HLA-G 和/或OCT-4，而不表達(dá)CD34、 CD38或CD45。胎盤干細(xì)胞還能夠表達(dá) HLA-ABC (MHC-I)，但一般不表達(dá)HLA-DR。在具體實(shí)施方案中，貼壁胎盤干細(xì)胞為CD10+、 CD34—、 CD105+和CD200+的。這些標(biāo)記可用于鑒定胎 盤干細(xì)胞，并將胎盤干細(xì)胞與其它干細(xì)胞類型區(qū)分開。由于胎盤干細(xì)胞能 夠表達(dá)CD73和CD 105 ，因此它們具有間充質(zhì)干細(xì)胞樣特征。然而，由于 胎盤干細(xì)胞能夠表達(dá)胎兒特異性標(biāo)記CD200和HLA-G ，因此它們能與間充 質(zhì)干細(xì)胞(例如骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，其既不表達(dá)CD200也不表達(dá) HLA-G)區(qū)分開。以相同的方式，缺少CD34、 CD38和/或CD45表達(dá)將胎盤 干細(xì)胞鑒定為非造血干細(xì)胞。這樣的胎盤干細(xì)胞以及包含這樣的胎盤干細(xì) 胞的細(xì)胞群能夠分化為肝細(xì)胞、肝原性細(xì)胞、肝細(xì)胞群、肝原性細(xì)胞群以 及前述的組合。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用為CD200+和 HLA-G+的分離的胎盤干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述千細(xì)胞還是〔073+ 和CD105+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD34—、 CD38—或 CD45—的。在更具體的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD34—、 CD38—、 CD45—、 CD73+和CD105+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞已經(jīng)過擴(kuò)增，例 如傳代至少一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或至少20 次。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用包含多種為 CD200+、 HLA-G+的胎盤干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述 群中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、 至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的所述胎盤干細(xì)胞為所述 CD200+、 HLA-G十干細(xì)胞。在所述分離的群的具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞 還是CD73+和CD105+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD34—、 CD38—或CD45—的。在更具體的實(shí)施方案中，所述千細(xì)胞還是CD34—、 CD38一、
22CD45—、 CD73+和CD105+的。在另一實(shí)施方案中，當(dāng)在允許胚樣體形成的條 件下培養(yǎng)時(shí)，所述分離群產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)胚樣體。在另一具體實(shí)施方案中， 所述群已經(jīng)過擴(kuò)增，例如傳代至少一次、至少三次、至少五次、至少10次、 至少15次或至少20次。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用為CD73+、 CD105+、 CD200+的分離的胎盤干細(xì)胞。在所述群的具^本實(shí)施方案中，所述 干細(xì)胞還是HLA-G+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD3《、 CD38、戈CD45—的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD34—、 CD38— 和CD45—的。在更具體的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD34—、 CD38—、 CD45— 和HLA-G+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述千細(xì)胞已經(jīng)過擴(kuò)增，例如傳代 至少一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或至少20次。
在另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用包含多種為 CD73+、 CD105+、 CD200+的胎盤干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群。在多個(gè)實(shí)施方案 中，所述群中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至 少60%、至少70% 、至少80%、至少90%或至少95%的所述胎盤干細(xì)胞為 所述CD73+、 CD105+、 CD200+細(xì)胞。在所述群的具體實(shí)施方案中，所述干 細(xì)胞是HLA-G+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是CD34—、 CD38— 或CD45—的。在另一具4本實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是CD34—、 CD38—和CD45— 的。在更具體的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是CD34—、 CD38—、 CD45—和HLA-G+ 的。在另一具體實(shí)施方案中，當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，所述 細(xì)胞群產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)胚樣體。在另一具^r、實(shí)施方案中，所述群已經(jīng)過擴(kuò) 增，例如傳代至少一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或 至少20次。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用為CD200+、
OCT-4+的分離的胎盤干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD73+ 和CD105+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是HLA-G+的。在另 一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD34'、 CD38—和CD45—的。在更具體 的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD3《、CD38'、 CD45\ CD73+、 CD105+ 和HLA-G+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞已經(jīng)過擴(kuò)增，例如傳代 至少一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或至少20次。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用包含多種為 CD200+、 OCT-4+的胎盤干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述 群中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、 至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的所述胎盤干細(xì)胞為所述 CD200+、 OCT-4+細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是€073+和€0105+ 的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是HLA-G+的。在另一具體實(shí)施方 案中，所述干細(xì)胞是CD34-、 CD38—和CD45—的。在更具體的實(shí)施方案中， 所述干細(xì)胞是CD34—、 CD38-、 CD45\ CD73+、 CD105+和HLA-G+的。在另
一具體實(shí)施方案中，當(dāng)在允i牛胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，所述群產(chǎn)生一 個(gè)或多個(gè)胚樣體。在另一具^本實(shí)施方案中；所述群pj經(jīng)過擴(kuò)增，例如傳代
至少一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或至少20次。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用為CD73+、CD105+
和HLA-G+的分離的胎盤干細(xì)胞。在上述多種細(xì)胞的具體實(shí)施方案中，所述
干細(xì)胞還是CD34—、 CD38—或CD45'的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)
胞還是CD3《、CD38—和CD45—的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還
是OCT-4+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD200+的。在更具體的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD34—、 CD38—、 CD45—、 OCT-4+和 CD200+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞已經(jīng)過擴(kuò)增，例如傳代至 少一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或至少20次。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用包含多種為 CD73+、 CD105+和HLA-G+的胎盤干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群。在多個(gè)實(shí)施方案 中，所述群中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至 少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的所述胎盤干細(xì)胞為 所述CD73+、 CD105+和HLA-G+細(xì)胞。在上述多種細(xì)胞的具體實(shí)施方案中， 所述干細(xì)胞還是CD34—、 CD38—或CD45—的。在另一具體實(shí)施方案中，所述 干細(xì)胞還是CD3《、CD3K和CD45—的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì) 胞還是OCT-4+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD200+的。 在更具體的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD34—、 CD38—、 CD45—、 OCT-4+ 和CD200+的。在另一具體實(shí)施方案中，所述群已經(jīng)過擴(kuò)增，例如傳代至少 一次、至少三次、至少五次、至少10次、至少15次或至少20次。
在另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用包含多種為 CD73+、 CD105+干細(xì)胞的胎盤干細(xì)胞的分離的細(xì)胞群，其中所述多種的細(xì) 胞在允許胚樣體形成的條件下形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體。在多個(gè)實(shí)施方案中， 所述群中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、 至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的所述胎盤干細(xì)胞為所述CD73+、 CD105+干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD34—、 CD38—或CD45— 的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是CD34—、 CD38—和CD45—的。 在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還是OCT-4+的。在更具體的實(shí)施方案 中，所述干細(xì)胞還是OCT-4+、 CD34\ CD38—和CD45—的。在另 一具體實(shí)施
25方案中，所述群已經(jīng)過擴(kuò)增，例如傳代至少一次、至少三次、至少五次、
至少10次、至少15次或至少20次。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用包含多種為 OCT-4+干細(xì)胞的胎盤干細(xì)胞的分離細(xì)胞群，其中當(dāng)所述群在允許胚樣體形 成的條件下培養(yǎng)時(shí)形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述群中 至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%或至少95%的所述胎盤細(xì)胞是所述OCT-4+干細(xì) 胞。在上述群的具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是CD73+和CD105+的。在另 一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是CD34—、 CD38—或CD45—的。在另 一具體 實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是CD200+的。在更具體的實(shí)施方案中，所述干細(xì) 胞是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34\ CD38—和CD45—的。在另 一具J本實(shí) 施方案中，所述群已經(jīng)過擴(kuò)增，例如傳代至少一次、至少三次、至少五次、 至少10次、至少15次或至少20次。
在另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用分離的胎盤干細(xì) 胞或者包含多種胎盤干細(xì)胞的細(xì)胞群，該胎盤干細(xì)胞為CD29+、 CD44+、 CD73+、 CD90+、 CD105+、 CD200+、 CD34—和CD133'的。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用為CD10+、CD34—、 CD105+和CD200+的分離的胎盤干細(xì)胞。本發(fā)明還提供了分離的細(xì)胞群，例 如胎盤干細(xì)胞群，其中至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至 少大約95%或至少大約99%的所述胎盤干細(xì)胞為CD10+、 CD34—、 CD105+、 CD200+的。在上述實(shí)施方案的具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞還另外為CD90+ 和CD45H在具體實(shí)施方案中，所述千細(xì)胞或胎盤干細(xì)胞群與非干細(xì)胞的 胎盤細(xì)胞分離開。在另一具體實(shí)施方案中，所述千細(xì)胞或胎盤干細(xì)胞群與不展示這些特征的胎盤干細(xì)胞分離開。在另一具體實(shí)施方案中，所述分離的胎盤干細(xì)胞是非母體來源的。在另一具#^實(shí)施方案中，所述分離的胎盤
干細(xì)胞群中至少大約90%、至少大約95%或至少大約99%的所述細(xì)胞是非
母體來源的。
在另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用為HLA-A,B,C、CD45—、 CD133-和CD34—的分離的胎盤干細(xì)胞。本發(fā)明還提供了分離的胎盤干細(xì)胞群的使用，其中至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約95%或至少大約99%的所述胎盤干細(xì)胞為HLA-A,B,C—、 CD45—、CD133^n CD34—的。在具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞或胎盤干細(xì)胞群與非干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞分離開。在另一具體實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞群與不展示這些特征的胎盤干細(xì)胞分離開。在另一具體實(shí)施方案中，所述分離的胎盤干細(xì)胞是非母體來源的。在另一具體實(shí)施方案中，所述分離的胎盤干細(xì)胞群中至少大約90%、至少大約95%或至少大約99%的所述細(xì)胞是非母體來源的。在另一實(shí)施方案中，所述HLA-A,B，Cr、 CD45—、 CD133—和CD34—胎盤干細(xì)胞是從胎盤灌洗液中分離的干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述HLA-A,B,Cr、 CD45—、 CD 133—和CD34—胎盤干細(xì)胞是通過物理和/或酶促破壞胎盤組織分離的干細(xì)胞。
在另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用為CD10+、CD13+、CD33十、CD45、 CD17—和CD133—的分離的胎盤干細(xì)胞。本發(fā)明還提供了分離的胎盤干細(xì)胞群，其中至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約95%或至少大約99%的所述胎盤干細(xì)胞為CD10+、 CD13+、 CD33+、CD45—、 CD117—和CD133—的。在具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞或胎盤干細(xì)胞群與非干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞分離開。在另一具體實(shí)施方案中，所述分離的胎盤干細(xì)胞是非母體來源的。在另一具體實(shí)施方案中，所述分離的胎盤干
細(xì)胞群中至少大約90%、至少大約95%或至少大約99%的所述細(xì)胞是非母
體來源的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞或胎盤干細(xì)胞群與不展示這些特征的胎盤干細(xì)胞分離開。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了獲得為
CD10+、 CD13+、 CD33+、 CD45-、 CD117—和CD133—的胎盤干細(xì)胞的方法，包括從胎盤灌洗液中分離所述細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述HLA-A,B，C—、CD45—、 CD33—和CD34—胎盤干細(xì)胞是通過物理和/或酶促破壞胎盤組織分離的干細(xì)胞。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用為CD1(T、 CD33—、CD44+、 CD45—和CD117—的分離的胎盤干細(xì)胞。本發(fā)明還提供了分離的胎盤干細(xì)胞群，其中至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約95%或至少大約99%的所述胎盤干細(xì)胞為CD1(T、 CD33—、 CD44+、 CD45—和CD11T的。在具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞或胎盤干細(xì)胞群與非干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞分離開。在另一具體實(shí)施方案中，所述分離的胎盤干細(xì)胞是非母體來源的。在另一具體實(shí)施方案中，所述分離的胎盤干細(xì)胞群中至少大約90%、至少大約95%或至少大約99%的所述細(xì)胞是非母體來源的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞或胎盤干細(xì)胞群與不展示這些特征的胎盤干細(xì)胞分離開。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了獲得為CD10—、 CD33—、CD44+、 CD45\ CD117—的胎盤干細(xì)胞的方法，包括從胎盤灌洗液中分離所述細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述HLA-A,B,Cr、 CD45—、 CD133—和CD34—胎盤干細(xì)胞是通過物理和/或酶促破壞胎盤組織分離的干細(xì)胞。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用為CD1(T、 CD13—、CD33—、 CD45'和CD117—的分離的胎盤干細(xì)胞。本發(fā)明還提供了分離的胎盤
28干細(xì)胞群，其中至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約
95%或至少大約99%的所述胎盤干細(xì)胞為CD1(T、 CD13—、 CD33—、 CD45— 和CD117-的。在具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞或胎盤干細(xì)胞群與非干細(xì)胞 的胎盤細(xì)胞分離開。在另一具體實(shí)施方案中，所述分離的胎盤干細(xì)胞是非 母體來源的。在另一具體實(shí)施方案中，所述分離的胎盤干細(xì)胞群中至少大 約90%、至少大約95%或至少大約99%的所述細(xì)胞是非母體來源的。在另 一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞或胎盤干細(xì)胞群與不展示這些特征的胎盤 干細(xì)胞分離開。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了獲得為CD10—、 CD13—、 CD33—、 CD45—和CD11T的胎盤干細(xì)胞的方法，包括從胎盤灌洗液中分離所 述細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述HLA-A,B,C、 CD45\ CD133—和CD34-胎盤干細(xì)胞是通過物理和/或酶促^5皮壞胎盤組織分離的干細(xì)胞。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用為HLA-A,B,C—、 CD45、 CD34.、 CD133., CDIO、 CD13、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD200和/或HLA-G陽性，和/或CD 117陰性的分離的胎盤干細(xì)胞。在另一 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物中所使用的胎盤干細(xì)胞的分離群 為HLA-A,B,C.、 CD45\ CD3《、CD133.的，且所述群中至少大約20%、 25%、 30%、 35%、 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%或大約99%的干細(xì)胞為CDIO、 CD13、 CD38、 CD44、 CD90、 CD 105 、 CD200和/或HLA-G陽性，和/或CD 117陰性的。在具體實(shí)施方案 中，所述干細(xì)胞或胎盤干細(xì)胞群與非干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞分離開。在另一具 體實(shí)施方案中，所述分離的胎盤干細(xì)胞是非母體來源的。在另一具體實(shí)施 方案中，所述分離的胎盤干細(xì)胞群中至少大約卯％、至少大約95%或至少 大約99%的所述細(xì)胞是非母體來源的。在另一具體實(shí)施方案中，所述干細(xì)案中，本發(fā)明提供了獲得為HLA-A,B，C-、 CD45\ CD34\ CD133\和CDIO、 CD13、 CD38、 CD44、 CD90、 CD105、 CD200和/或HLA-G陽性，和/或 CD117陰性的胎盤干細(xì)胞的方法，包括從胎盤灌洗液中分離所述細(xì)胞。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用通過抗體結(jié)合測(cè) 定為CD200+和CD10+，和通過抗體結(jié)合以及RT-PCR均測(cè)定為CD117—的胎 盤干細(xì)胞、或這種細(xì)胞的群、或包含這種分離的胎盤干細(xì)胞的細(xì)胞群。在 另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用為CD10+、CD29—、CD54+、 CD200+、 HLA-G+、 HLA I類-和P-2-微球蛋白—的胎盤干細(xì)胞。在另一實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供了胎盤干細(xì)胞，其中至少一種標(biāo)記的表達(dá)比間充質(zhì)干 細(xì)胞(如骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞)的高至少兩倍。在另一具體實(shí)施方案中，所 述分離的胎盤干細(xì)胞是非母體來源的。在另一具體實(shí)施方案中，所述分離 的胎盤干細(xì)胞群中至少大約90%、至少大約95%或至少大約99%的所述細(xì) 胞是非母體來源的。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物中所使用的胎盤干細(xì) 胞為細(xì)胞角蛋白18陽性的。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了胎盤干細(xì)胞 群或由之分化的細(xì)胞群，其中至少50%、 70%、 80%、 90%、 95%或99%為 細(xì)胞角蛋白18陽性的。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含胎盤干細(xì)胞 或由之分化的細(xì)胞的細(xì)胞群，其中至少50%、 70%、 80%、 90%、 95%或99% 的所述胎盤干細(xì)胞或由之分化的細(xì)胞為細(xì)胞角蛋白18陽性的。在另一實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供了分離胎盤干細(xì)胞、或胎盤干細(xì)胞群、或由之分化的 細(xì)胞的方法，包括選^^一種或多種細(xì)胞角蛋白18+胎盤干細(xì)胞，并從其它胎 盤細(xì)胞中分離所述一種或多種干細(xì)胞。
30在另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用胎盤干細(xì)胞的分 離群，其中多種所述胎盤干細(xì)胞通過醛脫氫酶活性測(cè)定而評(píng)估為醛脫氫酶
(ALDH)陽性。這樣的測(cè)定是本領(lǐng)域公知的(參見例如Bostian和Betts， S/oc/^m. 173, 787， (1978))。在具體實(shí)施方案中，所述ALDH測(cè)定利用 ALDEFLUOR (Aldagen， Inc., Ashland, Oregon)作為醛脫氫酶活性的標(biāo)記。 在另 一 具體實(shí)施方案中，所述多種細(xì)胞為所述細(xì)胞群中大約3%至大約25% 的細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法和組合物使用胎盤干細(xì)胞 群，其中多種所述胎盤干細(xì)胞被評(píng)估為醛脫氫酶(ALDH)陽性，其通過利用 ALDEFLUOR⑧作為醛脫氬酶活性指示的脫氫酶測(cè)定來檢測(cè)。在具體實(shí)施方 案中，所述多種細(xì)胞為所述細(xì)胞群中大約3%至大約25%的細(xì)胞。在另一實(shí) 施方案中，所述胎盤干細(xì)胞群或臍帶干細(xì)胞群顯示出比具有相同細(xì)胞數(shù)、 且在相同條件下培養(yǎng)的骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞群高至少三倍、或至少五倍 的ALDH活性。
在上述胎盤干細(xì)胞的具體實(shí)施方案中，所述胎盤干細(xì)胞組成型地分泌 IL-6、 IL-8和單核細(xì)胞化學(xué)趨化劑蛋白(MCP-I)。
每種上述胎盤干細(xì)胞或多種胎盤干細(xì)胞都可以包含從哺乳動(dòng)物胎盤直 接獲得和分離的胎盤干細(xì)胞，或者已經(jīng)培養(yǎng)和傳代至少1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 25、 30、 35、 40或更多代的胎盤干細(xì) 胞，或其組合。
上文所述的多種胎盤干細(xì)胞可以包含大約、至少、或不超過lx105、 5xl05、 lx106、 5xl06、 lx107、 5xl07、 lx108、 5xl08、 lx109、 5xl09、 lx1010、 5xl010、 lx1011或更多個(gè)胎盤干細(xì)胞。
315.2.3選擇和生產(chǎn)胎盤干細(xì)胞群
在另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從多種胎盤細(xì)胞中選擇多種胎盤干 細(xì)胞的方法，其中肝細(xì)胞和/或肝原性細(xì)胞能夠由之分化，包括選4奪胎盤細(xì) 胞群，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少 60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95。/o的所述細(xì)胞是CD200+、 HLA-G+胎盤干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇還是CD73+和 CD105+的干細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、 CD38—或CD45-的干細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇還是 CD34\ CD38-、 CD45\ CD73+和CD105+的胎盤干細(xì)胞。在另一具體實(shí)施 方案中，所述選擇還包括選擇在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，形成一 個(gè)或多個(gè)胚樣體的多種胎盤干細(xì)胞。
在另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從多種胎盤細(xì)胞中選擇多種胎盤干 細(xì)胞的方法，包括選擇多種胎盤細(xì)胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、 至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少 95%的所述細(xì)胞是CD73+、 CD105+、 CD200+胎盤干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案 中，所述選擇包括選擇還是HLA-G+的干細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所 述選擇包括選擇還是CD34—、 CD38-或CD45-的胎盤干細(xì)胞。在另 一具體實(shí) 施方案中，所述選擇包括選擇還是CD3《、CD38—和CD45—的胎盤干細(xì)胞。 在另一具體實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、 CD38—、 CD45—和 HLA-G+的胎盤干細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述選擇還包括選擇在允 許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體的胎盤細(xì)胞群。
在另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從多種胎盤細(xì)胞中選擇多種胎盤干 細(xì)胞的方法，包括選擇多種胎盤細(xì)胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少 95Q/o的所述細(xì)胞是CD200+、 OCT-4+胎盤干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述 選擇包括選擇還是CD73+和CD 105+的胎盤干細(xì)胞。在另 一 具體實(shí)施方案中， 所述選擇包括選擇還是HLA-G+的胎盤干細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所 述選擇包括選擇還是CD34—、 CD38—和CD45—的胎盤干細(xì)胞。在另 一具體實(shí) 施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34-、 CD38\ CD45\ CD73+、 CD105+ 和HLA-G+的胎盤干細(xì)胞。
在另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從多種胎盤細(xì)胞中選擇多種胎盤干 細(xì)胞的方法，包括選擇多種胎盤細(xì)胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、 至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少 95y。的所述細(xì)胞是CD73+、 CDI05+和HLA-G+胎盤干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案 中，所述選擇包括選擇還是CD3《、CD3&或CD45—的胎盤干細(xì)胞。在另一 具體實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、 CD38—和CD45—的胎盤干 細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇還是CD200+的胎盤干細(xì) 胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34—、 CD38—、 CD45—、 OCT-4+和CD200+的胎盤干細(xì)胞。
在另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從多種胎盤細(xì)胞中選擇多種胎盤干 細(xì)胞的方法，包括選擇多種胎盤細(xì)胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、 至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少 95%的所述細(xì)胞是CD73+、 CD105+胎盤干細(xì)胞，并且其中所述多種細(xì)胞在 允許胚樣體形成的條件下形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體。在具體實(shí)施方案中，所 述選擇包括選擇還是CD3《、CD38-或CD45-的胎盤干細(xì)胞。在另 一具體實(shí) 施方案中，所述選擇包括選擇還是CD34\ CD38-和CD45—的胎盤干細(xì)胞。選擇還是OCT-4+、 CD34—、 CD38—和 CD45—的胎盤干細(xì)胞。
在另 一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從多種胎盤細(xì)胞中選擇多種胎盤干 細(xì)胞的方法，包括選擇多種胎盤細(xì)胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、 至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少 95%的所述分離的胎盤細(xì)胞是OCT-4+干細(xì)胞，并且其中所述多種的細(xì)胞在 允許胚樣體形成的條件下形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體。在具體實(shí)施方案中，所 述選擇包括選擇還是CD73+和CD105+的胎盤干細(xì)胞。在另 一具體實(shí)施方案 中，所述選擇包括選4奪還是CD34—、 CD38—或CD45—的胎盤干細(xì)胞。在另一 具體實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇還是CD200+的胎盤干細(xì)胞。在更具體 的實(shí)施方案中，所述選擇包括選擇還是CD73+、 CD105+、 CD200+、 CD34'、 CD38—和CD45—的胎盤干細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)胎盤干細(xì)胞群或多種胎盤干細(xì)胞的方法；這樣的 細(xì)胞可在本發(fā)明提供的方法和組合物中使用。例如，本發(fā)明提供了生產(chǎn)細(xì) 胞群的方法，包4舌選4奪任何上述多種胎盤干細(xì)胞，并從其它細(xì)胞，例如其 它胎盤細(xì)胞中分離所述多種胎盤干細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供 了生產(chǎn)細(xì)胞群的方法，包括選擇胎盤細(xì)胞，其中所述胎盤細(xì)胞(a)貼壁于基 質(zhì)，和(b)表達(dá)CD200和HLA-G;或表達(dá)CD73、 CD105和CD200;或表達(dá) CD200和OCT-4;或表達(dá)CD73、CD105和HLA-G;或表達(dá)CD73和CD105， 且當(dāng)包含所述干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，有 助于在所述群中形成一個(gè)或多個(gè)胚樣體；或表達(dá)OCT-4，且當(dāng)包含所述干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，有助于在所述群中 形成一個(gè)或多個(gè)胚才羊體。
在更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)細(xì)胞群的方法，包括選擇
胎盤干細(xì)胞，其中所述胎盤干細(xì)胞(a)貼壁于基質(zhì)，和(b)表達(dá)CD200和 HLA-G;并從其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞以形成細(xì)胞群。在另一具體 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)細(xì)胞群的方法，包括選擇胎盤干細(xì)胞，其 中所述胎盤干細(xì)胞(a)貼壁于基質(zhì)，和(b)表達(dá)CD73、 CD105和CD200;并 從其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞以形成細(xì)胞群。在另 一具體實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供了生產(chǎn)細(xì)胞群的方法，包括選擇胎盤干細(xì)胞，其中所述胎盤干 細(xì)月包(a)貼壁于基質(zhì)，和(b)表達(dá)CD200和OCT-4;并從其它細(xì)胞中分離所述 胎盤干細(xì)胞以形成細(xì)胞群。在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明^提供了生產(chǎn)細(xì) 胞群的方法，包括選擇胎盤干細(xì)胞，其中所述胎盤千細(xì)胞(a)貼壁于基質(zhì)， (b)表達(dá)CD73和CD105 ，和(c)當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)形成胚 樣體；并從其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞以形成細(xì)胞群。在另一具體實(shí) 施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)細(xì)胞群的方法，包括選擇胎盤干細(xì)胞，其中 所述胎盤干細(xì)胞(a)貼壁于基質(zhì)，和(b)表達(dá)CD73、 CD105和HLA-G;并從 其它細(xì)胞中分離所述胎盤干細(xì)胞以形成細(xì)胞群。生產(chǎn)細(xì)胞群的方法包括選 擇胎盤干細(xì)胞，其中所述胎盤干細(xì)胞(a)貼壁于基質(zhì)；(b)表達(dá)OCT-4，和(c) 當(dāng)在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)形成胚樣體；并從其它細(xì)胞中分離所 述胎盤干細(xì)胞以形成細(xì)胞群。
5.2.4培養(yǎng)生長(zhǎng)
35正如任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞那樣，本發(fā)明描述的胎盤干細(xì)胞的生長(zhǎng)部分地 依賴于選擇用于生長(zhǎng)的特定培養(yǎng)基。在最優(yōu)條件下，胎盤干細(xì)胞一般在3-5 天內(nèi)數(shù)量加倍。在培養(yǎng)過程中，本發(fā)明提供的胎盤干細(xì)胞貼壁在培養(yǎng)基質(zhì)
上，例如組織培養(yǎng)容器的表面(例如組織培養(yǎng)皿的塑料、纖粘連蛋白包被
的塑料等)，并形成單層細(xì)胞。
包含本發(fā)明提供的胎盤干細(xì)胞的分離的胎盤細(xì)胞群在合適的條件下培 養(yǎng)時(shí)，形成胚樣體，即，在貼壁的干細(xì)胞層上面生長(zhǎng)的三維細(xì)胞簇。胚樣
體內(nèi)的細(xì)胞預(yù)期表達(dá)與極早期干細(xì)胞例如OCT-4、 Nanog、 SSE3和SSE4
相關(guān)的標(biāo)記。如同本發(fā)明描述的胎盤干細(xì)胞那樣，胚樣體內(nèi)的細(xì)胞一^:不 貼壁在培養(yǎng)基質(zhì)上，但是在培養(yǎng)過程中保持附著于貼壁的細(xì)胞。胚樣體細(xì) 胞的活力依賴于貼壁胎盤干細(xì)胞，因?yàn)樵谌鄙儋N壁干細(xì)胞時(shí)不形成胚樣體。 因此，貼壁胎盤干細(xì)胞有助于包含貼壁胎盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中的 一 個(gè) 或多個(gè)胚樣體的生長(zhǎng)。不希望受制于理論，認(rèn)為胚樣體細(xì)胞在貼壁胎盤干 細(xì)胞上的生長(zhǎng)與胚胎干細(xì)胞在滋養(yǎng)層細(xì)胞上的生長(zhǎng)相似。間充質(zhì)干細(xì)胞， 例如骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)中不產(chǎn)生胚樣體。
5.2.5分化
可用于本發(fā)明提供的方法的胎盤干細(xì)胞可分化為不同的定型細(xì)胞系。 例如，所述胎盤干細(xì)胞能夠分化為肝細(xì)胞性系的細(xì)胞。這樣的分化可以例 如通過本領(lǐng)域公知的用于將例如骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞分化為相似細(xì)胞系 的任何方法來實(shí)現(xiàn)。參見2006年12月28日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?11/648,813，其公開內(nèi)容在此通過引用并入本文。待分化的胎盤干細(xì)胞可以包含在聚合物載體如褐藻膠之中。在 一 實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供了包含膠嚢化在褐藻膠之中的多種細(xì)胞的組合物。所 述細(xì)胞可以是胎盤干細(xì)胞，未與導(dǎo)致胎盤干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞或肝原性細(xì) 胞的條件相接觸。所述細(xì)胞還可以是肝原性細(xì)胞或肝細(xì)胞。所述細(xì)胞還可 以是任何前述細(xì)胞的組合。包含在聚合物如褐藻膠之中的肝原性細(xì)胞和/或 肝細(xì)胞是從胎盤干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，所述細(xì)胞表達(dá) 至少一種不為胎盤干細(xì)胞所表達(dá)、或表達(dá)程度與之具有可檢測(cè)差異的肝細(xì) 胞標(biāo)記。優(yōu)選聚合物如褐藻膠為珠子的形式，其膠囊化多種胎盤干細(xì)胞、 肝原性細(xì)胞、肝細(xì)胞或其組合。珠子大小可以變化不等，例如珠子可以從
大約(例如±10%) 100 pm至大約1000 pm不等。在具體實(shí)施方案中，所述珠 子大小從大約200 |im至大約800 pm。在另 一具體實(shí)施方案中，所述珠子大 約平均大約500 (im。
5.3 CD34+CD45—胎盤干細(xì)胞和包含它們的細(xì)胞群
另一方面，本發(fā)明提供了分離的造血CD34+、 CD45—胎盤干細(xì)胞和/或 CD34+CD45模糊胎盤千細(xì)胞，以及富集CD34+、 CD45.胎盤干細(xì)胞的分離的 細(xì)胞群。如本發(fā)明中使用的，"CD34+、 CD45—胎盤干細(xì)胞"表明細(xì)胞能夠分 化為至少 一 種類型的成熟血細(xì)胞或成熟血細(xì)胞的祖細(xì)胞，其由胎盤獲得但 不從胎盤血或臍帶血獲得，且在某些實(shí)施方案中包括CD34+CD45模糊胎盤干 細(xì)胞。利用CD34的標(biāo)記抗體，CD34+、 CD45—胎盤干細(xì)胞可檢測(cè)地為CD34 標(biāo)記陽性，且為CD45模糊或陰性，例如，不被CD45的熒光標(biāo)記抗體標(biāo)記， 從而細(xì)胞可檢測(cè)地高于背景。CD34+、 CD451臺(tái)盤干細(xì)胞和CD34十CD45模糊 胎盤千細(xì)胞通常是非貼壁的，即，不貼壁于組織培養(yǎng)表面。本發(fā)明還提供了富集CD34+、 CD45.胎盤干細(xì)胞和/或CD34+CD45模糊 胎盤干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群。如本發(fā)明中使用的，"富集"表明所述胎盤干細(xì)胞 群包含比胎盤灌洗液中所見的更高數(shù)目或更高百分比的CD34+CD45—細(xì)胞， 其中所述胎盤灌洗液包含當(dāng)胎盤已經(jīng)排干臍帶血和胎盤血，且用大約100 mL灌洗液預(yù)灌洗之后，以大約50 mL/min的流速通過人胎盤的大約750 mL 灌洗液(例如0.9% NaCl)。在具體實(shí)施方案中，CD34+CD45—胎盤干細(xì)胞以比 胎盤灌洗液中所見的更高的百分比存在于細(xì)胞群之中，例如，所述胎盤干 細(xì)胞構(gòu)成所述細(xì)胞群中至少1%、 2%、 3%、 4%、 5%、 7%、 10%、 15%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或95%的細(xì)胞。在另一具 體實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞群包含大約或至少lx103、 5xl03、 lx104、 5xl04、 lx105、 5xl05、 lxl06、 5xl()6或lxl()7CD34+CD45-胎盤干細(xì)胞。
通常，在胎盤灌洗液的大約1億個(gè)總有核細(xì)胞群中，大約有5%為CD34+ 細(xì)胞，且考慮到活力，胎盤的終產(chǎn)率為大約100萬個(gè)CD34+干細(xì)胞。CD34+ 干細(xì)胞收集時(shí)看起來是圓的，具有低細(xì)胞復(fù)雜度。
包含CD34+CD45—胎盤干細(xì)胞的胎盤干細(xì)胞群還可以包含其它CD34+ 細(xì)胞群，例如，CD34+CD38+細(xì)胞和/或CD34+CD38—細(xì)胞。在具體實(shí)施方案 中，所述CD34+CD38—細(xì)胞包含CD34+CD3幻irf干細(xì)胞。在另 一具體實(shí)施方 案中，所述CD34+胎盤干細(xì)胞包含為ALDH+的細(xì)胞，即CD34+、 ALDH+胎 盤干細(xì)胞。
在另一實(shí)施方案中，CD34+、 CD45-胎盤干細(xì)胞與第二類型的干細(xì)胞組 合。在一實(shí)施方案中，所述第二類型的干細(xì)胞包含為OCT-4+或ABC-p+的 貼壁胎盤干細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述貼壁胎盤干細(xì)胞包含為OCT4+ABC-p+的細(xì)胞。在另 一更具體的實(shí)施方案中，所述造血胎盤干細(xì)胞 包含在基本上缺乏紅細(xì)胞和細(xì)胞碎片的胎盤灌洗液之中。
在另一實(shí)施方案中，與造血胎盤干細(xì)胞如CD34+CD45-胎盤干細(xì)胞組合 的所述貼壁胎盤干細(xì)胞包含表達(dá)CDIO、 CD29、 CD44、 CD54、 CD90、 CD73 或CD105標(biāo)記的一種或多種、且不表達(dá)CD34、 CD38、 CD45、 SSEA3和 SSEA4標(biāo)記的一種或多種的細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述貼壁胎盤干細(xì) 胞包含CDIO、 CD29、 CD44、 CD54、 CD90、 CD73或CD 105陽性、且CD34、 CD38、 CD45、 SSEA3和SSEA4陰性的纟田胞。在另一實(shí)施方案中，所述貼 壁胎盤干細(xì)胞包含含有CDIO、 CD29、 CD44、 CD54、 CD90、 CD73和CD105 標(biāo)記的一種或多種、且缺乏CD34、 CD38、 CD45、 SSEA3和SSEA4標(biāo)記 的一種或多種的細(xì)胞。在另 一實(shí)施方案中，所述貼壁胎盤干細(xì)胞包含CDIO、 CD29、 CD44、 CD54、 CD90、 CD73和CD 105陽性、且CD34、 CD38、 CD45、 SSEA3和SSEA4陰性的細(xì)胞。在另 一實(shí)施方案中，所述貼壁胎盤干細(xì)胞包 含CD34—細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，所述貼壁胎盤干細(xì)胞為CD34—CD38—胎 盤干細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述貼壁胎盤干細(xì)胞包含對(duì)CDIO、 CD29、 CD33、 CD44、 CD73、 CD105、 CD117和CDI33中至少之一為陽性、且對(duì) CD34或CD45中至少之一為陰性的細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所迷貼壁胎 盤干細(xì)胞包含CDIO、 CD29、 CD33、 CD44、 CD73、 CD105、 CD117和CD 133陽性、且CD34或CD45陰性的細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述貼 壁胎盤干細(xì)胞包含為HLA-ABC+的細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述貼 壁胎盤干細(xì)胞包含為HLA-ABC—的細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述貼 壁胎盤干細(xì)胞包含為HLA-DR+的細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述貼壁 胎盤干細(xì)胞包含為HLA-DR—的細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述貼壁胎盤干細(xì)胞包含為CD200+或HLA-G+的細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述 貼壁胎盤干細(xì)胞包含為CD200+和HLA-G+的細(xì)胞。在另 一 具體實(shí)施方案中， 所述貼壁胎盤干細(xì)胞包含為CD73 + 、 CD105+和CD200+的細(xì)胞。在另一具體 實(shí)施方案中，所述貼壁胎盤干細(xì)胞包含為CD200+和0CT-4+的細(xì)胞。在另 一具體實(shí)施方案中，所述貼壁胎盤干細(xì)胞包含為CD73+、 CD105+、且在包 含所述干細(xì)胞的分離的胎盤細(xì)胞群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)有助 于在所述群中形成胚樣體的細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中，所述貼壁胎盤 干細(xì)胞包含為CD73+、 CD105+和HLA-G+的細(xì)胞。在另一具體實(shí)施方案中， 所述貼壁胎盤干細(xì)胞包含為OCT-4+、且在包含所述干細(xì)胞的分離的胎盤細(xì) 胞群在允許胚樣體形成的條件下培養(yǎng)時(shí)，有助于在所述群中形成胚樣體的 細(xì)胞。
在另 一實(shí)施方案中，所述第二干細(xì)胞群包含臍帶血干細(xì)胞和/或骨髓干細(xì)胞。
待組合的CD341CD45—胎盤干細(xì)胞和其它干細(xì)胞可以是完全 一 致地 HLA匹配的，即，它們可以來源于同一個(gè)體。在另一實(shí)施方案中，所述 CD34+CD45—胎盤干細(xì)胞和其它干細(xì)胞可以是HLA不匹配的，即，它們可 以來源于不同的個(gè)體。CD34+CD45^臺(tái)盤干細(xì)胞和其它干細(xì)胞的所述組合可 以包含為與目標(biāo)接受者HLA匹配的、部分HLA匹配的和/或HLA不匹配 的干細(xì)胞。對(duì)于包含非臍帶血干細(xì)胞的組合干細(xì)胞群而言，優(yōu)選第二來源 的干細(xì)胞與目的受體至少為HLA匹配的或部分HLA匹配的。
在多個(gè)實(shí)施方案中，相比各群中的總有核細(xì)胞數(shù)，或相比各群中的干 細(xì)胞總數(shù)，CD34+CD45—胎盤干細(xì)胞與第二類型干細(xì)胞的比率可以是大約 100,000,000:1 、 50,000,000:1 、 20,000,000:1、 10,000,000:1 、 5,000,000:1 、
40、 200,000:1 、 100,000:1 、 50,000:1 、 20,000:1 、 10.000:1、 5,000:1、 2,000:1、 1,000:1、 500:1、 200:1、 100:1、 50:1、 20:1、 10:1、 5:1、 2:1、 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; l細(xì)；1:200; 1:500; 1:1,000; l:2，000; 1:5,000; 1:10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1:500,000; 1:1,000,000; l:2，000，000; 1:5,000,000; 1:10,000,000; 1:20,000,000; 1:50,000,000;或大 約I:IOO，OOO,OOO。在多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述比率為大約1:10至大約 10:1，或大約3:1至大約1:3。
本發(fā)明還提供了包含CD34+CD45—胎盤干細(xì)胞和第二類型干細(xì)胞的干 細(xì)胞群，其中所述干細(xì)胞群包含治療有效量的CD34+CD45—胎盤干細(xì)胞、第 二類型的干細(xì)胞、或兩者皆是。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述群包含至少lx104、 5xl04、 lx105、 5xl05、 lx106、 5xl06、 lx107、 5xl07、 lx108、 5xl08、 lx109、 5xl09、 lxio， 5>^10|()或lxlO'1 CD34+CD45-胎盤干細(xì)胞、第二類型的干細(xì) 胞、或兩者皆是；或者至多l(xiāng)x104、 5xl04、 lxio5、 5xl05、 lx106、 5xl06、 lx107、 5xl07、 1xi08、 5xl08、 lx109、 5xl09、 lxlO")、 5x10")或1x10" CD34+CD45-胎盤干細(xì)胞、第二類型的干細(xì)胞、或兩者皆是；或者包含來自 胎盤干細(xì)胞群和第二類型干細(xì)胞兩者的3、 5、 10、 20、 30、 40或50單位 或更多的總有核細(xì)胞。
5.4獲得胎盤干細(xì)胞的方法 5.4.1干細(xì)胞收集組合物
本發(fā)明提供的方法和組合物中所使用的胎盤干細(xì)胞如貼壁胎盤干細(xì)胞 和/或CD34+、 CD45—胎盤干細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域公知的從組織中收集細(xì)胞的 任何方法來收集，例如通過灌洗胎盤和/或通過物理和/或酶促破壞胎盤組織
41來收集。
一般利用生理學(xué)可接受的溶液，例如，干細(xì)胞收集組合物從哺乳
動(dòng)物胎盤中獲得干細(xì)胞。干細(xì)胞收集組合物詳細(xì)地在2006年12月28日提 交的名為"用于收集胎盤干細(xì)胞和保存器官的改良組合物(Improved Composition for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs)"的相 關(guān)美國申請(qǐng)
發(fā)明者克利斯登·拉巴左, 倩 葉, 王佳倫, 羅伯特·J·哈黎里, 薩沙·道恩·阿布拉門遜, 詹姆士·W·愛丁格, 馬里安·佩雷拉 申請(qǐng)人:人類起源公司