專利名稱：：一種立體增殖軟骨細胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細胞生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種立體增殖軟骨細胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：軟骨細胞組織工程種子細胞的來源受到了限制，體外單層貼壁培養(yǎng)時易出現(xiàn)去分化，反分化的潛能將逐漸消失，使軟骨細胞逐漸改變形態(tài)、喪失表型及相關(guān)基因的表達，不能產(chǎn)生軟骨特有的糖胺多糖和II型膠原，而產(chǎn)生I型和in型膠原，植入體內(nèi)后主要形成纖維軟骨，不能維持生物力學(xué)性能。關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)與其組織結(jié)構(gòu)特點及損傷的方式有關(guān)，而修復(fù)的持久性以及良好的負重關(guān)節(jié)面的維持則有賴于愈合組織的質(zhì)量，但實際上修復(fù)常不完善，使損傷的關(guān)節(jié)面后期發(fā)生退行性改變。表淺損傷的修復(fù)愈合依賴于關(guān)節(jié)軟骨細胞的代謝活動，但其精確重建結(jié)構(gòu)的能力有限，即使關(guān)節(jié)軟骨細胞能夠合成蛋白多糖和膠原分子，并能釋放外基質(zhì)，這些新合成的分子并未相互結(jié)合形成絡(luò)合物，因此構(gòu)建的結(jié)構(gòu)并不完美，愈合組織的功能也較差。關(guān)節(jié)軟骨缺損后，軟骨細胞由于其部位的血管較少，難以再生或修復(fù)極為緩慢，限制了其修復(fù)的能力，后期易造成退行性關(guān)節(jié)炎。組織工程為關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的臨床提供了新的思路與途徑。軟骨組織工程的基本路線是在體外培養(yǎng)種子細胞，并以較高濃度將其種植于具有良好的生物相容性降解性的合適支架上，從而形成細胞-支架復(fù)合物，并將復(fù)合物植入生物體內(nèi)組織缺損部位最終完成組織的修復(fù)和再造。但種子細胞、合適支架材料以及合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)還尚待明確。體外軟骨細胞單層培養(yǎng)到5代，易出現(xiàn)去分化，形態(tài)、細胞外基質(zhì)分泌功能下降及表型改變，難以長期培養(yǎng)。目前解決的主要方法是骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)誘導(dǎo)成軟骨細胞、短時間快速增殖并在合適的載體中立體培養(yǎng)。1998年發(fā)現(xiàn)在海藻酸珠中軟骨細胞的表型能保持較長時間，而且在70天里DNA、蛋白多糖(PG)的含量保持較高。把轉(zhuǎn)移生長因子-1(TGF-1)加入軟骨細胞的海藻酸珠中,使m-RNA表達增加400%,前膠原基因表達上調(diào)180%。1999年Lindenhayn發(fā)現(xiàn)單純用海藻酸鈉珠培養(yǎng)軟骨細胞,其細胞數(shù)稍有增高，在海藻酸鈉中加入透明質(zhì)酸，其細胞數(shù)3天可以增加100%,而在這基礎(chǔ)上加入纖維連接蛋白，其細胞數(shù)1天就可以增加100%。2000年Chubinskaya等教授研究較多的海藻酸珠用于保存軟骨細胞存活可達8個月，同年國外學(xué)者徐虎等用單純海藻酸制備凝膠，用藻酸釣/軟骨細胞復(fù)合物用于動物體內(nèi)4周時可見新生毛細血管和軟骨陷窩形成，說明軟骨細胞復(fù)合于藻酸釣可在異體動物體內(nèi)生長增殖。也有學(xué)者以藻酸鈣為載體作為可注射軟骨，用于軟骨組織工程的研究。但細胞在載體中增殖的量還不夠。在單純的海藻酸珠中軟骨細胞的表型能保持較長時間，但增殖的數(shù)量不夠，單純加入TGF-1生長因子，短時間使用容易失活，長時間使用易帶來尚未確定的致瘤機會，雖然Lindenhayn的方法簡單可行，細胞數(shù)目增殖較快，但細胞載體支架缺乏微動力，適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)可使之更接近體內(nèi)細胞微環(huán)境。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是為了解決上述技術(shù)問題，達到短期快速增殖軟骨細胞，并且長期培養(yǎng)能保存細胞表型的目的，本發(fā)明提供了一種立體增殖軟骨細胞的培養(yǎng)方法。為了實現(xiàn)該目的，采用如下的技術(shù)方案一種立體增殖軟骨細胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟(1)將單層培養(yǎng)軟骨細胞消化后加入海藻酸鈉-氯化鈉溶液中混合；(2)用吸尖將步驟(1)得到的混合液滴于氯化鈣(CaCl2)溶液中，成凝膠；(3)將步驟(2)得到的凝膠依次用氯化鈉(NaCl)溶液和完全培養(yǎng)基洗，再在復(fù)合DMEM/HamF12培養(yǎng)基上培養(yǎng)。其中，所述復(fù)合DMEM/HamF12培養(yǎng)基包括10ng/ml堿性成纖維生長因子、5嗎/ml透明質(zhì)酸、0.2pg/ml纖維連接蛋白，50jig/ml可溶性殼聚糖和l:l的DMEM/HamF12。優(yōu)選的，步驟(l)中的單層培養(yǎng)軟骨細胞的濃度為1-6x107mL。優(yōu)選的，步驟(1)中的海藻酸鈉的濃度為12g/L。優(yōu)選的，步驟(1)中的NaCl溶液的濃度為0.15mol/L。優(yōu)選的，步驟(2)中的CaCV溶液的濃度為102mmol/L。優(yōu)選的，步驟(2)中成凝膠的條件為37°C,5%C02,10min。優(yōu)選的，步驟(3)中的NaCl溶液的濃度為O.15mol/L。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明的立體增殖軟骨細胞的培養(yǎng)方法能在短時間內(nèi)提高培養(yǎng)細胞的數(shù)量和質(zhì)量，快速增殖軟骨細胞，長期培養(yǎng)能保存細胞表型。采用復(fù)合載體有以下優(yōu)點1.表面積/體積(S/V)大,因而單位體積培養(yǎng)液的細胞產(chǎn)率高，2.采用均勻的懸浮培養(yǎng)，把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)結(jié)合一起，兼有兩者優(yōu)點，3.可用簡單普通顯微鏡觀察復(fù)合載體的細胞生長，4.培養(yǎng)基利用率高，5.與原代細胞分離相比，細胞收獲過程簡單。本發(fā)明采用多因素實驗設(shè)計方案，正交試驗設(shè)計(Orthogonalexperimentaldesign)是研究多因素多水平的一種設(shè)計方法，它是根據(jù)正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了"均勻分散，齊整可比，，的特點，正交試驗設(shè)計是分式析因設(shè)計的主要方法，是一種高效率、快速、經(jīng)濟的實驗i殳計方法。用該法設(shè)計實驗后建立海藻酸鈉膠體立體培養(yǎng)軟骨細胞體系，并能在短時間內(nèi)提高數(shù)量和質(zhì)量，因為平面培養(yǎng)最大問題是易發(fā)生去分化，細胞瓶長滿細胞后易發(fā)生接觸抑制，海藻酸鈉月交體立體培養(yǎng)把平面培養(yǎng)立體化，膠體有微壓力環(huán)境，細胞形態(tài)接近體內(nèi)，大量增殖形成同源細胞團，其外圍擴大，減少了接觸抑制；選用的幾種細胞外基質(zhì)相關(guān)因素是模擬細胞生長內(nèi)環(huán)境，有利于細胞生長。模擬細胞體內(nèi)微環(huán)境，選擇了海藻酸鈉作為細胞支架，適合細胞生長的外基質(zhì)材料，用正交試驗設(shè)計建立了復(fù)合DMEM/HamF12的體外培養(yǎng),經(jīng)正交試驗及重復(fù)試驗、驗證試驗，確定了各因素的有效濃度及配比方案，在復(fù)合DMEM/F12培養(yǎng)基的海藻酸鈉栽體支架中培養(yǎng)軟骨細胞能快速增殖，細胞數(shù)48h就增殖3倍多，蕃紅-0(SafranineO)進行氨基葡聚糖(GAG)染色顯示傳至P9仍然產(chǎn)生大量蛋白聚糖基質(zhì)。乳酸脫氫酶(LDH)檢測未見毒副作用。該復(fù)合載體具有良好的成形性和組織相容性。用于BMSCs誘導(dǎo)的軟骨細胞也取得同樣效果。圖1是兔軟骨細胞的海藻酸鈉復(fù)合載體的形態(tài)的一個優(yōu)選實施例的觀察圖片；圖2是用倒置顯微鏡觀察7天軟骨細胞聚集生長狀態(tài)的一個優(yōu)選實施例的圖片；圖3是用相差顯微鏡鏡觀察7天單個細胞狀態(tài)的一個優(yōu)選實施例的圖片；圖4是用激光共聚焦顯微鏡觀察單層細胞狀態(tài)的一個優(yōu)選實施例的圖片；圖5是用激光共聚焦顯微鏡多重光切并重組三維觀察復(fù)合栽體的軟骨細胞同源細胞團在立體培養(yǎng)中的狀態(tài)的一個優(yōu)選實施例的圖片；圖6是蕃紅-0進行細胞外基質(zhì)糖胺多糖染色的一個優(yōu)選實施例的圖片。具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的較佳實施例進行說明。實施例一兔軟骨細胞的分離和培養(yǎng)無菌取4~5周齡的新西蘭大白兔(廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心)膝關(guān)節(jié)軟骨。以解剖刀切成1mmS左右的小碎片，分別用透明質(zhì)酸酶，胰蛋白酶，II型膠原酶消化關(guān)節(jié)軟骨碎片，獲得軟骨細胞懸液。25cmS培養(yǎng)瓶接種軟骨細胞，加入含體積百分比為10。/。胎牛血清的DMEM/Ham'sF12培養(yǎng)液，置37。C,體積百分比為5。/。C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞貼壁后隔天換液，當(dāng)軟骨細胞鋪滿平瓶底后用質(zhì)量百分比為0.02。/。EDTA沖洗，質(zhì)量百分比為0.25°/。胰酶消化，離心收集軟骨細胞，用以傳代或?qū)嶒?。實施例二?fù)合載體組分的選擇在96孔板中種植細胞數(shù)為5xl0VmL軟骨細胞，分別加入系列質(zhì)量濃度bFGF(O、1、5、10、50、100ng/mL)、透明質(zhì)酸(O、12.5、25、50、100、200嗎/mL)，纖維連接蛋白(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0,8pg/mL)，可溶性殼聚糖(O、12.5、25、50、100、200pg/mL),用XTT柳師比色法測定分析細胞數(shù)目的增殖情況，觀察單一成分對細胞軟骨的影響。實施例三復(fù)合載體的制備單層培養(yǎng)細胞2xl05/mL加入12g/L海藻酸鈉-0.15mol/LNaCl，將混合液用吸尖(50pL/滴)，滴于102mmol/LCaCl2，37。C,5%<302培養(yǎng)箱10min，在一定溫度下成凝膠，用0.15mol/LNaCl洗3次，完全培養(yǎng)基(CCM)洗1次，10-15ml在復(fù)合F12/DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，定期觀察。復(fù)合載體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果兔軟骨細胞的海藻酸鈉復(fù)合載體形態(tài)觀察大體觀察載體直徑約5mm，圓形，乳白色，半透明，有彈性，在培養(yǎng)基中懸浮生長，見圖1;倒置顯微鏡下7d可見軟骨細胞聚集生長，自成集落，見圖2;相差顯微鏡鏡7ci可見單個細胞圓形，胞核清晰，胞膜完整，見圖3;激光共聚焦顯微鏡觀察單層細胞用復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)，Acridineorange(AO)染色，細胞生長旺盛，細胞呈4炎形狀，核DNA呈亮綠色，而胞漿RNA呈橘紅色，可見集落和核分裂相，見圖4;復(fù)合載體的軟骨細胞在立體培養(yǎng)中呈圓形或多角形，用激光共聚焦顯微鏡多重光切并重組3D觀察，可見細胞分裂增殖，30d形成同源細胞團，見圖5。實施例四兩種因素對軟骨細胞影響以bFGF為主因素的系列濃度(0、1、5、10、50、100ng/mL)分別與透明質(zhì)酸(100pg/mL)，纖維連接蛋白(0.1pg/mL)，可溶性殼聚糖(100pg/mL)作用于5xl04/mL軟骨細胞進行比較，選取最佳協(xié)同點，排除負協(xié)同點。用XTT460nm比色法測定分析細胞數(shù)目的增殖情況，觀察細胞對兩種材料的反應(yīng)。實施例五正交試l^的設(shè)計選擇bFGF,透明質(zhì)酸(Hyaluronic),纖維連4姿蛋白(Fibronectin),可溶性殼聚糖(Chitosan)4個因素，每個因素3個水平，根據(jù)SPSS13.0軟件設(shè)計，OryhogonalDesign3-Way交互作用分析，因素水平見表l，表1為正交試驗的設(shè)計因素水平表，共做81次實驗。經(jīng)初步篩選后從中優(yōu)選24組設(shè)A、B、C、D組合數(shù)據(jù)重復(fù)檢測。正交試驗設(shè)計結(jié)果分析見表2。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>△與對照組(12,24組)比較，有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)=36.35P=0.000△△結(jié)果與對照組比較細胞數(shù)48h增加2倍以上根據(jù)SPSS13.0軟件設(shè)計，OryhogonalDesign3-Way交互作用分析，根據(jù)81組實驗交互結(jié)果平均值，優(yōu)選重復(fù)24組，包括2組對照組。有18組結(jié)果與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，呈正向增殖，尸=36.36，尸<0.01，其中有6組優(yōu)選結(jié)果與對照組比較細胞數(shù)48h增加2倍以上，見表2。實施例六-瞼證試-險驗證分四組，10ng/mlbFGF;5嗎/mlHyaluronic;10ng/mlbFGF+5pg/mlHyaluronic;10ng/mlbFGF+5pg/mlHyaluronic+0.2pg/mlFibronectin+50pg/mlChitosan，各組以不加干預(yù)因素的軟骨細胞為對照組，分別加入^孔板中，與5xl0Vml軟骨細胞混合培養(yǎng)，4個復(fù)孔，驗證細胞經(jīng)正交試驗優(yōu)選的組分在同一條件下對單一和復(fù)合材料的反應(yīng)，用XTT46Qnm比色法測定分析細胞的增殖。再用復(fù)合載體承載細胞，放在用正交試驗驗證的復(fù)合培養(yǎng)液培養(yǎng)48h時間后，用解珠液(55mmol/L檸檬酸鈉，0.15mmol/LNaCl)溶解膠體行細胞計數(shù)。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果見表3。表3組別bFGF(ng/mL)濃度Mean士SD00.865±0.00510.885±0.3161.059士0.313△101.093±0屈△501.238±0.148△畫1.357土0.186A00.645±0.03510.736±0.0770.905±0.085△100鄰6±0.107△50U42士0扁△100U58土0.(U1△00.824±0,27410.894±0.0457△1.048±0.049△101.182±0,745△501.260±0.063△1001.264±0,069△00.790±0條10.991±0,045△50.979土0.042△101.050±0.069△501.223±0.08△100U89士0.021△△與對照組(0)比較有統(tǒng)計學(xué)意義，戶<0.01A:bFGF(ng/mL)尸=14.968,尸<0.005B:bFGF(ng/mL)+Fibronectin0.12pg/mLF-31.267,尸<0,005C:bFGF(ng/mL)+Hyaluronic50昭/mLF=43.300，戶〈ft卯5D:bFGF(ng/tnL)十Chitosan50ng/mL尸=33.935，/><0力05表3為bFGF為主因素的系列濃度分別與纖維連接蛋白,透明質(zhì)酸和可溶性殼聚糖對軟骨細胞的影響結(jié)果。根據(jù)SPSS13.0設(shè)計4因素3-Way全交互作用分析表；以bFGF為主因素的系列濃度與三種因素的相互作用，用ANOVAOne-way統(tǒng)計學(xué)分析；因素間的協(xié)同分析用多因素析因分析。bFGF分別與其他3種因素結(jié)合作用于軟骨細胞都有促細胞增殖的作用，ANOVA統(tǒng)計學(xué)分析，P〈0.05，bFGF起主因素作用，見表3。驗^證試驗細胞在同一條件下對單一和復(fù)合材料軟骨細胞增殖的影響。檢測在同一條件下單一和復(fù)合材料對軟骨細胞增殖的影響,采用多因素析因分析，提示bFGF與透明質(zhì)酸有共協(xié)同作用，bFGF能促進軟骨細胞的生長，透明質(zhì)酸對軟骨細胞沒有影響。bFGF(10ng/ml)聯(lián)合透明質(zhì)酸(50~100pg/ml)應(yīng)用對軟骨細胞增殖的作用大于單用bFGF(10ng/ml),bFGF和HA交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),bFGF處于不同水平時(50-500ng/ml),HA(10-5(Hig/ml)因素的作用是不同的，兩藥共同使用效杲更好，有協(xié)同作用。同時用4種因素以最適比例配制復(fù)合培養(yǎng)液，細胞數(shù)48h就增殖3倍多，見表4。表4為復(fù)合因素對軟骨細胞增殖的協(xié)同分析數(shù)據(jù)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例七軟骨細胞功能測定用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)軟骨細胞，分別取第5、7、9代細胞爬片，采用SafranineO進行細胞外基質(zhì)糖胺多糖染色，可見細胞合成分泌的糖胺多糖堆積在細胞周圍基質(zhì)中并染成紅色，顯示有大量蛋白聚糖基質(zhì)產(chǎn)生，第九代仍有集落產(chǎn)生，見圖6。在DMEM/HAM、F12復(fù)合培養(yǎng)基的海藻酸鈉栽體中，模擬細胞體內(nèi)微環(huán)境，選擇了1.2%海藻酸鈉作為細胞支架，適合細胞生長的外基質(zhì)材料，用正交試驗設(shè)計建立了復(fù)合DMEM/HamF12的體外培養(yǎng),包括10ng/mlbFGF、5|ig/mlHyaluronic、0.2pg/mlFibronectin(美國Sigma乂>司)，50(ig/ml可溶性Chitosan,(上海奇勝生物有限公司)DMEM/HamF121:1(美國Gibco公司)等主要成分，經(jīng)正交試驗及重復(fù)試驗、驗證試驗，確定了各因素的有效濃度及配比方案，在復(fù)合DMEM/F^培養(yǎng)基的海藻酸鈉載體支架中培養(yǎng)軟骨細胞能快速增殖，細胞數(shù)48h就增殖3倍多，SafranineOGAG染色顯示傳至P9仍然產(chǎn)生大量蛋白聚糖基質(zhì)。LDH檢測未見毒副作用。該復(fù)合載體具有良好的成形性和組織相容性。快速增殖并有利于維持軟骨細胞表型及功能的表達。用于MSCs誘導(dǎo)的軟骨細胞也取得同樣效果。實施例八本發(fā)明的一個優(yōu)選方案與K丄indenhayn法細胞增殖數(shù)量比較K丄indenhayn是單純用1.2%海藻酸鈉珠培養(yǎng)軟骨細胞,其細胞數(shù)稍有增高，在海藻酸鈉中加入0.35%透明質(zhì)酸，其細胞數(shù)3天可以增加100%,而在這基礎(chǔ)上加入1.25%纖維連接蛋白，其細胞數(shù)1天就可以增加100%。本方案用1.2%海藻酸鈉，混合細胞懸液后加入102mmol/LCaCl2制成膠體，再用以DMEM/F12l:l作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入新鮮配置的10ng/ml堿性成纖維生長因子，5pg/ml透明質(zhì)酸，0.2pg/ml纖維連接蛋白，5(Hig/ml可溶性殼聚糖，同法培養(yǎng)。最重要的是利用了堿性成纖維生長因子與透明質(zhì)酸的共協(xié)同作用，加上纖維連接蛋白幾乎與所有類型的膠原分子都能進行結(jié)合，但與軟骨細胞分泌的II膠原分子之間具有更高的親和力，促使細胞增殖數(shù)48h就增殖3倍多。K丄indenhayn法配制是1.2%海藻酸鈉過程中，用102mmol/LCaCl2交聯(lián)液中，用55NIH維蛋白酶元+46IU/ml凝血酶經(jīng)15-20min孵育生成纖維蛋白，使纖維蛋白包含在材料支架中，本方案直接用純品纖維連接蛋白，可溶于水，對細胞作用效果明顯。K.Lindenhayn法的材料支架中是以1.2%海藻酸鈉為主交聯(lián)而成，生物力學(xué)不夠，本方案是加入可溶性殼聚糖加以改善。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種立體增殖軟骨細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將單層培養(yǎng)軟骨細胞消化后加入海藻酸鈉-氯化鈉溶液中混合；(2)用吸尖將步驟(1)得到的混合液滴于氯化鈣溶液中，成凝膠；(3)將步驟(2)得到的凝膠依次用氯化鈉溶液和完全培養(yǎng)基洗，再在復(fù)合DMEM/HamF12培養(yǎng)基上培養(yǎng)；其中，所述復(fù)合DMEM/HamF12培養(yǎng)基包括10ng/ml堿性成纖維生長因子、5μg/ml透明質(zhì)酸、0.2μg/ml纖維連接蛋白，50μg/ml可溶性殼聚糖和1∶1的DMEM/HamF12。2、如權(quán)利要求1所述的一種立體增殖軟骨細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(1)中的單層培養(yǎng)軟骨細胞的濃度為l~6xl05/mL。3、如權(quán)利要求1所述的一種立體增殖軟骨細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(1)中的海藻酸鈉的濃度為12g/L。4、如權(quán)利要求1所述的一種立體增殖軟骨細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(1)中的氯化鈉的濃度為O.15mol/L。5、如權(quán)利要求1所述的一種立體增殖軟骨細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(2)中的氯化鈣的濃度為102mmol/L。6、如權(quán)利要求1所述的一種立體增殖軟骨細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(2)中成凝膠的條件為37°C，5%C02,10min。7、如權(quán)利要求1所述的一種立體增殖軟骨細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于,所述步驟(3)中的氯化鈉的濃度為O.15mol/L。全文摘要本發(fā)明公開了一種立體增殖軟骨細胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟先將單層培養(yǎng)軟骨細胞消化后加入海藻酸鈉-氯化鈉溶液中混合；再用吸尖將得到的混合液滴于氯化鈣溶液中成凝膠；最后將得到的凝膠依次用氯化鈉溶液和完全培養(yǎng)基洗，再在復(fù)合DMEM/HamF12培養(yǎng)基上培養(yǎng)。復(fù)合DMEM/HamF12培養(yǎng)基包括10ng/ml堿性成纖維生長因子、5μg/ml透明質(zhì)酸、0.2μg/ml纖維連接蛋白，50μg/ml可溶性殼聚糖和1∶1的DMEM/HamF12。本發(fā)明的培養(yǎng)方法能在短時間內(nèi)提高培養(yǎng)細胞的數(shù)量和質(zhì)量，快速增殖軟骨細胞，可長期培養(yǎng)并能保存細胞表型。文檔編號C12N5/06GK101407786SQ20081019846公開日2009年4月15日申請日期2008年9月10日優(yōu)先權(quán)日2008年9月10日發(fā)明者梁偉國,雁沈,陳鴻輝申請人:廣州市創(chuàng)傷外科研究所