用于篩選α-淀粉酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及親本α-淀粉酶的變體。本發(fā)明還涉及包含編碼這些變體的多核苷酸、包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞；以及使用這些變體的方法。
【專利說明】用于篩選α-淀粉酶的方法
[000?] 序列表的引用
[0002]本申請含有計算機可讀取形式的序列表，所述序列表通過引用的方式結(jié)合在此。
[0003]發(fā)明背景
發(fā)明領域
[0004]本發(fā)明涉及用于篩選在低溫具有高性能的、特別是在洗滌劑中在低溫具有高性能的α-淀粉酶的方法。本發(fā)明還涉及包含這類淀粉酶的洗滌劑組合物。相關技術(shù)的說明
[0005]α -淀粉酶(α -1, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε.C.3.2.1.1)構(gòu)成一組酶，這些酶催化淀粉和其他直鏈和支鏈1，4-糖苷低聚糖和多糖的水解。
[0006]α -淀粉酶在工業(yè)上用于幾種已知應用如洗滌劑、烘焙、釀造、淀粉液化和糖化例如在制備高果糖糖漿中或用作從淀粉生產(chǎn)乙醇的一部分的用途具有悠久歷史。α -淀粉酶的這些應用和其他應用是已知的并且利用源自微生物的α-淀粉酶，特別是細菌α-淀粉酶。
[0007]屬于首先被使用的細菌α -淀粉酶是來自地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)的α -淀粉酶，還稱作Termamyl,所述Termamyl已經(jīng)被充分表征并且這種酶的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定。堿性淀粉酶(如SP707)形成一個特定的已經(jīng)用于洗滌劑中的α-淀粉酶的組。這些已知的細菌淀粉酶中許多已經(jīng)經(jīng)修飾以便改進它們在特定應用中的功能性。
[0008]已經(jīng)充分研究了增加α -淀粉酶熱穩(wěn)定性的方法。鈴木(Suzuki)等人(1989)披露了其中已經(jīng)將解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) α -淀粉酶的指定區(qū)域置換為地衣芽孢桿菌α -淀粉酶的相應區(qū)域的嵌合α -淀粉酶。構(gòu)建這種嵌合α _淀粉酶，目的在于鑒定負責熱穩(wěn)定性的區(qū)域。發(fā)現(xiàn)這類區(qū)域包含解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶的第177-186位氨基酸殘基和第255-270位氨基酸殘基。五十嵐(Igarashi)等人1998顯示可以通過從環(huán)(F178至Α184)中缺失兩個氨基酸殘基R179-G180 (AmyS編號)而增加AmyS-型淀粉酶的熱穩(wěn)定性。然而，曉(Shiau)等人(2003)顯示在相同環(huán)中具有缺失的AmyS酶在高溫具有比親本酶更低的玉米淀粉水解比活性，從而否定了 AmyS淀粉酶的主要優(yōu)點之一。
[0009]出于環(huán)境原因，在洗滌、餐具洗滌和/或清潔過程中降低溫度已經(jīng)日益重要。然而，大多數(shù)酶(包括淀粉酶)具有通常在低溫洗滌中所用溫度以上的最適溫度。α -淀粉酶是用于洗滌劑組合物中的關鍵酶并且對于衣物洗滌或餐具洗滌期間去除淀粉污潰，其用途已經(jīng)變得日益重要。因此，重要的是找到這樣的α-淀粉酶變體，它們在溫度降低時保留其洗滌性能、污潰去除作用和/或活性。然而，盡管當前洗滌劑酶組合物的效率，仍然存在著難以徹底去除的許多污潰。這些問題因利用低(例如，冷水)洗滌溫度的增加和較短的洗滌周期而加劇。因而，需要獲得這樣的淀粉分解酶，這些酶可以在低溫下起作用并同時保留或增加其他令人希望的特性如比活性(淀粉分解活性)、穩(wěn)定性和/或洗滌性能。
[0010]因而，本發(fā)明的目的是提供用于篩選具有高性能、尤其在低溫具有高洗滌性能的α-淀粉酶和變體的改進方法。
[0011]發(fā)明簡述[0012]在第一方面，本發(fā)明涉及用于篩選具有高性能、尤其在低溫具有高洗滌性能的α -淀粉酶的方法，所述方法包括以下步驟:
[0013]a)測定這些酶與α淀粉酶的固體或固定底物如淀粉的結(jié)合，
[0014]b)選擇對底物具有低親和力、特別是在底物結(jié)合和活性之間具有低比率的α -淀粉酶。
[0015]在一個另外的方面，本發(fā)明涉及用于選擇親本α-淀粉酶的變體的方法，所述方法包括以下步驟:
[0016]a)通過在位于親本α -淀粉酶的表面處的一個或多個氨基酸中置換、缺失或插入一個或多個氨基酸殘基產(chǎn)生變體；
[0017]b)檢驗變體與α -淀粉酶的固體或固定底物如淀粉的結(jié)合；
[0018]c)選擇比親本α -淀粉酶具有較低底物結(jié)合的變體。
[0019]在一個另外的方面，本發(fā)明涉及可以基于要求保護的方法進行選擇的變體和包含使用本發(fā)明方法所選擇的α-淀粉酶的洗滌劑組合物。
[0020]發(fā)明詳細說明
[0021]本發(fā)明基于以下觀察結(jié)果:在淀粉酶與生淀粉結(jié)合和低溫性能、尤其低溫洗滌性能之間存在反相關。例如，利 用許多實驗性洗滌劑淀粉酶樣品的數(shù)據(jù)，在AMSA檢驗中在米淀粉結(jié)合和洗滌性能之間存在著明確的相關性。因而，已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)具有低固體底物結(jié)合的α -淀粉酶在低溫具有高性能，特別是在低溫在洗滌劑中的高性能。
[0022]定義
[0023]α -淀粉酶活性:術(shù)語“ α -淀粉酶活性”意指α -1, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.1)的活性，這些酶構(gòu)成一組催化淀粉和其他直鏈和支鏈1，4-糖苷低聚糖和多糖水解的酶。
[0024]底物結(jié)合:術(shù)語“底物結(jié)合”或“與固體底物結(jié)合”或語法上等同的術(shù)語理解為α -淀粉酶與固體底物(包括固定至固體材料的底物)結(jié)合的特性。該術(shù)語是相對術(shù)語并且它通常表述為與參考α-淀粉酶相比的相對結(jié)合。對于變體，通常相對于充當變體的起點的親本α-淀粉酶測量底物結(jié)合?？梢酝ㄟ^如下方式測量底物結(jié)合:將α-淀粉酶的溶液與固體底物孵育，去除底物并測定初始量的α-淀粉酶中仍然與固體底物附著的比例，下文在材料與方法部分中披露了用于測定底物與固體底物結(jié)合的優(yōu)選方法。
[0025]變體:術(shù)語“變體”意指在一個或多個(幾個)位置包含改變(即，置換、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。置換意指將占據(jù)某個位置的氨基酸替換為不同的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)某個位置的氨基酸；并且插入意指鄰近占據(jù)某個位置的氨基酸添加1-3個氨基酸。
[0026]突變體:術(shù)語“突變體”意指編碼變體的多核苷酸。
[0027]野生型酶:術(shù)語“野生型” α-淀粉酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中發(fā)現(xiàn)的細菌、酵母或絲狀真菌)表達的α-淀粉酶。
[0028]親本或親本α-淀粉酶:術(shù)語“親本”或“親本α-淀粉酶”意指對其進行改變以產(chǎn)生本發(fā)明酶變體的α-淀粉酶。親本可以是天然存在的(野生型)多肽或其變體。相對于變體，親本多肽是除了在變體中具體改變的殘基之外與變體具有完全相同的序列的多肽。
[0029]分離的變體:術(shù)語“分離的變體”意指通過人工修飾的變體。在一個方面，該變體是至少1%純的，例如至少5%純的，至少10%純的，至少20%純的，至少40%純的，至少60%純的，至少80%純的并且至少90%純的，如通過SDS-PAGE所測定。
[0030]基本上純的變體:術(shù)語“基本上純的變體”意指按重量計含有最多10%、最多8%、最多6%、最多5%、最多4%、最多3%、最多2%、最多1%和最多0.5%與該多肽天然或重組結(jié)合的其他多肽物質(zhì)的制劑。優(yōu)選地，按在該制劑中存在的總多肽物質(zhì)的重量計，該變體是至少92%純的，例如至少94%純的、至少95%純的、至少96%純的、至少97%純的、至少98%純的、至少99%、至少99.5%純的、和100%純的。本發(fā)明的變體優(yōu)選地處于基本上純的形式。這可以例如通過熟知的重組方法或通過經(jīng)典純化方法制備該變體來實現(xiàn)。
[0031]成熟多肽:術(shù)語“成熟多肽”意指在翻譯和任何翻譯后修飾如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等之后處于其最終形式的多肽。
[0032]成熟多肽編碼序列:術(shù)語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有α -淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
[0033]序列一致性:兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的關聯(lián)性由參數(shù)“序列一致性”描述。
[0034]出于本發(fā)明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(尼德爾曼(Needleman)和文施(Wunsch), 1970，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.) 48:443-453)確定兩個氨基酸序列之間的序列一致性的程度，如在 EMBOSS 軟件包(EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software SuiteCEMBOSS:歐洲分子生物學開放軟件包)，Rice等人,2000,遺傳學趨勢(Trends Genet.) 16: 276-277)的Needle程序，優(yōu)選地3.0.0版或更后的版本中所執(zhí)行的。所用的任選參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)替代矩陣。將Needle標記的“最長一致性”(使用_ nobrief選項獲得)的輸出用作一致性百分比并且計算如下:(相同殘 基XlOO)/ (比對的長度-在比對中的空位總數(shù))
[0035]出于本發(fā)明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(尼德爾曼(Needleman)和文施(Wunsch), 1970，上文)確定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間序列一致性的程度，如EMBOSS軟件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS:歐洲分子生物學開放軟件包)，Rice等人，2000，上文)的Needle程序，優(yōu)選地3.0.0版或更后的版本中所執(zhí)行。所用的任選參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5、和EDNAFULL (NCBINUC4.4的EMBOSS版)替代矩陣。將Needle標記的“最長一致性”(使用-nobrief選項獲得)的輸出用作一致性百分比并且計算如下:(相同脫氧核糖核苷酸XlOO)/ (比對的長度-在比對中的空位總數(shù))
[0036]片段術(shù)語“片段”意指使得一個或多個(幾個)氨基酸從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的多肽；其中所述片段具有α -淀粉酶活性。
[0037]子序列:術(shù)語“子序列”意指使得一個或多個(幾個)核苷酸從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’末端缺失的多核苷酸；其中所述子序列編碼具有α-淀粉酶活性的片段。
[0038]等位基因變體:術(shù)語“等位基因變體”意指占據(jù)相同染色體基因座的基因的兩種或更多種替代形式的任一種。等位基因變異通過突變而自然發(fā)生，并且可以導致群體內(nèi)部的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽方面無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0039]分離的多核苷酸:術(shù)語“分離的多核苷酸”意指通過人工修飾過的多核苷酸。在一個方面，分離的多核苷酸是至少1%純的，例如至少5%純的，至少10%純的，至少20%純的，至少40%純的，至少60%純的，至少80%純的，至少90%純的并且至少95%純的，如通過瓊脂糖電泳所測定的。多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的或它們的任何組
八
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[0040]基本上純的多核苷酸:術(shù)語“基本上純的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且處在適用于基因修飾多肽生產(chǎn)系統(tǒng)內(nèi)部的形式下的多核苷酸制劑。因而，基本上純的多核苷酸含有按重量計最多10%、最多8%、最多6%、最多5%、最多4%、最多3%、最多2%、最多1%和最多0.5%與該多核苷酸天然或重組結(jié)合的其他多核苷酸物質(zhì)。然而，基本上純的多核苷酸可以包含天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，如啟動子和終止子。優(yōu)選的是，基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純的，例如至少92%純的，至少94%純的，至少95%純的，至少96%純的，至少97%純的，至少98%純的，至少99%純的，以及至少99.5%純的。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選地處于基本上純的形式。
[0041]編碼序列:術(shù)語“編碼序列”意指直接指定其多肽產(chǎn)物的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的界限通常由開放閱讀框決定，所述開放閱讀框通常以ATG起始密碼子或替代的起始密碼子如GTG和TTG開始并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成或重組多核苷酸。
[0042]cDNA:術(shù)語“cDNA”意指可以通過逆轉(zhuǎn)錄從獲自真核細胞的成熟剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相應基因組DNA中的內(nèi)含子序列。初始的初級RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的 前體，所述前體在作為成熟剪接的mRNA出現(xiàn)之前經(jīng)一系列步驟(包括剪接)加工。
[0043]核酸構(gòu)建體:術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子從天然存在的基因分離或經(jīng)修飾以含有處于本來在自然界中不存在的形式的或為合成的核酸區(qū)段。當核酸構(gòu)建體含有表達本發(fā)明編碼序列所需的控制序列時，術(shù)語“核酸構(gòu)建體”與術(shù)語“表達盒”同義。
[0044]控制序列術(shù)語“控制序列”意指為編碼本發(fā)明變體的多核苷酸表達所必需的所有組分。每個控制序列可以相對于編碼變體的多核苷酸是天然或外來的或彼此是天然或外來的。這類控制序列包括但不限于前導序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號?？刂菩蛄锌梢耘溆薪宇^，目的在于引入促進控制序列與編碼變體的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制性位點。
[0045]可操作地連接:術(shù)語“可操作地連接”意指其中將控制序列相對于多核苷酸的編碼序列置于適宜位置處使得控制序列指導編碼序列表達的構(gòu)型。
[0046]表達:術(shù)語“表達”包括涉及變體產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。
[0047]表達載體:術(shù)語“表達載體”意指線性或環(huán)狀DNA分子，所述DNA分子包含編碼變體的多核苷酸并且與導致其表表達的另外的核苷酸可操作地連接。
[0048]宿主細胞:術(shù)語“宿主細胞”意指易于用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導等等的任何細胞類型。術(shù)語“宿主細胞”涵蓋因復制期間出現(xiàn)的突變而與親本細胞不完全相同的任何親本細胞子代。[0049]淀粉去除過程:表述“淀粉去除過程”涉及任何種類的借以去除(或轉(zhuǎn)化)淀粉的過程，如在其中從紡織品去除淀粉的洗滌過程中，例如紡織品清潔如洗衣。淀粉去除過程也可能是硬質(zhì)表面清潔，如餐具洗滌或它可能是一般清潔過程，如工業(yè)清潔或機構(gòu)清潔。該表述通常還包括其他淀粉去除過程或淀粉轉(zhuǎn)化、乙醇生產(chǎn)、淀粉液化、紡織品退漿、紙和紙漿生產(chǎn)、啤酒制造和洗滌劑。
[0050]改善的特性:術(shù)語“改善的特性”意指與變體相關的與親本相比得到改善的特征。這類改善的特性包括但不限于熱活性、熱穩(wěn)定性、PH活性、pH穩(wěn)定性、底物/輔因子特異性、改善的表面特性、產(chǎn)物特異性、在預處理的生物質(zhì)存在下增加的穩(wěn)定性或溶解度、在儲存條件下改善的穩(wěn)定性、以及化學穩(wěn)定性。
[0051]洗滌性能:在本發(fā)明情況下，使用術(shù)語“洗滌性能”作為酶在例如衣物或硬質(zhì)表面清潔如餐具洗滌期間去除存在于待清潔的物體上的淀粉或含淀粉污潰的能力?？梢酝ㄟ^計算在AMSA說明中和在下文方法部分中的燒杯洗滌性能測試中定義的所謂的強度值(Int)將洗滌性能定量。
[0052]改善的洗滌性能:術(shù)語“改善的洗滌性能”在此定義為相對于親本淀粉酶的洗滌性能或相對于具有所述變體的相同氨基酸序列但是在一個或多個指定位置不具有缺失的α-淀粉酶或相對于具有在SEQ ID Ν0:4中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的活性，變體酶顯示出淀粉酶變體的洗滌性能的改變，例如增加的污潰去除。術(shù)語“洗滌性能”包括通常清潔例如硬質(zhì)表面清潔，如在餐具洗滌中，還包括在紡織品如衣物上的洗滌性能，并且還包括工業(yè)清潔和機構(gòu)清潔。
[0053]低溫:“低溫”是5 V -350C、優(yōu)選5 V -30 V、更優(yōu)選5 V -25°C、更優(yōu)選5 V -20 V、最優(yōu)選5°C -15°C并且 特別地5°C -10°C的溫度。在一個優(yōu)選實施例中，“低溫”是IO0C -35°C、優(yōu)選10°C -30°C、更優(yōu)選10°C -25°C、最優(yōu)選10°C _20°C，并且特別地10°C _15°C的溫度。
[0054]在第一方面，本發(fā)明涉及用于篩選在低溫具有高性能、尤其在低溫具有高洗滌性能的α-淀粉酶的方法，所述方法包括以下步驟:
[0055]a)測定這些酶與α淀粉酶的固體或固定底物如淀粉的結(jié)合，
[0056]b)選擇與所述底物具有低結(jié)合的α -淀粉酶、特別是具有底物結(jié)合和活性的低比率的α-淀粉酶。
[0057]根據(jù)這個方面，本發(fā)明涉及篩選在低溫具有高性能的α -淀粉酶，特別是篩選在低溫具有高洗滌性能的洗滌劑用α-淀粉酶。該方法適用于篩選新α-淀粉酶以便找到在低溫具有良好性能的酶。該方法也可以具有被自動化并且適合于高通量篩選程序的優(yōu)點。
[0058]在一個實施例中，該方法適用于找到新的α-淀粉酶。一種合宜的方式是測試許多候選α-淀粉酶并包含一種已知的洗滌劑用α-淀粉酶作為標準，并且然后選擇比標準洗滌劑用α-淀粉酶具有更低底物結(jié)合的新候選α-淀粉酶。選擇的α-淀粉酶將是具有高洗滌性能的候選物并且可以進一步測試對洗滌劑用酶重要的其他特性，如穩(wěn)定性、比活性等等。
[0059]從文獻已知幾種洗滌劑用淀粉酶，包括野生型淀粉酶如具有SEQ ID N0:l、2、3、
4、5、6、8、10、11和12的α-淀粉酶、任何這些α -淀粉酶的變體，如在W02001066712和W02006002643中披露的變體，并且可以在方法中適當?shù)匕魏芜@些已知洗滌劑用淀粉酶作為標準洗滌劑用α-淀粉酶。[0060]將這種實施例中的α -淀粉酶選擇為比選擇的標準洗滌劑用淀粉酶具有更低的底物結(jié)合，如具有標準洗滌劑用α -淀粉酶的小于95%的結(jié)合，如小于90%的結(jié)合；優(yōu)選地小于80%的結(jié)合、優(yōu)選地小于70%的結(jié)合、優(yōu)選地小于60%的結(jié)合、優(yōu)選地小于50%的結(jié)合、優(yōu)選地小于40%的結(jié)合、優(yōu)選地小于30%的結(jié)合、更優(yōu)選地小于20%的結(jié)合、更優(yōu)選地小于10%的結(jié)合和最優(yōu)選地小于5%的結(jié)合。
[0061]可替代地，使用SP722(具有SEQ ID NO:1的α -淀粉酶)作為標準洗滌劑用α -淀粉酶時，該方法可以用于通過以下方式選擇具有改善的低溫洗滌性能的α-淀粉酶:選擇這樣的α -淀粉酶，所述α -淀粉酶比SP722具有更低的底物結(jié)合，優(yōu)選地小于90%的結(jié)合；優(yōu)選地小于80%的結(jié)合、優(yōu)選地小于70%的結(jié)合、優(yōu)選地小于60%的結(jié)合、優(yōu)選地小于50%的結(jié)合、優(yōu)選地小于40%的結(jié)合、優(yōu)選地小于30%的結(jié)合、更優(yōu)選地小于20%的結(jié)合和最優(yōu)選地小于10%的結(jié)合。
[0062]可替代地，使用SP707(具有SEQ ID NO: 2的α -淀粉酶)作為標準洗滌劑用α -淀粉酶時，該方法可以用于通過以下方式選擇具有改善的低溫洗滌性能的α-淀粉酶:選擇這樣的α -淀粉酶，所述α -淀粉酶比SP707具有更低的底物結(jié)合，優(yōu)選地小于90%的結(jié)合；優(yōu)選地小于80%的結(jié)合、優(yōu)選地小于70%的結(jié)合、優(yōu)選地小于60%的結(jié)合、優(yōu)選地小于50%的結(jié)合、優(yōu)選地小于40%的結(jié)合、優(yōu)選地小于30%的結(jié)合、更優(yōu)選地小于20%的結(jié)合和最優(yōu)選地小于10%的結(jié)合。
[0063]可替代地，使用ΑΑ560(具有SEQ ID NO: 3的α -淀粉酶)作為標準洗滌劑用α -淀粉酶時，該方法可以用于通過以下方式選擇具有改善的低溫洗滌性能的α-淀粉酶:選擇這樣的α -淀粉酶，所述α -淀粉酶比ΑΑ560具有更低的底物結(jié)合，優(yōu)選地小于90%的結(jié)合；優(yōu)選地小于80%的結(jié)合、優(yōu)選地小于70%的結(jié)合、優(yōu)選地小于60%的結(jié)合、優(yōu)選地小于50%的結(jié)合、優(yōu)選地小于40%的結(jié)合、優(yōu)選地小于30%的結(jié)合、更優(yōu)選地小于20%的結(jié)合和最優(yōu)選地小于10%的結(jié)合。
[0064]可替代地，使用SP690(具有SEQ ID N0:4的α -淀粉酶)作為標準洗滌劑用α -淀粉酶時，該方法可以用于通過以下方式選擇具有改善的低溫洗滌性能的α-淀粉酶:選擇這樣的α -淀粉酶，所述α -淀粉酶比SP690具有更低的底物結(jié)合，優(yōu)選地小于90%的結(jié)合；優(yōu)選地小于80%的結(jié)合、優(yōu)選地小于70%的結(jié)合、優(yōu)選地小于60%的結(jié)合、優(yōu)選地小于50%的結(jié)合、優(yōu)選地小于40%的結(jié)合、優(yōu)選地小于30%的結(jié)合、更優(yōu)選地小于20%的結(jié)合和最優(yōu)選地小于10%的結(jié)合。
[0065]可替代地，使用KSM-AP1378 (具有SEQ ID NO: 5的α -淀粉酶)作為標準洗滌劑用α-淀粉酶時，該方法可以用于通過以下方式選擇具有改善的低溫洗滌性能的α-淀粉酶:選擇這樣的α-淀粉酶，所述α-淀粉酶比KSM-AP1378具有更低的底物結(jié)合，優(yōu)選地小于90%的結(jié)合；優(yōu)選地小于80%的結(jié)合、優(yōu)選地小于70%的結(jié)合、優(yōu)選地小于60%的結(jié)合、優(yōu)選地小于50%的結(jié)合、優(yōu)選地小于40%的結(jié)合、優(yōu)選地小于30%的結(jié)合、更優(yōu)選地小于20%的結(jié)合和最優(yōu)選地小于10%的結(jié)合。
[0066]可替代地，使用SP7_7(具有SEQ ID N0:6的α -淀粉酶)作為標準洗滌劑用α -淀粉酶時，該方法可以用于通過以下方式選擇具有改善的低溫洗滌性能的α-淀粉酶:選擇這樣的α -淀粉酶，所述α -淀粉酶比SP7-7具有更低的底物結(jié)合，優(yōu)選地小于90%的結(jié)合；優(yōu)選地小于80%的結(jié)合、優(yōu)選地小于70%的結(jié)合、優(yōu)選地小于60%的結(jié)合、優(yōu)選地小于50%的結(jié)合、優(yōu)選地小于40%的結(jié)合、優(yōu)選地小于30%的結(jié)合、更優(yōu)選地小于20%的結(jié)合和最優(yōu)選地小于10%的結(jié)合。
[0067]本發(fā)明的方法也可以與其他親本α -淀粉酶如地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)a-淀粉酶(BLA)(具有SEQ ID N0:13的a -淀粉酶)一起使用，用于通過以下方式選擇具有改善的低溫性能的a -淀粉酶:選擇這樣的a -淀粉酶，所述a -淀粉酶比BLA具有更低的底物結(jié)合，優(yōu)選地小于90%的結(jié)合；優(yōu)選地小于80%的結(jié)合、優(yōu)選地小于70%的結(jié)合、優(yōu)選地小于60%的結(jié)合、優(yōu)選地小于50%的結(jié)合、優(yōu)選地小于40%的結(jié)合、優(yōu)選地小于30%的結(jié)合、更優(yōu)選地小于20%的結(jié)合和最優(yōu)選地小于10%的結(jié)合。
[0068]可替代地，使用解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefacins) α-淀粉酶(BAN)(具有SEQ ID NO: 14的α -淀粉酶)作為親本α -淀粉酶時，該方法可以用于通過以下方式選擇具有改善的低溫性能的α -淀粉酶:選擇這樣的α -淀粉酶，所述α _淀粉酶比BAN具有更低的底物結(jié)合，優(yōu)選地小于90%的結(jié)合；優(yōu)選地小于80%的結(jié)合、優(yōu)選地小于70%的結(jié)合、優(yōu)選地小于60%的結(jié)合、優(yōu)選地小于50%的結(jié)合、優(yōu)選地小于40%的結(jié)合、優(yōu)選地小于30%的結(jié)合、更優(yōu)選地小于20%的結(jié)合和最優(yōu)選地小于10%的結(jié)合。
[0069]可替代地，使用嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophiIus)(嗜熱脂肪土芽抱桿菌(Geobacillus stearothermophi Ius ) ) 淀粉酶(BSG)(具有 SEQ ID Ν0:15 的α -淀粉酶)作為親本α -淀粉酶時，該方法可以用于通過以下方式選擇具有改善的低溫性能的α -淀粉酶:選擇這樣的α -淀粉酶，所述α _淀粉酶比BSG具有更低的底物結(jié)合，優(yōu)選地小于90%的結(jié)合；優(yōu)選地小于80%的結(jié)合、優(yōu)選地小于70%的結(jié)合、優(yōu)選地小于60%的結(jié)合、優(yōu)選地小于50%的結(jié)合、優(yōu)選地小于40%的結(jié)合、優(yōu)選地小于30%的結(jié)合、更優(yōu)選地小于20%的結(jié)合和最優(yōu)選地小于10%的結(jié)合。
[0070]在一個另外的方面，本發(fā)明涉及用于選擇親本α-淀粉酶的變體的方法，所述方法包括以下步驟:
[0071]a)通過在位于親本α -淀粉酶的表面處的一個或多個氨基酸中置換、缺失或插入一個或多個氨基酸殘基產(chǎn)生變體；
[0072]b)檢驗變體與α -淀粉酶的固體或固定底物如淀粉的結(jié)合；
[0073]c)選擇比親本α -淀粉酶具有較低底物結(jié)合的變體。
[0074]該方法原則上可以用于任何已知的α -淀粉酶，其中需要對其選擇具有改善的低溫性能的變體，然而，在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的方法用于產(chǎn)生具有改善的低溫洗滌性能的變體。
[0075]在其他實施例中，本發(fā)明的方法用于找到淀粉酶以便選擇親本α-淀粉酶的變體，這些變體在涉及清潔區(qū)域的應用中、在如糖化或液化淀粉以便將淀粉降解成糖(所述糖可以被發(fā)酵以提供用于消費或用于燃料的乙醇)的應用中或在紡織品制造應用中具有改善的低溫性能。所有這樣的應用是本領域已知的并且技術(shù)人員將領會可以怎樣在這些應用中應用根據(jù)本發(fā)明方法選擇的α-淀粉酶。
[0076]在這種優(yōu)選的實施例中，親本α-淀粉酶可以是洗滌劑用α-淀粉酶，即在清潔和洗衣中通常所應用的條件下具有活性的α-淀粉酶，如在洗滌劑中常規(guī)使用的表面活性劑、螯合劑和其他組分存在下具有活性和在堿性PH如8-11如9-10范圍內(nèi)具有活性的α -淀粉酶。[0077]可以通過在位于親本α -淀粉酶的表面處的一個或多個氨基酸中置換、缺失或插入一個或多個氨基酸殘基來制備變體。
[0078]技術(shù)人員將知道如何通過鑒定位于親本分子表面處的殘基來鑒定待修飾的殘基。在這一點上，位于分子表面上的殘基被理解為這樣的殘基，其中所述殘基的至少一部分與分子的天然形式下的周圍介質(zhì)直接接觸。應當理解的是，在母體分子的三維結(jié)構(gòu)可獲得的情況下，技術(shù)人員可以從母體分子的三維結(jié)構(gòu)提取這種類型的信息，或在親本的三維結(jié)構(gòu)不是可獲得的情況下，通過如下方式提取這種類型的信息:將親本α-淀粉酶與可獲得其三維結(jié)構(gòu)的α-淀粉酶比對并且將位于分子表面上的殘基鑒定為親本α-淀粉酶的下述殘基，所述殘基在比對中相應于α-淀粉酶中位于表面上的殘基。由于α -淀粉酶的一種以上的三維結(jié)構(gòu)是本領域已知的，因此鑒定位于給定的親本α -淀粉酶表面上的殘基應當基于親本Ct-淀粉酶與下述Ct -淀粉酶的三維結(jié)構(gòu)的比對，其中所述Ct-淀粉酶與親本Ct-淀粉酶具有最高的序列一致性。
[0079]通過以下方式產(chǎn)生變體:在位于親本α -淀粉酶表面處的一個或多個氨基酸中或在位于親本α -淀粉酶表面上的位置中的一個或多個氨基酸殘基置換、缺失或插入一個或多個氨基酸殘基，如位于該表面上置換、缺失或插入至少一個殘基，如至少二個殘基、例如至少三個殘基、例如至少四個殘基、例如至少五個殘基、例如至少六個殘基、例如至少七個殘基、例如至少八個殘基、例如至少九個殘基、例如至少十個殘基，如位于親本α-淀粉酶表面上高達十五個殘基，例如高達二十個殘基或高達三十個殘基。
[0080]變體可以另外地含有在不位于分子表面上的一個或多個氨基酸殘基中的其他置換、缺失或插入。許多這樣的置換、缺失或插入已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中披露并且也可以根據(jù)本發(fā)明使用。作為這樣的優(yōu)選的另外的置換、插入或缺失的實例，可以提到在親本α-淀粉酶中的殘基D183和G184的缺失，如在W096/23873中披露。
[0081]優(yōu)選地產(chǎn)生多種變體， 所述變體與它們的親本α -淀粉酶具有至少90%的序列一致性、優(yōu)選地至少95%的序列一致性、更優(yōu)選至少97%的序列一致性、更優(yōu)選至少98%的序列一致性和最優(yōu)選地至少99%的序列一致性。
[0082]將變體選擇為比親本α -淀粉酶具有更小的底物結(jié)合，如具有親本α -淀粉酶的小于95%的結(jié)合，如小于90%的結(jié)合；優(yōu)選地小于80%的結(jié)合、優(yōu)選地小于70%的結(jié)合、優(yōu)選地小于60%的結(jié)合，優(yōu)選地小于50%的結(jié)合、優(yōu)選地小于40%的結(jié)合、優(yōu)選地小于30%的結(jié)合、更優(yōu)選地小于20%的結(jié)合和最優(yōu)選地小于10%的結(jié)合。
[0083]在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及用于選擇親本α-淀粉酶的變體的方法，所述親本α -淀粉酶選自具有SEQ ID NO: 1-15的α -淀粉酶和與這些α -淀粉酶之一具有少80%序列一致性、優(yōu)選地至少85% —致性、優(yōu)選地至少90% —致性、更優(yōu)選至少95% —致性、更優(yōu)選至少97% —致性的α -淀粉酶，所述方法包括以下步驟:
[0084]a)通過在位于親本α -淀粉酶的表面處的一個或多個氨基酸中置換、缺失或插入一個或多個氨基酸殘基產(chǎn)生變體，其中所述變體與它們的親本α -淀粉酶具有至少90%的序列一致性、優(yōu)選地至少95%的序列一致性、更優(yōu)選至少97%的序列一致性、更優(yōu)選至少98%的序列一致性和最優(yōu)選地至少99%的序列一致性。
[0085]b)檢驗變體與α -淀粉酶的固體或固定底物如淀粉的結(jié)合；和
[0086]c)選擇比親本α -淀粉酶具有更低底物結(jié)合的變體，其中所述變體具有親本α -淀粉酶的小于95%的結(jié)合，如小于90%的結(jié)合；優(yōu)選地小于80%的結(jié)合、優(yōu)選地小于70%的結(jié)合、優(yōu)選地小于60%的結(jié)合、優(yōu)選地小于50%的結(jié)合、優(yōu)選地小于40%的結(jié)合、優(yōu)選地小于30%的結(jié)合、更優(yōu)選地小于20%的結(jié)合和最優(yōu)選地小于10%的結(jié)合。
[0087]在一個另外的實施例中，本發(fā)明涉及用于選擇親本α-淀粉酶的變體的方法，所述親本α -淀粉酶選自具有SEQ ID NO: 1-15的α -淀粉酶以及與這些α -淀粉酶之一具有少80%序列一致性、優(yōu)選地至少85%序列一致性、更優(yōu)選至少87%序列一致性、更優(yōu)選至少90%序列一致性、更優(yōu)選至少95%序列一致性和最優(yōu)選地至少97%序列一致性的α -淀粉酶，其中:
[0088]i)該變體與親本α -淀粉酶具有至少80%序列一致性，優(yōu)選地至少85%、優(yōu)選地至少87%序列一致性，優(yōu)選地至少90%、優(yōu)選地至少95%、優(yōu)選地至少97%，并且
[0089]ii)與親本α -淀粉酶相比，該變體具有較低的固體底物結(jié)合，如小于80%的結(jié)合、優(yōu)選地小于70%、優(yōu)選地小于60%、優(yōu)選地小于50%的結(jié)合、優(yōu)選地小于40%的結(jié)合、優(yōu)選地小于30%的結(jié)合、更優(yōu)選地小于20%的結(jié)合和最優(yōu)選地小于10%的結(jié)合。
[0090]可以使用本發(fā)明的方法提供這類變體。
[0091]本發(fā)明的變體也包括這些變體，其中位于親本α -淀粉酶表面上的并且為底物結(jié)合位點的一部分的一個或多個殘基已經(jīng)被置換或缺失。對于少數(shù)親本α-淀粉酶，已經(jīng)在文獻中披露了存在于親本α-淀粉酶的表面上的這類底物結(jié)合位點，并且技術(shù)人員將理解的是，可以通過將給定的親本α-淀粉酶與已經(jīng)鑒定出這類底物結(jié)合位點的另一個α-淀粉酶序列比對而鑒定出在其他親本α-淀粉酶中的這類底物結(jié)合位點。
[0092]可以提到以下作為底物結(jié)合位點的一部分的殘基的實例:
[0093]a) SEQ ID N0:2 中的 W140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、W284、F289、G304、G305、R320、W347、W439、W469、G476 和 G477
[0094]b)SEQ ID N0:5 中的 W140、W159、W167、Q169、W189、E194、F262、W284、F289、G304、G305、K320、W347、W439、W469、G476 和 G477
[0095]c)SEQ ID N0:4 中的 W140、W159、W167、Q169、W189、E194、F262、W284、F289、G304、G305、K320、W347、W439、W469、G476 和 G477
[0096]d) SEQ ID NO: 13 中的 W138、W157、W165、E167、W184、E189、E255、F257、F279、F284、G299、G300、K315、W342、R437、W467 和 G475,
[0097]e)SEQ ID NO: 14 中的 W136、W155、W163、E165、W184、E189、E255、F257、F279、F284、G299、G300、R315、W342、R437、W467 和 G475,
[0098]f) SEQ ID NO: 15 中的 W139、W158、W166、E168、W187、E192、F260、F287、G302、G303、W345、W437、W467，G474 和 G475。
[0099]本發(fā)明的變體還包括包含一個或多個修飾的變體，其中所述修飾在作為底物結(jié)合位點的一部分的殘基(如上文a)_h)中提到的殘基)附近的位置內(nèi)引入一個或多個大體積氨基酸殘基。在這一點上，大體積氨基酸殘基可以選自具有大側(cè)鏈的氨基酸，如Tyr、Trp,Phe、His和lie，其中Tyr和Trp是優(yōu)選的。在作為底物結(jié)合位點的一部分的殘基附近旨在
表示修飾的殘基位于距離作為底物結(jié)合位點的一部分的殘基小于WA的位置，優(yōu)選地位于距離此類殘基小于6A并且最優(yōu)選地小于3A的位置?；诳色@得的結(jié)構(gòu)信息鑒定這類殘基處于技術(shù)人員能力的范圍之內(nèi)。
[0100]其他優(yōu)選的變體包括這樣的變體，它們與SEQ ID NO: 2具有至少80%序列一致性、優(yōu)選地至少85%序列一致性、更優(yōu)選至少87%序列一致性、更優(yōu)選至少90%序列一致性、更優(yōu)選至少95%序列一致性、更優(yōu)選至少97%序列一致性、更優(yōu)選至少98% —致性、更優(yōu)選至少99%序列一致性，但是小于100%序列一致性并且包含以下置換:
【權(quán)利要求】
1.用于篩選在低溫具有高性能的α-淀粉酶的方法，所述方法包括以下步驟: a)確定α-淀粉酶與α淀粉酶的固體或固定底物如淀粉的結(jié)合； b)選擇與所述底物具有低結(jié)合的α-淀粉酶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中α-淀粉酶在低溫具有高洗滌性能。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述α-淀粉酶比具有SEQID NO: 8的α-淀粉酶具有小于90%的淀粉結(jié)合、優(yōu)選地小于80%、優(yōu)選地小于70%、優(yōu)選地小于65%、優(yōu)選地小于60%、優(yōu)選地小于50%的所述結(jié)合、優(yōu)選地小于40%的所述結(jié)合、優(yōu)選地小于30%的所述結(jié)合、更優(yōu)選地小于20%的所述結(jié)合和最優(yōu)選地小于10%的所述結(jié)合。
4.用于選擇親本α-淀粉酶的變體的方法，所述方法包括以下步驟: a)通過在位于親本α-淀粉酶的表面處的一個或多個氨基酸中置換、缺失或插入一個或多個氨基酸殘基產(chǎn)生變體； b)檢驗變體與α-淀粉酶的固體或固定底物如淀粉的結(jié)合； c)選擇比親本α-淀粉酶具有較低底物結(jié)合的變體。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中親本α-淀粉酶選自與SEQID ΝΟ:1_15之一具有至少80%序列一致性、優(yōu)選地至少85%序列一致性、更優(yōu)選至少90%序列一致性、更優(yōu)選至少95%序列一致性、更優(yōu)選至少97%序列一致性、更優(yōu)選至少98% —致性的淀粉酶。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述變體比親本α-淀粉酶具有小于90%的淀粉結(jié)合，優(yōu)選地小于80%、優(yōu)選地小于70%、優(yōu)選地小于65%、優(yōu)選地小于60%、優(yōu)選地小于50%的所述結(jié)合，優(yōu)選地小于40%的所述結(jié)合，優(yōu)選地小于30%的所述結(jié)合，更優(yōu)選地小于20%的所述結(jié)合和最優(yōu)選地小于10%的所述結(jié)合。
7.一種變體多肽，具有α -淀粉酶活性并且與SEQ ID NO: 1-15之一具有至少80%序列一致性、優(yōu)選地至少85%序列一致性、更優(yōu)選至少90%序列一致性、更優(yōu)選至少95%序列一致性、更優(yōu)選至少97%序列一致性、更優(yōu)選至少98%序列一致性和最優(yōu)選地至少99%序列一致性，所述變體通過選自置換、插入和缺失的一種或多種(例如，幾種)修飾衍生自親本α-淀粉酶，其中與專利α-淀粉酶相比，所述變體α-淀粉酶具有較低的固體淀粉結(jié)合和較高的低溫(例如15°C)洗滌性能。
8.如權(quán)利要求7所述的變體α-淀粉酶，其中在分子表面的一個或多個底物結(jié)合位點內(nèi)的氨基酸殘基已經(jīng)被修飾。
9.如權(quán)利要求7所述的變體α-淀粉酶，所述變體α -淀粉酶選自: a)與SEQID NO: 2具有至少80%序列一致性、優(yōu)選地至少85%序列一致性、更優(yōu)選至少90%序列一致性、更優(yōu)選至少95%序列一致性、更優(yōu)選至少97%序列一致性、更優(yōu)選至少98%序列一致性和最優(yōu)選地至少99%序列一致性，并且包含位置181+182、或182+183、或183+184 的缺失并且進一步包含在與 SEQ ID NO: 2 中 W140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、W284、F289、G304、G305、R320、W347、W439、W469、G476 和 G477 相應的任何位置內(nèi)的一種或兩種或更多種修飾的變體α-淀粉酶； b)與SEQID NO: 5具有至少80%序列一致性、優(yōu)選地至少85%序列一致性、更優(yōu)選至少90%序列一致性、更優(yōu)選至少95%序列一致性、更優(yōu)選至少97%序列一致性、更優(yōu)選至少98%序列一致性和最優(yōu)選地至少99%序列一致性，并且包含位置181+182、或182+183、或183+184 的缺失并且進一步包含在與 SEQ ID NO: 5 中 W140、W159、W167、Q169、W189、E194、F262、W284、F289、G304、G305、K320、W347、W439、W469、G476 和 G477 相應的任何位置內(nèi)的一種或兩種或更多種修飾的變體α-淀粉酶； c)與SEQID NO:4具有至少80%序列一致性、優(yōu)選地至少85%序列一致性、更優(yōu)選至少90%序列一致性、更優(yōu)選至少95%序列一致性、更優(yōu)選至少97%序列一致性、更優(yōu)選至少98%序列一致性和最優(yōu)選地至少99%序列一致性，并且包含位置181+182、或182+183、或183+184 的缺失并且進一步包含在與 SEQ ID NO: 4 中 W140、W159、W167、Q169、W189、Ε194、F262、W284、F289、G304、G305、Κ320、W347、W439、W469、G476 和 G477 相應的任何位置內(nèi)的一種或兩種或更多種修飾的變體α-淀粉酶； d)與SEQID NO: 13具有至少80%序列一致性、優(yōu)選地至少85%序列一致性、更優(yōu)選至少90%序列一致性、更優(yōu)選至少95%序列一致性、更優(yōu)選至少97%序列一致性、更優(yōu)選至少98%序列一致性和最優(yōu)選地至少99%序列一致性，并且包含在與SEQ ID NO: 13中W138、W157、W165、E167、W184、E189、E255、F257、F279、F284、G299、G300、K315、W342、R437、W467和G475相應的任何位置內(nèi)的修飾的變體α -淀粉酶； e)與SEQID NO: 14具有至少80%序列一致性、優(yōu)選地至少85%序列一致性、更優(yōu)選至少90%序列一致性、更優(yōu)選至少95%序列一致性、更優(yōu)選至少97%序列一致性、更優(yōu)選至少98%序列一致性和最優(yōu)選地至少99%序列一致性，并且包含位置176+177、或177+178、或178+179 的缺失并且進一步包含在與 SEQ ID NO: 14 中 W136、W155、W163、E165、W184、E189、E255、F257、F279、F284、G299、G300、R315、W342、R437、W467 和 G475 相應的任何位置內(nèi)的一種或兩種或更多種修飾的變體α -淀粉酶；和 f)與SEQID NO: 15具有至少80%序列一致性、優(yōu)選地至少85%序列一致性、更優(yōu)選至少90%序列一致性、更優(yōu)選至少95%序列一致性、更優(yōu)選至少97%序列一致性、更優(yōu)選至少98%序列一致性和最優(yōu)選地至少99%序列一致性，并且包含位置179+180、或180+181、或181+182 的缺失并且進一步包含在與 SEQ ID NO: 15 中 W139、W158、W166、E168、W187、E192、F260、F287、G302、G303、W345、W437、W467、G474和G475相應的任何位置內(nèi)的一種或兩種或更多種修飾的變體α -淀粉酶， 其中a-f中的修飾優(yōu)選地是置換。
10.如權(quán)利要求7至9中任一項所述的變體α -淀粉酶，所述變體α -淀粉酶與SEQID NO: 2具有至少90%序列一致性并且包含在與SEQ ID NO: 2中以下位置相應的位置內(nèi)的修飾:
H183*+G184*+W140F ；
H183*+G184*+Q169N ；
H183*+G184*+Q169A ；
H183*+G184*+W189Y+E190P ；
H183*+G184*+N260D ；
H183*+G184*+G477E ；
H183*+G184*+G477Q ；
H183*+G184*+G477K ；
H183*+G184*+W189E+E190P ；
H183*+G184*+A51I+W140Y ；
11.
H183*+G184*+W159Y+W167Y+N260P+E439Y+G476Q+G477Q ；和 H183*+G184*+W167Y+F262P+W469Y+G476R+G477Q。
12.如權(quán)利要求7至9中任一項所述的變體α-淀粉酶，所述變體α-淀粉酶與SEQID NO: 14具有至少90%序列一致性并且包含在與SEQ ID NO: 14中以下位置相應的位置內(nèi)的修飾:

13.如權(quán)利要求12所述的變體，所述變體由具有選自以下修飾的SEQID NO: 14組成:
14.如權(quán)利要求7所述的變體α-淀粉酶，所述變體α-淀粉酶與SEQID NO: 13具有至少90%序列一致性并且包含在與SEQ ID NO: 13中的位置Κ315和/或W467相應的位置內(nèi)的修飾。
15.如權(quán)利要求14所述的變體，所述變體由具有置換Κ315Μ的SEQID NO: 13組成。
16.包含如權(quán)利要求7-15中任一項所述的變體α-淀粉酶的洗滌劑組合物。
17.如權(quán)利要求7-15中任一項所述的變體α-淀粉酶的用途，用于清潔過程如衣物或硬質(zhì)表面清潔， 包括自動化餐具洗滌。
【文檔編號】C12Q1/40GK103703124SQ201280032797
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月30日
【發(fā)明者】S.卡斯加德, S.E.拉森, J.奧布羅, L.貝爾, C.彭托皮丹, I.達馬杰, C.安德森, A.斯文德森 申請人:諾維信公司