包含牛乳中存在的可溶性寡糖級分并具有低單糖水平的用于嬰兒配方產(chǎn)品的牛乳寡糖 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了易于噴霧干燥的得自牛乳的寡糖混合物，其包含(a)與存在于牛乳中的可溶性寡糖相同的可溶性寡糖群和(b)通過β-半乳糖苷酶作用于乳糖和牛乳寡糖而形成的β-低聚半乳糖。該混合物的總單糖含量低于5%w/v并且乳糖:寡糖比低于20。還公開了獲得所述混合物的方法，該方法包括納濾步驟。還公開了包含所述寡糖混合物的營養(yǎng)組合物，尤其是嬰兒配方產(chǎn)品。
【專利說明】包含牛乳中存在的可溶性寡糖級分并具有低單糖水平的用
于嬰兒配方產(chǎn)品的牛乳寡糖-低聚半乳糖組合物以及生產(chǎn)
該組合物的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及得自牛乳的寡糖混合物以及包含所述寡糖(OS)混合物的食品、特別是嬰兒配方產(chǎn)品，以及生產(chǎn)所述寡糖混合物的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]人類的結(jié)腸留駐有多種細(xì)菌，所述細(xì)菌對消化道生理具有正面和負(fù)面的雙重作用，并且具有其它系統(tǒng)性的影響。結(jié)腸中所發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌的優(yōu)勢類群包括擬桿菌屬(Bacteroides)物種，尤其是雙歧桿菌屬(Bifidobacteria)、真細(xì)菌屬(Eubacteria)、梭菌屬(Clostridia)和乳桿菌屬(Lactobacilli)。這些細(xì)菌響應(yīng)于結(jié)腸中的底物可用性、氧化還原電位、pH、02張力及其分布而具有變化的活性。通常，腸內(nèi)的細(xì)菌可分為對其宿主發(fā)揮潛在危害作用或有益作用的物種。致病作用(其可能由例如梭菌屬或擬桿菌屬引起)包括腹瀉、感染、肝臟損害、致癌作用和腸腐爛。健康促進(jìn)作用可通過有害細(xì)菌的生長抑制、免疫功能的刺激、增強(qiáng)必需營養(yǎng)成分的消化和吸收以及維生素的合成而引起?？删哂薪】荡龠M(jìn)作用的細(xì)菌類群(例如雙歧桿菌屬和乳桿菌屬)在數(shù)量和/或活性上的增加是合乎需要的。對其宿主具有有益作用的“好的細(xì)菌”被稱為“益生菌”。益生菌包括多種類型的細(xì)菌，但通常選自四類細(xì)菌:嗜酸乳桿菌(Lactobacilllus acidophilus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacteria)、乳球菌屬(Lactococcus)和片球菌屬(Pediococcus)。
[0004]與益生菌例如乳桿菌或雙歧桿菌有關(guān)的健康益處包括全身細(xì)胞免疫應(yīng)答的增強(qiáng)，例如，增強(qiáng)的抗體生成和白細(xì)胞吞噬(吞食或殺傷)活性。某些益生菌菌株與增強(qiáng)免疫系統(tǒng)從而預(yù)防感染或減輕感染程度有關(guān)。某些益生菌與預(yù)防過敏以及降低過敏嚴(yán)重程度有關(guān)。某些菌株據(jù)稱可以有效改善腸疾病、特別是腹瀉。
[0005]對于嬰兒這一特殊情況，在臨出生前，嬰兒的胃腸道被認(rèn)為是無菌的。在出生的過程中，其遭遇來自母親的消化道和皮膚的細(xì)菌并開始駐留有細(xì)菌。響應(yīng)于嬰兒的喂養(yǎng)情況，在消化道微生物群的組成方面存在很大差異。母乳喂養(yǎng)的嬰兒的糞便菌叢包含可觀數(shù)量的雙歧桿菌群并含有一些乳桿菌屬，而配方奶喂養(yǎng)的嬰兒具有更為復(fù)雜的微生物群，通常存在雙歧桿菌屬和擬桿菌屬、梭菌屬和鏈球菌屬。斷奶后，開始建立與成人消化道微生物群分布相類似的微生物群分布。
[0006]對于所有的嬰兒均建議使用母乳。但是，在一些情況下，出于醫(yī)學(xué)原因，或者由于母親選擇不用母乳喂養(yǎng)，母乳喂養(yǎng)是不充分或不成功的。針對這些情況開發(fā)了嬰兒配方產(chǎn)品O [0007]為了建立與母乳喂養(yǎng)的嬰兒類似的健康的腸道菌群，可能需要在嬰兒配方產(chǎn)品中添加益生菌。目前用于嬰兒配方產(chǎn)品的益生菌的例子包括可以得自芬蘭的Valio Oy的商標(biāo)名為LGG的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)ATCC53103、鼠李糖乳桿菌 CGMCC1.3724、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)CNCM 1-2116、由 BioGaiaA.B以商標(biāo)名Reuteri銷售的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)CNCM 1-1225、由新西蘭的 BLIS Technologies Limited以標(biāo)號KI2銷售的唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius) DSM13084、由丹麥的Christian Hansen公司以商標(biāo)名Bbl2銷售的乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)CNCM1-3446、由日本的 Morinaga Milk Industry C0.Ltd.以商標(biāo)名 BB536 銷售的長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)ATCC BAA-999、由 Danisco 以商標(biāo)名 Bb_03 銷售的短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、由Morinaga以商標(biāo)名M-16V銷售的短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、由 Procter&Gamble C0.以商標(biāo)名 Bifantis 銷售的嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)和由 Institut Rosell (Lallemand)以商標(biāo)名 R0070 銷售的短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)。
[0008]為了健康地維持腸道微生物群，可將這些益生菌以每天約10億至約200億菌落形成單位(CFU)的量施用，優(yōu)選每天施用約50億至約100億活菌。
[0009]影響健康腸道菌群的另一個因素是腸道中益生元的存在。益生元是一種不能消化的食品成分，其選擇性地刺激結(jié)腸中益生菌的生長和/或活性，從而增進(jìn)宿主健康。益生元是不能消化的意思是指，其在胃或小腸中不能被分解和吸收，從而可以完整的通過并到達(dá)結(jié)腸并在此處選擇性地由有益細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵。益生元的實(shí)例包括某些寡糖，例如低聚果糖(FOS)和低聚半乳糖(GOS)。
[0010]已知人乳比大多數(shù)其它動物乳含有更大量的不能消化的寡糖。事實(shí)上，不能消化的寡糖代表了母乳中第三大固體成分(次于乳糖和脂質(zhì))，其在初乳中存在的濃度是12-15g/l，在成熟乳汁中為5-8g/l。人乳寡糖(HMO)高度耐受酶水解，表明這些寡糖可以顯示出與其熱值不直接相關(guān)的重要功能。
[0011]因此，益生元與益生菌協(xié)同性地起作用，為嬰兒提供重要的健康益處。益生元不僅選擇性地促進(jìn)添加到嬰兒配方產(chǎn)品中的益生菌的生長，而且還可促進(jìn)能夠與添加的益生菌協(xié)同起作用的內(nèi)源性益生菌的生長。
[0012]因此，益生元的存在可以增強(qiáng)由以上所述的益生菌所提供的健康益處。因此，隨著對人乳組成的了解的增加，已經(jīng)建議將益生元添加到嬰兒配方產(chǎn)品中。這些益生元通常以足以正性刺激消化道中的健康菌群并引起這些“好的”細(xì)菌繁殖的量施用。常用量為每次約I至約10克，或推薦的嬰兒每日膳食纖維的約5%至約40%。
[0013]因此，可以購買到各種添加了益生元例如低聚果糖和低聚半乳糖的混合物的嬰兒
配方產(chǎn)品。
[0014]但是，此類混合物僅提供近似人乳中存在的寡糖混合物。在人乳中已經(jīng)檢測到100種以上不同的寡糖成分，其中一些在動物乳如牛乳中尚未檢測到或僅檢測到少量。一些唾液酸化的寡糖和巖藻糖基化的寡糖存在于牛乳和初乳中，但是僅以非常小的量存在。
[0015]EP0975235B1描述了包含一種或多種人乳寡糖的合成營養(yǎng)組合物，其中組合物中的HMO選自一組8種HM0(3-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-巖藻五糖(fucopentaose) II1、乳糖-N-巖藻五糖I1、二巖藻糖基乳糖、2’-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-巖藻五糖1、乳糖-N-新四糖(neotetraose)和乳糖-N-巖藻五糖V)，該歐洲專利指出，一般而言，寡糖保護(hù)嬰兒免受呼吸道、胃腸道以及泌尿生殖道的病毒和細(xì)菌感染。
[0016]美國專利申請2003/0129278記載了基于由一種或多種動物乳生產(chǎn)的寡糖的寡糖混合物，其特征在于其包含至少兩種寡糖級分，所述寡糖級分均由至少兩種不同的寡糖組成。寡糖混合物中的寡糖組成不同于提取出該寡糖級分的動物乳或動物乳混合物。
[0017]EP0458358涉及生產(chǎn)包含10_15%重量的低聚半乳糖的脫脂奶粉的方法，該方法包括:
[0018](i)濃縮脫脂乳以獲得固體含量為20-50%重量的濃縮乳，
[0019](ii)向濃縮乳中加入半乳糖苷酶以引發(fā)酶反應(yīng)，
[0020](iii)將形成的混合物加熱至70_85°C達(dá)30秒至15分鐘以終止酶反應(yīng)，并且
[0021](iv)將反應(yīng)已終止的混合物噴霧干燥。
[0022]在本發(fā)明人的申請W02006/087391中，公開了得自動物乳的寡糖混合物以及生產(chǎn)所述寡糖混合物的方法。該寡糖混合物可有效地作為益生元，特別是在人的消化道中，并且其寡糖圖譜比低聚果糖和低聚半乳糖混合物更接近人乳。
[0023]為了開發(fā)益生元嬰兒配方產(chǎn)品，希望提供其寡糖圖譜與源乳的寡糖圖譜盡可能接近的(至少從定性方面是盡可能接近的)寡糖混合物。寡糖的相對量可以變化。這意味著寡糖混合物應(yīng)含有乳中存在的全部寡糖可溶性級分?！翱扇苄约壏帧笔侵冈谌橹锌扇艿乃胁煌墓烟恰２煌目扇苄怨烟窃谠慈橹械南鄬α繜o需在寡糖混合物中保留。
[0024]此外，希望保持低的乳糖/寡糖比例，以避免引入不需要的、高含量的乳糖，并且降低為獲得嬰兒配方產(chǎn)品所需的寡糖水平而額外添加的OS的量。此外，寡糖混合物的蛋白含量應(yīng)當(dāng)非常低，從而不會顯著影響嬰兒配方產(chǎn)品的氨基酸組成。
[0025]本發(fā)明的一個目的是提供一種寡糖混合物，其可有效地作為益生元，特別是在人消化道中，并且其寡糖圖譜比低聚果糖和低聚半乳糖混合物更接近人乳，并且單糖的濃度非常低。因此，本發(fā)明的目的是提供一種包含用于制備寡糖混合物的乳中所存在的寡糖可溶性級分的寡糖混合物。在本發(fā)明的上下文中，“得自牛乳的寡糖混合物”是指從牛乳獲得的寡糖。因此，存在于原乳中的不同的可溶性寡糖也存在于本發(fā)明的最終的寡糖混合物中，盡管它們的比例不一定相同。
[0026]本發(fā)明的另一個目的是提供具有相對高的寡糖濃度(通常為20-50%w/w)的寡糖混合物。
[0027]需要有助于保護(hù)正常的免疫或炎癥狀態(tài)或減弱或減輕食物過敏的影響的食品，特別是用于幼兒、嬰兒和/或新生兒的食品。
[0028]需要提供可有效地作為益生元、特別是在人消化道中作為益生元的食品。
[0029]需要能夠提供上述益處并且保持個體中平衡的正常代謝的食品。
[0030]需要通過適用于脆弱的個體例如嬰幼兒的非藥物干預(yù)來改善人消化道的狀態(tài)。
[0031]需要能夠提供對變態(tài)反應(yīng)原口服耐受的食品。
[0032]需要蛋白含量非常低的乳寡糖成分，其可以以糖漿或粉末的形式加入到嬰兒配方產(chǎn)品中而無需任何載體。
[0033]發(fā)明概述
[0034]本發(fā)明涉及得自牛乳的寡糖混合物，其包含
[0035]a.包含存在于牛乳中的可溶性寡糖級分(牛乳寡糖或CMOS)的可溶性寡糖群；
[0036]b.通過β -半乳糖苷酶作用于牛乳寡糖中存在的乳糖以及任選地作用于其它牛乳寡糖而形成的低聚半乳糖，
[0037]該混合物的總的單糖含量低于5%w/v，優(yōu)選低于3%，并且乳糖:總寡糖比低于10，優(yōu)選低于3。
[0038]該混合物具有如下單糖、二糖和寡糖組成，以干物質(zhì)百分比表示:
[0039]c.乳糖 30-60%
[0040]d.葡萄糖 0.5-2.5%
[0041]e.半乳糖 0.5-2.5%
[0042]f.寡糖和β -低聚半乳糖20-50%
[0043]g.唾液酸基乳糖0.2_2%。
[0044]本發(fā)明的另一方面是生產(chǎn)OS混合物的方法。其步驟包括
[0045]a)濃縮去蛋白的牛乳原料至50-75%總固體(TS);
[0046]b)將濃縮的牛乳原料進(jìn)行去除乳糖的步驟以制備乳糖:寡糖比低于100的液體；
[0047]c)任選地澄清所述的液體；
[0048]d)將任選澄清的液體用β -半乳糖苷酶處理以制備包含β -低聚半乳糖的液體；
[0049]e)任選地通過例如將液體通過弱陽離子柱和任選的混合床柱和/或陰離子交換柱進(jìn)行脫鹽；
[0050]f)進(jìn)行納濾步驟，其可在任選的脫鹽步驟之前或之后進(jìn)行，但必需在用
[0051]β -半乳糖苷酶處理之后或處理的同時進(jìn)行。
[0052]另一方面，本發(fā)明提供了可通過本發(fā)明的方法獲得的產(chǎn)品。
[0053]本發(fā)明的OS混合物具有有利的特性。當(dāng)所述混合物的水分含量為2.5%時，其玻璃轉(zhuǎn)化溫度(Tg)在70-85°C的范圍內(nèi)。該物理特性使得該混合物在不存在載體的情況下易于噴霧干燥而不會結(jié)塊或發(fā)粘。此外，與未經(jīng)納濾的含GOS的OS混合物相比，本發(fā)明的OS混合物不太傾向于發(fā)生美拉德反應(yīng)。在該水分含量下的相對高的Tg提供了在存放期間的更好的物理穩(wěn)定性。
[0054]本發(fā)明的OS混合物可以摻入到營養(yǎng)組合物中，例如一階段嬰兒配方產(chǎn)品、嬰兒配方產(chǎn)品、幼兒食品、嬰兒谷物組合物、后續(xù)配方食品或成長乳，優(yōu)選一階段嬰兒配方產(chǎn)品。
[0055]因此，所述營養(yǎng)組合物是本發(fā)明的一個目的。
[0056]本發(fā)明的另一個目的是包含本發(fā)明的OS混合物的營養(yǎng)組合物用于增強(qiáng)免疫保護(hù)和/或降低感染的風(fēng)險(xiǎn)和/或降低食物過敏的發(fā)生以及相關(guān)的食品過敏對健康的影響的用途。
[0057]附圖概沭
[0058]圖1:在實(shí)施例1的方法過程中的三個點(diǎn)的牛乳寡糖(CMOS)和牛乳寡糖/ β -低聚半乳糖(CMOS-GOS)混合物中的總可溶性寡糖級分通過HPLC測定。HPLC色譜圖對應(yīng)于從如下樣品獲得的數(shù)據(jù):(I)通過結(jié)晶除去部分乳糖并且脫鹽了的OS粉，(2)通過用β-半乳糖苷酶水解產(chǎn)生GOS而生成的OS-GOS，和(3)經(jīng)納濾的OS-GOS (相當(dāng)于實(shí)施例2的Nano0S-G0S)。因此，可以在相同的圖示比例上近似地讀取色譜圖，樣品(2)0S-G0S和(3)經(jīng)納濾的OS-GOS分別稀釋20和10倍。
[0059]圖2:測定含30%麥芽糊精載體的CMOS-GOS (黑色)、含30%乳糖的CM0S-G0S (虛線)和本發(fā)明的經(jīng)納濾的CMOS-GOS混合物(灰色)粉末的玻璃轉(zhuǎn)化溫度(Tg)。樣品的水分含量用卡爾-費(fèi)休法測定。由于在不添加載體的情況下無法將樣品干燥至所需的濕度水平，因此無法獲得不含載體的CMOS-GOS的玻璃轉(zhuǎn)化溫度。但是，數(shù)據(jù)似乎顯示，在不含載體的情況下，未經(jīng)納濾的CMOS-GOS的Tg值為大約35-40°C。Tg測量通過差示掃描量熱法(DSC)進(jìn)行。
[0060]圖3:測定了在表2中詳細(xì)描述的三種嬰兒配方產(chǎn)品的封閉賴氨酸(由美拉德反應(yīng)引起)的百分比。測定在噴霧干燥之前(灰色)以及之后(黑色)進(jìn)行。噴霧干燥于92°C進(jìn)行。在圖中，柱“CMOS Vivinal”表示在其中添加了未經(jīng)納濾的GOS級分(Vivinal?G0S,來自FrieslandCampina)和未經(jīng)納濾的CMOS級分(參見表2)的液體濃縮物(灰色)和粉末(黑色)嬰兒配方產(chǎn)品的數(shù)據(jù)。柱“Nano-CMOS-GOS濕法添加”表示以濕混合物的形式向其中添加了本發(fā)明的經(jīng)納濾的CM0S-G0S混合物的嬰兒配方產(chǎn)品的數(shù)據(jù)(液體濃縮物和粉末)。柱“Nano-CMOS-GOS干法添加”表示以干粉形式向其中添加了本發(fā)明的經(jīng)納濾的CM0S-G0S混合物的嬰兒配方產(chǎn)品的數(shù)據(jù)。
[0061]發(fā)明詳述
[0062]定義:
[0063]本文使用的下列術(shù)語具有如下含義。
[0064]術(shù)語“嬰兒”是指年齡在12個月以下的兒童。
[0065]術(shù)語“幼兒”是指年齡在I至3歲的兒童。
[0066]術(shù)語“嬰兒配方產(chǎn)品”意指預(yù)期用于在生命前四個至六個月期間的嬰兒的特定營養(yǎng)用途、且本身滿足此類人的營養(yǎng)要求的食品(2006年12月22日關(guān)于嬰兒配方產(chǎn)品及后續(xù)配方產(chǎn)品的歐洲委員會指令(European Commission Directive) 2006/141/EC第2條)。
[0067]術(shù)語“后續(xù)配方產(chǎn)品”意指預(yù)期用于年齡超過四個月的嬰兒的特定營養(yǎng)用途、且構(gòu)成此類人的逐漸多樣化飲食的主要液體元素的食品。
[0068]術(shù)語“一階段嬰兒配方產(chǎn)品”意指預(yù)期用于在生命前四個月期間的嬰兒的特定營養(yǎng)用途的食品。
[0069]術(shù)語“幼兒食物”意指預(yù)期用于嬰兒在生命最初幾年期間的特定營養(yǎng)用途的食品。
[0070]術(shù)語“嬰兒谷類組合物”意指預(yù)期用于嬰兒在生命最初幾年期間的特定營養(yǎng)用途的食品。
[0071]術(shù)語“成長乳”意指適合年幼兒童特定營養(yǎng)需要的乳基飲料。
[0072]術(shù)語“增強(qiáng)對變態(tài)反應(yīng)原的口服耐受”意指當(dāng)口服時降低對變態(tài)反應(yīng)原的敏感性。
[0073]術(shù)語“營養(yǎng)組合物”意指向個體提供營養(yǎng)的組合物。該營養(yǎng)組合物通常經(jīng)口服或靜脈內(nèi)服用，并且其通常包括脂質(zhì)或脂肪源以及蛋白質(zhì)源。
[0074]術(shù)語“合成組合物”意指通過化學(xué)和/或生物(例如酶)方式獲得的組合物，其化學(xué)上與哺乳動物乳中天然存在的混合物相同。
[0075]術(shù)語“低變應(yīng)原性組合物”意指不太可能引起變態(tài)反應(yīng)的組合物。
[0076]術(shù)語“寡糖”意指含有少量(通常是2至10個)組成單糖的糖聚合物。
[0077]術(shù)語“唾液酸化的寡糖”意指具有唾液酸殘基的寡糖。
[0078]術(shù)語“益生元”意指不可消化的碳水化合物，其通過選擇性地刺激人結(jié)腸中健康的細(xì)菌如雙歧桿菌屬的生長和/或活性來有益地影響宿主(Gibson GR, RoberfroidMB.Dietary modulation of the human colonic microbiota:1ntroducing the conceptof prebiotics.J Nutr.1995;125:1401-12) 0
[0079]術(shù)語“益生菌”意指對宿主健康或保持良好狀態(tài)具有有益作用的微生物細(xì)胞制劑或微生物細(xì)胞組分。(Salminen S，Ouwehand A.Benno Y.等“Probiotics:how should theybe defined” Trends Food Sc1.Technol.1999:10107-10)。
[0080]“變態(tài)反應(yīng)”是已由醫(yī)師檢測到并可以以不定期或以更持久的方式治療的變態(tài)反應(yīng)?！笆澄镒儜B(tài)反應(yīng)”是對營養(yǎng)組合物的變態(tài)反應(yīng)。
[0081]術(shù)語“寡糖圖譜”表示寡糖組成的特性。
[0082]除非另有說明，所有百分比均以重量計(jì)。
[0083]宴糖:
[0084]寡糖(OS)在此定義為那些在動物乳中天然存在的并且聚合度(DP)在3至20范圍內(nèi)的寡糖。這些寡糖可溶于乳中。若無相反說明，在本文中所有其它對寡糖的提及均指(在乳中)可溶的寡糖。本發(fā)明提供了得自牛乳的寡糖混合物，其中混合物的乳糖(DP=2):寡糖比低于20，更優(yōu)選低于10，優(yōu)選在8至1.25之間。這相當(dāng)于寡糖混合物中的乳糖含量比原始牛乳中降低了 4至200倍，其等于寡糖和乳糖之間的比增加了 4至200倍。因此，該混合物具有與用于制備該混合物的乳(即，該混合物源于該乳)中的寡糖圖譜(即，總可溶性寡糖級分)相同的寡糖圖譜，但寡糖的濃縮程度更高。
[0085]本發(fā)明的寡糖混合物還包含β -低聚半乳糖(GOS)，其是在β -半乳糖苷酶的作用下生成的，所述β_半乳糖苷酶主要作用于乳糖，并且也任選地作用于一些牛乳中存在的可溶性寡糖(牛乳寡糖，或CM0S)，但程度小得多。因此，在一個實(shí)施方案中，低聚半乳糖是由β_半乳糖苷酶作用于乳糖和牛乳寡糖所生成的。將酶在生產(chǎn)寡糖混合物的過程中加入。酶對CMOS作用的確切程度或者說作用到了什么程度，本發(fā)明人沒有測定。因此，本發(fā)明的寡糖混合物中不同寡糖的相對比例可能與用于制備混合物的牛乳中的不同。β-半乳糖苷酶具有雙重活性:一，將乳糖降解成單糖，即半乳糖和葡萄糖，以及，第二，通過轉(zhuǎn)移酶活性，催化隨后的低聚半乳糖(GOS)的形成。這些寡糖由葡萄糖和半乳糖單體組成，DP為3至10，并且已知具有益生元活性。
[0086]在本發(fā)明的寡糖混合物中存在超過20種不同的GOS結(jié)構(gòu)。
[0087]寡糖圖譜可以通過HPLC、質(zhì)譜和其它方法來表征。根據(jù)一種優(yōu)選的HPLC方法，將樣品中存在的寡糖提取到70°C的水中。將提取的OS通過與2-氨基苯甲酸反應(yīng)(65°C下2小時)形成希夫堿進(jìn)行熒光標(biāo)記。然后通過與氰基硼氫化鈉反應(yīng)將雙鍵還原得到穩(wěn)定的寡糖氨基benzide (OS-AB)衍生物。將標(biāo)記的提取物用乙腈稀釋，然后注射到安裝有捕集柱的HPLC-熒光儀上。在Amide-803 μ m, 4.6x150mm柱上進(jìn)行分離，標(biāo)記的OS在熒光計(jì)上在如下條件下檢測:Ex330nm，Em420nm。不同OS的定量通過校準(zhǔn)0S-2AB與麥芽三糖外標(biāo)的響應(yīng)來進(jìn)行，用昆布三糖作為內(nèi)標(biāo)。
[0088]圖1顯示在實(shí)施例1的生產(chǎn)OS混合物的三個連續(xù)步驟的混合物中通過上述HPLC方法測定的總可溶性寡糖級分:(I)通過結(jié)晶除去部分乳糖并脫鹽了的CMOS、(2)通過用β -半乳糖苷酶水解產(chǎn)生GOS后和(3)經(jīng)納濾后(相當(dāng)于實(shí)施例2的Nano CM0S-G0S)。其為寡糖圖譜。因此，可以在相同的圖示比例上近似地讀取三個色譜圖，樣品(2)CM0S-G0S和
(3)經(jīng)納濾的CM0S-G0S分別稀釋20和10倍。
[0089]從HPLC數(shù)據(jù)確定的寡糖的列表如表I所示。沒有鑒定全部的寡糖，但三張圖譜的圖形非常類似。這證實(shí)原始牛乳中的CMOS種群確實(shí)存在于本發(fā)明的OS混合物中。發(fā)明人注意到3’ SL峰(相當(dāng)于唾液酸基寡糖3’唾液酸基乳糖)主要在圖譜(I)中可見，在圖譜(2)和(3)中不可見。確信在CMOS的β-半乳糖苷酶水解步驟中，所生成的GOS之一的保留時間與3’ SL的非常接近，因此干擾了 3’ SL峰的分離。發(fā)明人證實(shí)，在32.29分鐘(I)和32.20分鐘(2)的峰不是3’ SL，而是代表了 GOS結(jié)構(gòu)(數(shù)據(jù)未示出)。
[0090]由于對CMOS-GOS樣品的稀釋，圖譜(I)中的與唾液酸基寡糖6’L(Neu5Ac ( α 2-6)Gal(^ 1-4)Glc)有關(guān)的峰在圖譜(2)中不再能夠觀察到。
[0091]表1
【權(quán)利要求】
1.得自牛乳的寡糖混合物，其包含 a.包含存在于牛乳中的可溶性寡糖級分的可溶性寡糖群； b.通過β_半乳糖苷酶作用于牛乳寡糖中存在的乳糖而形成的β_低聚半乳糖， 該混合物的總的單糖含量低于5%w/v，并且乳糖:總寡糖比低于10。
2.權(quán)利要求1所述的寡糖混合物，其中該混合物的總的單糖含量低于3%w/v。
3.權(quán)利要求1或2所述的寡糖混合物，其中該混合物的乳糖:總寡糖比低于3。
4.權(quán)利要求1、2或3任意一項(xiàng)所述的寡糖混合物，其中該混合物具有如下單糖、二糖和寡糖組成，以干物質(zhì)百分比表示: a.乳糖30-60% b.葡萄糖0.5-2.5% c.半乳糖0.5-2.5% d.寡糖和β-低聚半乳糖20-50% e.唾液酸基乳糖0.2-2%。
5.權(quán)利要求1-3任 意一項(xiàng)所述的寡糖混合物，其中當(dāng)所述混合物的水分含量為2.5%時，該混合物的玻璃轉(zhuǎn)化溫度(Tg)在70-85°C的范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的寡糖混合物，其特征在于其為粉末的形式并且還包含低于5%的載體分子。
7.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的寡糖混合物，其特征在于其為濃縮糖漿的形式，其具有60-85%的總固體(TS)，優(yōu)選大于74%TS。
8.包含前述權(quán)利要求任意一項(xiàng)所述的寡糖混合物的營養(yǎng)組合物。
9.權(quán)利要求9所述的營養(yǎng)組合物，其進(jìn)一步包含益生菌，優(yōu)選其中所述寡糖混合物促進(jìn)所述益生菌在消化道或腸道中的生長或繁殖。
10.權(quán)利要求8或9所述的營養(yǎng)組合物，其是一階段嬰兒配方產(chǎn)品、嬰兒配方產(chǎn)品、幼兒食品、嬰兒谷物組合物、后續(xù)配方食品或成長乳，優(yōu)選一階段嬰兒配方產(chǎn)品。
11.權(quán)利要求8、9或10所述的營養(yǎng)組合物用于增強(qiáng)免疫保護(hù)和/或降低感染的風(fēng)險(xiǎn)和/或降低食物過敏的發(fā)生以及相關(guān)的食品過敏對健康的影響的用途。
12.生產(chǎn)得自牛乳的寡糖混合物的方法，其包括如下步驟 a)濃縮去蛋白的牛乳原料至50-75%總固體(TS); b)將濃縮的牛乳原料進(jìn)行去除乳糖的步驟以制備乳糖:寡糖比低于100的液體； c)任選地澄清所述的液體； d)將任選澄清的液體用β_半乳糖苷酶處理以制備包含β_低聚半乳糖的液體； e)任選地通過例如將液體通過弱陽離子柱和任選的混合床柱和/或陰離子交換柱進(jìn)行脫鹽； f)進(jìn)行納濾步驟，其可在任選的脫鹽步驟之前或之后進(jìn)行，但必需在用β_半乳糖苷酶處理之后或處理的同時進(jìn)行。
13.權(quán)利要求12的方法，其中步驟b)包括乳糖結(jié)晶步驟和去除乳糖結(jié)晶并制得乳糖:寡糖比低于100的液體的濃縮步驟，如果需要，這些步驟反復(fù)進(jìn)行。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中對步驟a)至f)進(jìn)行適應(yīng)性修改以獲得總單糖含量低于5%w/v，優(yōu)選低于3%w/v并且乳糖:寡糖比低于20，優(yōu)選低于10的混合物。
15.權(quán)利要求12至14任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法適于獲得權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)所述的混合物。
16.權(quán)利要求12至15任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述去蛋白的牛乳原料是乳超濾滲透液或乳清超濾滲透液。
17.權(quán)利要求12至17任意一項(xiàng)所述的方法，其中所用的β_半乳糖苷酶得自米曲霉。
18.權(quán)利要求12至18任意一項(xiàng)所述的方法，其中的納濾步驟與1-5個滲濾步驟相組八口 ο
19.權(quán)利要求12至19任意一項(xiàng)所述的方法，還包括將液體產(chǎn)物噴霧干燥以得到粉末的步驟。
20.權(quán)利要求20所述的方法，其中在噴霧干燥步驟中向混合物中添加低于5%的載體，優(yōu)選0%的載體。
21.可通過權(quán)利要求12至 20任意一項(xiàng)所述的方法獲得的產(chǎn)品。
【文檔編號】A23L1/29GK103547173SQ201280024197
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月24日
【發(fā)明者】R·貝羅卡爾, M·布勞恩, A·塞瓦略斯, V·瑪麗, G·里卡德 申請人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司