專利名稱：分泌samhd1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株、由該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單克隆抗體及應(yīng)用，特別涉及一株能夠穩(wěn)定分泌抗人SAMHDl蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，及其分泌產(chǎn)生的單克隆抗體及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
SAMHDl蛋白是一種鼠Y干擾素誘導(dǎo)基因Mgll的類似物，最近被鑒定為人免疫缺陷病毒(HIV-1)的限制性因子，具有脫氧核苷三磷酸水解酶的功能，在樹突狀細(xì)胞和其他髓系細(xì)胞中能阻礙病毒的早期復(fù)制，是慢病毒蛋白Vpx的靶目標(biāo)，其能解除HIV-1的感染限制作用。SAMHDl同時(shí)也與AGS綜合征相關(guān)，SAMHDl的突變能引起AGS，AGS為一種炎性腦病，以慢性腦脊髓炎流質(zhì)淋巴細(xì)胞增多癥為特點(diǎn)，能增高抗病毒因子IFN-a的水平。有研究發(fā)現(xiàn)，HIV-2和相關(guān)的免疫缺陷病毒(SIVsm/mac)能夠通過使用它們編碼的Vpx蛋白來降解SAMHD1，從而越過骨髓細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)機(jī)制，使人感染病毒。SAMHDl基因組全長約1878kb，它是巨噬細(xì)胞里的一個酶蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)SAMHDl降解了巨噬細(xì)胞內(nèi)的大部分脫氧核苷酸，而脫氧核苷酸是病毒復(fù)制所需的必要原料，從而抑制了病毒的反轉(zhuǎn)錄和病毒cDNA的形成，使髓系細(xì)胞不感染HIV。如果我們能阻止艾滋病毒在這些細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，就可以抑制艾滋病在其他細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，這樣就能夠防止艾滋病的發(fā)生。本研究構(gòu)建了 SAMHDl基因的重組質(zhì)粒，表達(dá)并純化出了具有很好反應(yīng)原性的可溶性融合蛋白，對于SAMHDl單克隆抗體的制備及其磷酸水解酶實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以人血漿中淋巴細(xì)胞提取的RNA為基礎(chǔ)，通過RT-PCR方法，擴(kuò)增出SAMHDl基因并克隆至PMD-18T載體。測序鑒定正確后，通過雙酶切將SAMHDl基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET-30a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-SAMHDl并轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)。通過對表達(dá)條件的優(yōu)化，最終獲得分子質(zhì)量約79kDa、可溶性形式的重組蛋白SAMHD1，并采用鎳柱對該蛋白進(jìn)行純化。Western blot檢測結(jié)果表明，純化的SAMHDl蛋白能與Abcam公司的SAMHDl抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表明其具有良好的抗原性。將純化的人SAMHDl作為免疫原，腹腔接種4周齡BALB/c小鼠。按照常規(guī)雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)將免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0融合。用鎳柱純化的SAMHDl為篩選抗原，建立間接ELISA方法，篩選出針對SAMHDl單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，最終獲得一株能夠穩(wěn)定分泌SAMHDl單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3C3，分類命名為抗人SAMHDl單克隆抗體3C3雜交瘤細(xì)胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCC NO. 6709，保藏日期為2012年10月29日。
Western blot和間接免疫突光結(jié)果表明此株雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體能特異性識別真核表達(dá)的人重組蛋白SAMHD1，而與His標(biāo)簽蛋白以及馬、猴真核表達(dá)的重組蛋白SAMHDl均不發(fā)生反應(yīng)。因此，進(jìn)一步的本發(fā)明還提出了由所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗人SAMHDl蛋白的單克隆抗體，及所述的單克隆抗體在制備檢測人SAMHDl蛋白試劑中的應(yīng)用。


圖1為PCR擴(kuò)增結(jié)果；M DL2000DNA Marker ；1.目的片段的PCR產(chǎn)物；2.陰性對照。圖2為重組質(zhì)粒pET30a_SAMHDl的雙酶切鑒定；

M I DL2000DNA Marker ；2. pET30a — SAMHDl 的 BamH I 和 Not I 酶切結(jié)果；M2 DL15000DNA Marker ；圖3為重組蛋白的SDS-PAGE分析；M、蛋白質(zhì)Marker ;1、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)17h的全菌；2、裂解后的上清；3、裂解后的沉淀；圖4為純化重組蛋白的SDS-PAGE分析；M、蛋白質(zhì)Marker ;1、純化后的上清；圖5為重組蛋白SAMHDl的western-blot分析；M :蛋白質(zhì)Marker ；1 :純化后的重組蛋白；2 pET32a/Rosetta(0E3)對照圖6 為 MAb 的 western blot 鑒定；Μ、蛋白質(zhì) Markerl、SAMHDl 的真核表達(dá)蛋白 2、pET30a/Rosetta(0Ε3)對照；圖7為MAb的間接免疫熒光鑒定結(jié)果；1、3C3 ;2、Negative control :SP2/0 上清。圖8為MAb的特異性分析。M、蛋白質(zhì)Marker ;1、人SAMHDl的真核表達(dá)蛋白；2、猴SAMHDl的真核表達(dá)蛋白；3、馬SAMHDl的真核表達(dá)蛋白；4、293T細(xì)胞空白對照；5、馬皮細(xì)胞；6、兔腎細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1抗人SAMHDl蛋白單克隆抗體的制備及單抗特異性分析I材料與方法1.1菌株、載體ΗΒ101感受態(tài)細(xì)胞、Rosetta(DE3)、克隆載體pMD18-T、表達(dá)載體pET30a(+)(哈爾濱獸醫(yī)研究所馬病研究組保存)。1. 2主要試劑RNA提取試劑盒、膠回收(小量)試劑盒，購自上海華舜生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，購自O(shè)MEGA公司；DL — 15000、DL — 2000Marker、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、限制性內(nèi)切酶(BamH1、Not I)、Ex Taq 酶、dNTP mixture、T4DNA 連接酶、異丙基一β — D —硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、氨芐西林、卡那霉素(kan)，均購自寶生物工程(大連)有限公司；羊抗鼠二抗(IRD-1gG)，SAMHDl抗體購自Abcam公司。SAMHDl和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由本發(fā)明發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室保存；BALB/C小鼠購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。HAT選擇性培養(yǎng)基、HT選擇性培養(yǎng)基、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FICA)、IRD標(biāo)記的羊抗鼠IgG(IRD-1gG)、羊抗鼠熒光二抗(FITC-1gG)、PEG-4000均購自Sigma公司；DAB顯色液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Hi TrapProteinG HP購自GE公司。SBAClonotypingTM System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒購于Southern Biotechnology公司。1. 3引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank上發(fā)表的SAMHDl基因序列設(shè)計(jì)一對引物，上游引物引入BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物引入Not I酶切位點(diǎn)(下劃線部分)。上游引物Homo BamHlsqSAMHDlF :5’ 一CCA AGGATCCAT GCAGCGAGCCGATTCC — 3’ ；下游引物 Homo. Notl. sqSAMHDl. R :5’ — CCAAGCGGCCGCCATTGGGTCATCTTTAAAAAGC 一 3’。引物由上海博士生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1. 4目的基因的RT-PCR擴(kuò)增采人血20ml，加入肝素鈉抗凝，用O. OlM的PBS按1:1的比例稀釋，將其加入預(yù)先裝有15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管內(nèi)，采用梯度離心法以IOOOg的轉(zhuǎn)速分離單個核細(xì)胞，將中層的單個核細(xì)胞按照小量RNA抽提試劑盒說明提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以其為模板，擴(kuò)增 SAMHDl 基因片段(95°C 5min ；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C1. 5min30s，30 個循環(huán)后，72°C延伸lOmin)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1. 5原核表達(dá)載體PET-SAMHD1的構(gòu)建與鑒定將SAMHDl基因的PCR產(chǎn)物膠回收后克隆入pET_30a ( + )載體，轉(zhuǎn)化HBlOl感受態(tài)細(xì)胞，可疑菌落經(jīng)PCR和雙酶切鑒定正確后送往Invitrogen公司測序。測序正確的陽性質(zhì)粒與pET-30a ( + )載體分別用BamHI + NotI雙酶切，再經(jīng)膠回收、T4DNA連接酶連接、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)。挑取可疑陽性菌落，經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定后，抽提陽性質(zhì)粒，將其命名為pET30a-SAMHDl。1. 6SAMHD1基因的原核表達(dá)的最優(yōu)表達(dá)條件摸索與SDS-PAGE分析將重組質(zhì)粒pET30a_SAMHDl轉(zhuǎn)化表達(dá)感受態(tài)Rosetta (DE3)，挑取卡那抗性LB平板上的白色單菌落，接種于5ml含Kana +的LB培養(yǎng)液中37°C過夜培養(yǎng)。次日，將菌液按1:100比例接種于含K+的LB培養(yǎng)液中，37°C搖床振蕩培養(yǎng)至OD6tltlnm達(dá)到O. 4-0. 6時(shí)，進(jìn)行如下條件的摸索以確定蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件。1. 6.1誘導(dǎo)溫度和時(shí)間的確定當(dāng)轉(zhuǎn)化菌液的OD6tltlnm達(dá)到O. 4-0. 6時(shí)，加入終濃度為O. 2mM的IPTG，分別置于16°C、30°C和37°C搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為17h、8h和6h。取樣，4000rpm離心lOmin，棄上清，用原體積1/10的PBS重懸沉淀后超聲破碎。12000rpm離心20min，分別收集上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行重組蛋白SAMHDl可溶性分析。1. 6. 2IPTG誘導(dǎo)濃度的確定當(dāng)轉(zhuǎn)化菌液的0D600nm達(dá)到O. 4-0. 6時(shí)，分別以終濃度O. 2mM、0. 4mM、0. 6mM、0. 8mM和ImM的IPTG于16°C誘導(dǎo)表達(dá)16h。取樣，4000rpm離心IOmin,棄上清，同樣用原體積1/10的PBS重懸沉淀。進(jìn)行SDS-PAGE電泳以確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度。I · 7原核表達(dá)重組SAMHDI的純化根據(jù)N1-NTA His Bind Resin說明書進(jìn)行蛋白樣品、N1-NTA柱處理及蛋白樣品的純化，蛋白純化的整個操作過程中過柱溶液均靠重力自然沉降。1. 8原核表達(dá)重組蛋白SAMHDl的抗原性鑒定將純化的SAMHDl做SDS-PAGE電泳后進(jìn)行電轉(zhuǎn)印(15V電壓lh)。轉(zhuǎn)印后將硝酸纖維素膜用含5%脫脂奶粉的PBS封閉液4°C封閉過夜。PBST洗膜3遍，IOmin/次。以1:10000稀釋的Abcam的SAMHDl抗體作為一抗，室溫作用2h。PBST洗滌3次，再與1:10000倍稀釋的IRD標(biāo)記的羊抗鼠-1gG為二抗室溫作用lh，PBST洗滌3次，用成像儀掃描記錄結(jié)
果O1. 9動物免疫SAMHDl蛋白經(jīng)鎳柱純化后作為免疫原，與等體積的弗氏完全佐劑乳化，經(jīng)腹腔接種4周齡BALB/C小鼠，100 μ g /只。以后每間隔2周將免疫原與等體積的弗氏不完全佐劑乳化進(jìn)行免疫，共免疫3次。在三免后第7 10天尾部靜脈采血測抗體效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1:1O4以上時(shí)，用不加佐劑的抗原于腹腔加強(qiáng)免疫，IOOyg /只。按制備單抗的常規(guī)方法，3 d后取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。2. O間接ELISA檢測方法的建立以純化的SAMHDl原核表達(dá)蛋白作為包被抗原，采用棋盤滴定法建立檢測雜交瘤細(xì)胞的間接ELISA方法，通過 酶標(biāo)儀讀取OD45tlnm值。取陽性孔OD45tol值接近1. O, P/N值最大的抗原、抗體稀釋度作為二者的最佳工作濃度。2.1細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞的篩選將免疫鼠的脾細(xì)胞與SP2/0用PEG4000進(jìn)行融合，用建立的ELISA方法進(jìn)行篩選。經(jīng)4次亞克隆后，選擇D45tlnm值高且能穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。每次亞克隆前都要及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存。2. 2MAb 的鑒定2. 2.1腹水的制備及效價(jià)的測定按照“2. O”中建立的間接ELISA方法對3C3雜交瘤細(xì)胞上清及腹水效價(jià)的測定，即將所得的細(xì)胞上清和腹水分別從1:20開始做一系列梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為2。同時(shí)設(shè)置空白、標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清對照。判定標(biāo)準(zhǔn)為陽性值接近1. O,陰性值小于O. 2，且檢測樣品值是陰性值的2.1倍，此時(shí)的最大稀釋倍數(shù)為腹水和雜交瘤上清的ELISA效價(jià)。2. 2. 2MAb免疫球蛋白亞類鑒定利用SBA Clono-typing TM System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒對MAb進(jìn)行亞類鑒定。2. 2. 3MAb 的 western blot 鑒定將SAMHD1-PCDNA3.1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，37°C培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞并將其裂解，裂解物經(jīng)SDS-PAGE轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，用純化的濃度為lmg/ml的SAMHDl抗體按
I 10000稀釋作為一抗，羊抗鼠IRD-1gG作為二抗(I 10000)，進(jìn)行western blot分析。2. 2. 4間接免疫熒光和Western blot鑒定MAb
采用Western blot分析單抗與重組His — SAMHDl和His蛋白的反應(yīng)活性，以及單抗與真核表達(dá)SAMHDl、pcDNA3.1空載體反應(yīng)。2. 3單抗特異性分析采用Western blot分析單抗與真核表達(dá)人、猴、馬SAMHD1-HA重組蛋白及未轉(zhuǎn)染的馬皮細(xì)胞、兔腎細(xì)胞、293T細(xì)胞的反應(yīng)活性，分析其特異性。2 結(jié)果2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果以提取的血液中的單個核細(xì)胞中的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到約1878kb的片段(見圖1)，與預(yù)期大小相符。2. 2重組表達(dá)載體的鑒定結(jié)果將獲得的重組表達(dá)載體pET30a_SAMHDl用BamH I和Not I進(jìn)行酶切鑒定，得到5400bp和1878bp左右的片段(見圖2)，與預(yù)期相符。2. 3重組SAMHDl蛋白SDS-PAGE電泳分析通過對表達(dá)條件的優(yōu)化,確定最佳誘導(dǎo)溫度為16°C、最佳誘導(dǎo)時(shí)間為17h、IPTG濃度為O. 2mmol/L時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量最大且主要以可溶形式存在。菌液經(jīng)超聲波破碎和SDS-PAGE電泳分析，出現(xiàn)I條約79 k a的蛋白條帶(見圖3)，與預(yù)期相符。2. 4原核表達(dá)重組SAMHDl的純化純化的SAMHDl蛋 白分子在約79kDa處出現(xiàn)一條蛋白帶，與預(yù)期相符(圖4)。2. 5SAMHDI 蛋白的 Western-blot 檢測結(jié)果將純化的SAMHDl蛋白進(jìn)行Western-blot檢測分析，結(jié)果表明，重組SAMHDl蛋白可與Abcam公司的SAMHDl抗體發(fā)生特異性反應(yīng),而pET30a (+) /Rosetta (DE3)與此抗體不反應(yīng)(見圖5)。2. 6MAb 的 western blot 鑒定用鎳柱純化的SAMHDl為篩選抗原，建立間接ELISA方法，篩選出針對SAMHDl單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，最終獲得一株能夠穩(wěn)定分泌SAMHDl單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3C3，分類命名為抗人SAMHDl單克隆抗體3C3雜交瘤細(xì)胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC NO. 6709。用上述的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的3C3MAb檢測真核表達(dá)蛋白人SAMHDl和pcDNA3.1空白對照。檢測結(jié)果表明，此株MAb作用后產(chǎn)生的條帶大小均與SAMHDl蛋白大小(79KDa) 一致且與空載體對照無反應(yīng)(圖6)。2. 7MAb的間接免疫熒光鑒定結(jié)果顯示，3C3單抗與人SAMHDl真核表達(dá)的蛋白呈陽性反應(yīng)，并產(chǎn)生綠色熒光信號，對照(一抗為SP2/0上清)無綠色熒光信號(圖7)。2. 8腹水的制備及效價(jià)的測定采用間接ELISA方法測定雜交瘤細(xì)胞3C3腹水的效價(jià)為1:409600，明顯高于對應(yīng)細(xì)胞上清液的效價(jià)1:640。采用Protein G成功對3C3腹水進(jìn)行純化，純化后的濃度為Img/ml的SAMHDlMAb用于western blot鑒定時(shí)的稀釋倍數(shù)為5000 10000倍。2. 9單抗特異性分析本實(shí)驗(yàn)用SAMHDl的全蛋白作為免疫原，制備了效價(jià)較高的MAb，抽取的2. 5ml腹水純化后可得到高產(chǎn)量的MAb，而且與人的SAMHDl真核表達(dá)蛋白反應(yīng)性特異，可以用于實(shí)驗(yàn)室檢測，此單抗不與猴、馬SAMHDl的真核表達(dá)蛋白反應(yīng)，且與未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞、馬皮細(xì)胞、兔腎細(xì)胞均無反應(yīng)，表明其具有良好的特異性。與Abcam公司的SAMHDl抗體相比，本實(shí)驗(yàn)室制備的SAMHDl抗體具有高產(chǎn)量的優(yōu)點(diǎn)，且反應(yīng)特異，可以用于人SAMHDl的實(shí)驗(yàn)室檢測(圖 8 )。
權(quán)利要求
1.一株分泌抗人SAMHDl蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3C3，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCCNO. 6709。
2.由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗人SAMHDl蛋白的單克隆抗體。
3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測人SAMHDl蛋白試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株分泌人SAMHD1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株、由該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將純化的人SAMHD1作為免疫原，按照常規(guī)雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)將免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0融合，最終獲得一株能夠穩(wěn)定分泌SAMHD1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3C3，其菌種保藏編號為CGMCC NO.6709。Western blot和間接免疫熒光結(jié)果表明此株雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體能特異性識別真核表達(dá)的人重組蛋白SAMHD1，而與His標(biāo)簽蛋白以及真核表達(dá)的馬、猴重組蛋白SAMHD1均不發(fā)生反應(yīng)。因此說明本發(fā)明的單克隆抗體能夠用于人SAMHD1蛋白的檢測。
文檔編號C12N5/20GK103060273SQ20121053506
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者王曉鈞 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所