專利名稱：生物除磷微生物篩選用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種除磷微生物篩選用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
目前篩選生物除磷微生物的方法是將從生物除磷系統(tǒng)中取出的污泥置于含有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的搖瓶中發(fā)酵培養(yǎng)，再將發(fā)酵培養(yǎng)后的菌液稀釋，然后涂布于固體傳統(tǒng)培養(yǎng)基進行篩選得到生物除磷微生物，但該方法還存在以下問題I、該法針對性差，所以在培養(yǎng)過程中非生物除磷微生物大量繁殖，雜菌滋生，導(dǎo)致生物除磷微生物的比例下降，所分離得到生物除磷微生物的菌株數(shù)量少，僅占分離得到的全部菌株數(shù)的15%左右；2、該法所 采用的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分不合理，使得培養(yǎng)過程中生物除磷微生物的生長受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的篩選生物除磷微生物的方法針對性差，得到生物除磷微生物的菌株數(shù)量少及所用的培養(yǎng)基不適合生物除磷微生物生長的問題。而提供了一種生物除磷微生物篩選用培養(yǎng)基及篩選生物除磷微生物的方法。本發(fā)明生物除磷微生物篩選用培養(yǎng)基為生物除磷微生物所依次進行篩選用的四種培養(yǎng)基，按照用于篩選的順序四種培養(yǎng)基分別為厭氧富集培養(yǎng)基、好氧富集培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；生物除磷微生物篩選用的培養(yǎng)基為厭氧富集培養(yǎng)基、好氧富集培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；其中每升厭氧富集培養(yǎng)基是由O. 3^0. 5g的NaAc、27(T290mg的(NH4)2S04、27 29mg 的 CaCl2 · 2H20、350 370mg 的 MgSO4 · 7Η20、0· 5 O. 7mL 的微量元素液、I. 8^2. 4mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，厭氧富集培養(yǎng)基的pH值為6. 9^7. 4 ;每升好氧富集培養(yǎng)基是由 270 290mg 的 KH2PO4、48(T500mg 的 K2HPO4、26(T300mg 的(NH4)2S04、26 30mg 的 CaCl2 · 2H20、34(T380mg 的 MgSO4 · 7Η20、0· 5 I. 2mL 的微量元素液、I. 5 3mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，好氧富集培養(yǎng)基的PH值為6. 9^7. 4 ;每升固體培養(yǎng)基由 O. 3 O. 5g 的 NaAc、68 76mg 的 KH2PO4'128 132mg 的 K2HPO4,2. 4 2. 8g 的(NH4)2SO4'260 300mg的CaCl2 · 2Η20、3· 2 4g的MgSO4 · 7H20、5 9mL的微量元素液、15 25mL的維生素液、28 32g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，固體培養(yǎng)基的pH值為6. 9^7. 4 ;每升液體培養(yǎng)基是由 O. 3 O. 5g 的 NaAc、70 74mg 的 KH2P04、125 13511^的1(2冊04、2· 2 3g 的(NH4) 2S04、260 300mg的CaCl2 · 2Η20、3. Γ3. 8g的MgSO4 · 7H20、5 9mL的微量元素液、15 25mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，液體培養(yǎng)基的PH值為6. 9^7. 4。在厭氧富集培養(yǎng)基的培養(yǎng)過程中，生物除磷微生物分解體內(nèi)的聚磷顆粒或糖原釋放能量吸收NaAc形成聚-beta-羥基-鏈烷酸酯(PHAs);在好氧富集培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中，生物除磷微生物在沒有外部碳源的情況下，分解在體內(nèi)的的PHAs作為能量來源吸收磷酸鹽或合成糖原；本發(fā)明的培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分合理，與現(xiàn)有的篩選用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基相比，本發(fā)明的培養(yǎng)基針對性強，適合生物除磷微生物的生長，雜菌數(shù)量少，所分離得到的生物除磷微生物數(shù)量多，占分離得到的全部菌株數(shù)的70%。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式生物除磷微生物篩選用培養(yǎng)基為生物除磷微生物所依次進行篩選用的四種培養(yǎng)基，按照用于篩選的順序四種培養(yǎng)基分別為厭氧富集培養(yǎng)基、好氧富集培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；其中每升厭氧富集培養(yǎng)基是由O. 3^0. 5g的NaAc、270 290mg 的(NH4) 2S04、27 29mg 的 CaCl2 ·2Η20、350 370π^ 的 MgSO4 ·7Η20、0· 5 O. 7mL的微量元素液、I. 8^2. 4mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，厭氧富集培養(yǎng)基的pH值為
6.9 7. 4 ;每升好氧富集培養(yǎng)基是由 270 290mg 的 KH2PO4、48(T500mg 的 K2HPO4、26 (T300mg的(NH4)2S04、26 30mg 的 CaCl2 · 2H20、34(T380mg 的 MgSO4 · 7Η20、0· 5 I. 2mL 的微量元素液、
I.5 3mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，好氧富集培養(yǎng)基的pH值為6. 9^7. 4 ;每升固體培養(yǎng)基由 O. 3 O. 5g 的 NaAc、68 76mg 的 ΚΗ2Ρ04、128 132mg 的 K2HPO4,2. 4 2. 8g 的(NH4)2SO4'260 300mg的CaCl2 · 2Η20、3· 2 4g的MgSO4 · 7H20、5 9mL的微量元素液、15 25mL的維生素液、28 32g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，固體培養(yǎng)基的pH值為6. 9^7. 4 ;每升液體培養(yǎng)基是由 O. 3 O. 5g 的 NaAc、70 74mg 的 KH2P04、125 13511^的1(2冊04、2· 2 3g 的(NH4) 2S04、260 300mg的CaCl2 · 2Η20、3. Γ3. 8g的MgSO4 · 7H20、5 9mL的微量元素液、15 25mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，液體培養(yǎng)基的PH值為6. 9^7. 4。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是厭氧富集培養(yǎng)基、好氧富集培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的微量元素液中FeCl3 · 6H20的濃度為2. 5^3. 5g/L、H3BO3 的濃度為 O. 25 O. 35g/L，CuSO4 · 5H20 的濃度為 O. 05 O. 07g/L、KI 的濃度為
O.32 O. 4g/L、MnCl2 · 4H20 的濃度為 O. 2 O. 28g/L、Na2MO4 · 2H20 的濃度為 O. I O. 14g/L、ZnSO4 ·7Η20的濃度為O. 2^0. 28g/L和CoCl2 ·6Η20的濃度為O. 28、· 32g/L。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是厭氧富集培養(yǎng)基、好氧富集培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的維生素液由濃度為8(Tl20mg/L的維生素B1、濃度為8(Tl20mg/L的維生素B2、濃度為18(T220mg/L維生素B6、濃度為I. 8 2. 2g/L的維生素B12、濃度為36 44mg/L的葉酸、濃度為8(Tl20mg/L的煙酸，濃度為8(Tl20mg/L的泛酸鈣、濃度為8(Tl20mg/L的對氨基苯甲酸和濃度為36 44mg/L的生物素組成。其它與具體實施方式
二相同。
具體實施方式
四本實施方式篩選生物除磷微生物的方法按照以下步驟進行一、配制如具體實施一所述的厭氧富集培養(yǎng)基、好氧富集培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；二、收集污泥沉淀取生物除磷反應(yīng)器中好氧結(jié)束的污泥IOOml進行離心，棄上清，留沉淀，將沉淀置于IOOmL的血清瓶中；三、將IOOml步驟一配制的厭氧富集培養(yǎng)基倒于步驟二的血清瓶中與血清瓶中的污泥沉淀混合均勻，向血清瓶中充入氮氣10分鐘，然后在室溫條件下靜止培養(yǎng)24 28h ;四、好氧富集培養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟三培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有IOOml的步驟一配制的好氧富集培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)24 28h ;五、厭養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)將步驟四培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有IOOml步驟一配制的厭氧富集培養(yǎng)基的IOOmL血清瓶中，向血清瓶中充入氮氣10分鐘，在室溫條件下靜止培養(yǎng)24 28h ;六、循環(huán)操作步驟四至五3飛次，對活性污泥進行馴化，得到厭氧富集培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌液；七、將步驟六培養(yǎng)后的菌液離心，去上清，將離心后的沉淀放入含有IOOml的步驟一配制的好氧富集培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，在室溫條件下?lián)u床培養(yǎng)24 28h ;八、取ImL步驟七搖床培養(yǎng)后的菌液進行等梯度稀釋；九、用平板涂布法將稀釋的菌液接種到步驟一配制的固體培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)24 48h ；十、挑取步驟九中固體培養(yǎng)基上的單菌落接種到步驟一配制的液體培養(yǎng)基中，在室溫條件下培養(yǎng)24 28h ;十一、重復(fù)操作步驟八至十51次獲得純菌株；十二、對步驟九得到的純菌株進行除磷性能檢測和鏡檢，確定篩選得到的純菌株為生物除磷微生物。本實施方式步驟一中每升厭氧富集培養(yǎng)基是由O. 3^0. 5g的NaAc、27(T290mg的(NH4)2S04、27 29mg 的 CaCl2 · 2H20、350 370mg 的 MgSO4 · 7Η20、0· 5 O. 7mL 的微量元素液、
I.8^2. 4mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，厭氧富集培養(yǎng)基的pH值為6.擴7.4 ;每升 好氧富集培養(yǎng)基是由 270 290mg 的 KH2PO4、48(T500mg 的 K2HPO4、26(T300mg 的(NH4)2S04、26 30mg 的 CaCl2 · 2H20、34(T380mg 的 MgSO4 · 7Η20、0· 5 I. 2mL 的微量元素液、I. 5 3mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，好氧富集培養(yǎng)基的PH值為6. 9^7. 4 ;每升固體培養(yǎng)基由 O. 3 O. 5g 的 NaAc、68 76mg 的 KH2PO4'128 132mg 的 K2HPO4,2. 4 2. 8g 的(NH4)2SO4'260 300mg的CaCl2 · 2Η20、3· 2 4g的MgSO4 · 7H20、5 9mL的微量元素液、15 25mL的維生素液、28 32g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，固體培養(yǎng)基的pH值為6. 9^7. 4 ;每升液體培養(yǎng)基是由 O. 3 O. 5g 的 NaAc、70 74mg 的 KH2P04、125 13511^的1(2冊04、2· 2 3g 的(NH4) 2S04、260 300mg的CaCl2 · 2Η20、3. Γ3. 8g的MgSO4 · 7H20、5 9mL的微量元素液、15 25mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，液體培養(yǎng)基的PH值為6. 9^7. 4。本實施方式厭氧富集培養(yǎng)基、好氧富集培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的微量元素液中 FeCl3 · 6H20 的濃度為 2. 5 3. 5g/L、H3BO3 的濃度為 O. 25 O. 35g/L，CuSO4 · 5H20的濃度為 O. 05 O. 07g/L、KI 的濃度為 O. 32 O. 4g/L、MnCl2 · 4H20 的濃度為 O. 2 O. 28g/L、Na2MO4 · 2H20 的濃度為 O. I O. 14g/L、ZnSO4 · 7H20 的濃度為 O. 2 O. 28g/L 和 CoCl2 · 6H20 的濃度為O. 28 O. 32g/L。本實施方式厭氧富集培養(yǎng)基、好氧富集培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的維生素液由濃度為8(Tl20mg/L的維生素濃度為8(Tl20mg/L的維生素B2、濃度為18(T220mg/L維生素B6、濃度為I. 8 2. 2g/L的維生素B12、濃度為36 44mg/L的葉酸、濃度為8(Tl20mg/L的煙酸，濃度為8(Tl20mg/L的泛酸鈣、濃度為8(Tl20mg/L的對氨基苯甲酸和濃度為36 44mg/L的生物素組成。本實施方式步驟四中將離心后的沉淀放入含有步驟一配制的好氧富集培養(yǎng)基的瓶中，然后用透氣濾膜封口。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
四不同的是步驟二中的污泥在轉(zhuǎn)速為5000飛000轉(zhuǎn)/分的條件下，離心1(Γ15分鐘。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
四或五不同的是步驟四、步驟五和步驟七中離心轉(zhuǎn)速均為500(Γ6000轉(zhuǎn)/分，離心時間均為1(Γ15分鐘。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
四相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
六不同的是步驟九中等梯度稀釋的稀釋梯度倍數(shù)為10卜IO9倍。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
六相同。本實施方式共分離得到了 32株菌，將這32株菌分別進行測序，測序結(jié)果顯示，有8株菌為戴爾福特菌屬(Pelftia沖)的菌株,有6株菌為病菌/綠膿桿菌屬iPseudomonassp)_的菌株,有14株菌為不動桿菌屬(Acinetobacter的菌株,有I株菌為寡養(yǎng)單胞菌屬{Stenotrophomonass^')的菌株，有I株菌為副球菌屬(/kracoccwssp)的菌株，有I株菌為氣單胞菌屬的菌株，有I株菌為短芽孢桿菌屬(BrevibaciIlussv')的菌株；本實施方式分離得到了的菌株中有15株菌具有明顯的除磷能力為聚磷菌，占總篩菌數(shù)的46. 9% ;通過鏡檢觀察確定分離得到純菌株中具有四聚體形態(tài)的菌株有12株菌，即有12株菌為聚糖菌，占總篩菌數(shù)的37. 5%，關(guān)于聚糖菌在Oehmen A與《Journal ofBiotechnology))上發(fā)表的一篇名為《聚磷菌和聚糖菌對乙酸和丙酸碳源的競爭》的文章中也有記載。本實施方式分離得到的生物除磷微生物占分離得到的全部菌株的84. 4%，生物除磷微生物的數(shù)量多；而采用現(xiàn)有的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基篩選生物除磷微生物方法由于針對性差，所用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)基不適合生物除磷微生物，雜菌多，該法分離得到的生物除磷微生物的數(shù)量極少，僅為15%左右。·將本實施方式獲得的32株菌進行性能檢測，檢測結(jié)果如表I所示，其中除磷率低于20%的為非除磷微生物。表I
權(quán)利要求
1.生物除磷微生物篩選用培養(yǎng)基，其特征在于所述的篩選用培養(yǎng)基為生物除磷微生物所依次進行篩選用的四種培養(yǎng)基，按照用于篩選的順序四種培養(yǎng)基分別為厭氧富集培養(yǎng)基、好氧富集培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；其中每升厭氧富集培養(yǎng)基是由O. 3^0. 5g的 NaAc、27(T290mg 的(NH4)2SO4'27 29mg 的 CaCl2 · 2H20、35(T370mg 的 MgSO4 · 7H20、O.5^0. 7mL的微量元素液、I. 8^2. 4mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，厭氧富集培養(yǎng)基的PH值為6. 9 7. 4 ;每升好氧富集培養(yǎng)基是由27(T290mg的KH2PO4、48(T500mg的Κ2ΗΡ04、260 300mg 的(NH4) 2S04、26 30mg 的 CaCl2 ·2Η20、340 380π^ 的 MgSO4 ·7Η20、0· 5 I. 2mL 的微量元素液、I. 5^3mL的維生素液和余量的蒸餾水組成，好氧富集培養(yǎng)基的pH值為6. 9^7. 4 ；每升固體培養(yǎng)基由O. 3 O. 5g的NaAc、68 76mg的ΚΗ2Ρ04、128 132mg的K2HPO4,2. 4 2. 8g的(NH4) 2S04、260 300mg 的 CaCl2 · 2Η20、3· 2 4g 的 MgSO4 · 7H20、5 9mL 的微量元素液、15 25mL的維生素液、28 32g的瓊脂和余量的蒸餾水組成，固體培養(yǎng)基的pH值為6. 9^7. 4 ;每升液體培養(yǎng)基是由 O. 3 O. 5g 的 NaAc、70 74mg 的 ΚΗ2Ρ04、125 135mg 的1(2冊04、2· 2 3g 的(NH4) 2S04、260 300mg 的 CaCl2 · 2Η20、3· 4 3. 8g 的 MgSO4 · 7H20、5 9mL 的微量元素液、15 25mL 的維生素液和余量的蒸餾水組成，液體培養(yǎng)基的PH值為6. 9^7. 4。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物除磷微生物篩選用培養(yǎng)基，其特征在于厭氧富集培養(yǎng)基、好氧富集培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的微量元素液中FeCl3*6H20的濃度為2.5 3. 5g/L、H3BO3 的濃度為 O. 25 O. 35g/L, CuSO4 · 5H20 的濃度為 O. 05 O. 07g/L、KI 的濃度為 O. 32 O. 4g/L、MnCl2 · 4H20 的濃度為 O. 2 O. 28g/L、Na2MO4 · 2H20 的濃度為 O. I O. 14g/L、ZnSO4 · 7H20 的濃度為 O. 2 O. 28g/L 和 CoCl2 · 6H20 的濃度為 O. 28 O. 32g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的生物除磷微生物篩選用培養(yǎng)基，其特征在于厭氧富集培養(yǎng)基、好氧富集培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的維生素液中維生素B1的濃度為8(Tl20mg/L、維生素B2濃度為8(Tl20mg/L、維生素B6的濃度為18(T220mg/L、維生素B12的濃度為I. 8 2. 2g/L、葉酸的濃度為36 44mg/L、煙酸的濃度為8(Tl20mg/L，泛酸鈣的濃度為80 120mg/L、對氨基苯甲酸的濃度為80 120mg/L和生物素的濃度為36 44mg/L。
全文摘要
生物除磷微生物篩選用培養(yǎng)基，它涉及一種除磷微生物篩選用培養(yǎng)基。本發(fā)明解決了現(xiàn)有的篩選用培養(yǎng)基針對性差，得到微生物的菌株數(shù)量少及所用的培養(yǎng)基不適合生物除磷微生物生長的問題。篩選用培養(yǎng)基為厭氧富集培養(yǎng)基、好氧富集培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基；方法一、配制培養(yǎng)基；二、取污泥；三、厭氧富集培養(yǎng)基；四、好氧富集培養(yǎng)基；六、厭氧富集培養(yǎng)基；七、循環(huán)操作四至六2～4次；八、等梯度稀釋；九、固體培養(yǎng)基；十、液體培養(yǎng)基；十一、重復(fù)八至十3～8次；十二、檢測。本發(fā)明培養(yǎng)基針對性強，篩選得到的除磷微生物數(shù)量多，適合除磷微生物的生長。
文檔編號C12N1/02GK102943055SQ20121043790
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者亢涵 申請人:沈陽建筑大學(xué)