專利名稱：一種白酒釀造微生物的高質(zhì)量dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白酒微生物群落生態(tài)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種用于白酒釀造微生物群落結(jié)構(gòu)分析的高質(zhì)量DNA提取方法。
背景技術(shù)：
中國白酒有著悠久的釀造歷史，而且中國白酒的釀造工藝不盡相同，中國白酒的釀造生產(chǎn)以大曲作為微生物及酶的主要來源，在實際生產(chǎn)中，大曲質(zhì)量的優(yōu)劣關(guān)系到白酒的出酒率及酒的品質(zhì)。在大曲的生產(chǎn)過程中伴隨著一系列微生物此消彼長的馴化過程，大曲當中微生物的群落結(jié)構(gòu)直接關(guān)系到大曲的生產(chǎn)質(zhì)量。中國白酒主要以窖池及酒醅等作為生產(chǎn)基礎(chǔ)，環(huán)境、大曲及窖泥當中的微生物進行著復雜的能量代謝和物質(zhì)代謝，微生物復雜的代謝過程也是白酒風味前體物質(zhì)的形成過程，研究不同工藝生產(chǎn)的大曲、同一大曲制曲過程及窖泥中微生物的群落差異及變遷，對于大曲及白酒的生產(chǎn)具有一定的指導意義。與本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)有DNA提取方法和DNA提取試劑盒等，有如專利申請?zhí)枮?01210107413. O記載了一種大曲酒窖泥微生物總DNA提取的前處理方法，包括以下步驟
(I)稱取適量窖泥，放入滅菌的離心管中，加入滅菌生理鹽水，充分振蕩，離心，棄去上清液;同法重復洗滌樣品I次；(2)向上述樣品加入無水乙醇，充分振蕩，離心，棄去上清液；同法重復洗滌樣品I次；(3)加入無菌超純水，混合均勻，振蕩洗滌樣品，離心，棄去上清液；(4)將充分洗滌的窖泥樣品用雙層滅菌紗布包裹離心管口，_70°C冷凍30min，低溫真空抽干至粉狀，保存于_20°C冰箱，用于提取窖泥微生物總DNA。有如專利申請?zhí)枮?01010266385. 8記載了涉及一種研究大曲細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的方法，主要步驟如下1):直接提取大曲基因組DNA ;2):選擇細菌通用引物，擴增細菌核糖體DNA中的特異性DNA片段；3) :DGGE電泳分離PCR產(chǎn)物；4):切膠回收DGGE指紋圖譜中微生物對應的條帶；5):重新PCR，將產(chǎn)物連接至T載體，藍白斑篩選并進行陽性克隆驗證；6):測序獲得DGGE條帶對應微生物的種屬信息。有如專利申請?zhí)枮?01210107413. O記載了一種白酒大曲中微生物總DNA提取的方法，其特征在于在提取DNA之前對白酒大曲進行前處理，前處理包括如下步驟取大曲，加入前處理液含O. 05-0. 2ff/V% PVPP (交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮)和3-5W/V%土溫-80或土溫-60的磷酸緩沖液，pH8.0，其中大曲和前處理液的重量體積比為3-8 25，振搖；超聲處理；靜置后低速離心；取上清液，高速離心；去除上清液沉淀加入O. 05-0. 2ff/V% PVPP (交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮)的磷酸緩沖液；打散后高速離心，去除上清液，得到樣品。但是，現(xiàn)有的技術(shù)方法中存在以下缺陷(1)基因組DNA提取方法應用的范圍較窄(僅僅是大曲或窖泥)，而普遍適用的方法鮮見；(2)前處理方法中加入了一定的絮凝物，但絮凝物對微生物群落中豐度較低的微生物的影響不可估量；同時，由于大曲及窖泥的微生態(tài)環(huán)境很復雜，有很多的干擾成分存在，獲得的基因組總DNA的質(zhì)量并不理想。因此，一種適用范圍廣泛、簡單易行的能夠從大曲、糟醅和窖泥中提取高質(zhì)量DNA的有效且穩(wěn)定的方法是迫切需要的
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種適用范圍廣泛、簡單易行的能夠從大曲、糟醅和窖泥中提取高質(zhì)量DNA的有效且穩(wěn)定的方法。其具體步驟如下
⑴樣品預處理
稱取一定量的大曲，加入 30mL PBS 緩沖液(O. 0557mol/L Na2HPO4,0. 0423mol/LNaH2PO4,pH8. O),潤旋均勻，800r/min 離心 IOmin,取上清液,并 10000r/min 離心 IOmin 得固
態(tài)菌團。⑵DNA提取與檢測
將上述固態(tài)菌團重懸于 500 μ L DNA 提取液(0. IM Tris-HCl, 0. IM EDTA，I. 5Μ NaCl,1%CTAB, ρΗ8· 0)中，加入 10 μ L 纖維素酶(75mg/mL)、蝸牛酶(50mg/mL)和溶菌酶(40mg/mL)，37°C 裂解 Ih ;加入 IOyL 20%SDS，65°C 保溫 I. 5h ;加入 10 μ L 蛋白酶 K(5mg/mL)，60 °C水浴搖床lh,4500r/min離心IOmin,收集上清液;用等體積酌·:氯仿:異戍醇(25:24:1)抽提，4°C 10000r/min離心lOmin，收集上清液；用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，IOOOOr/min離心lOmin，取上清液移至干凈管中；加入0. 6倍體積預冷的異丙醇，_20°C下放置2h以上,4°C 13000r/min離心20min,去上清液；用預冷的無水乙醇洗漆沉淀2_3次,真空冷凍干燥。將 DNA 溶解于 IOOyL TE (IOmM Tris-HCl, I mM EDTA, pH8. 0)溶液中，保存于 _20°C冰箱，PCR-DGGE檢測提取高質(zhì)量DNA的有效性。本發(fā)明具有的優(yōu)點是所用試劑均為常規(guī)試劑，成本低廉，適用范圍廣、操作簡單、條件溫和、提取的DNA純度較高，無需對基因組DNA進行純化即可進行后續(xù)PCR擴增及DGGE分析等優(yōu)點。


圖I為大曲、糟醅及窖泥微生物基因組DNA電泳圖譜。泳道M為MarkeK λ DNA/HindIII);泳道1、2為大曲樣品；泳道3、4分別為糟醅和窖泥樣品。圖2為大曲、糟醅和窖泥微生物細菌基因組DNA 16S rDNA V3區(qū)擴增電泳圖譜。泳道M為Marker (D2000);泳道1、2為大曲樣品；泳道3、4分別為糟醅和窖泥樣品。圖3為大曲、糟醅和窖泥真菌基因組DNA 18S rDNA擴增電泳圖譜。泳道1、2為大曲樣品；泳道3、4分別為糟醅和窖泥樣品。圖4為大曲、糟醅和窖泥細菌基因組DNA 16S rDNA V3區(qū)擴增產(chǎn)物DGGE圖譜。泳道1、2為大曲樣品；泳道3、4分別為糟醅和窖泥樣品。圖5為大曲、糟醅和窖泥真菌基因組DNA 18S rDNA擴增產(chǎn)物DGGE圖譜。泳道I、2為大曲樣品；泳道3、4分別為糟醅和窖泥樣品。
具體實施例方式實施例四川某酒廠大曲、糟醅及窖泥微生物基因組總DNA的提取、PCR擴增及DGGE
⑴樣品預處理
稱取 5g 大曲，加入 30mL PBS 緩沖液(O. 0557moI/LNa2HPO4,0. 0423mol/LNaH2P04,pH8. O),潤旋均勻，800r/min離心lOmin,取上清液,并10000r/min離心IOmin得固態(tài)菌團。⑵DNA提取與檢測將上述固態(tài)菌團重懸于 500 μ L DNA 提取液(O. IM Tris-HCl, O. IM EDTA，I. 5Μ NaCl,1%CTAB, ρΗ8· O)中，加入 10 μ L 纖維素酶(75mg/ml)、蝸牛酶(50mg/ml)和溶菌酶(40mg/mL)，37°C 裂解 Ih ;加入 IOyL 20%SDS，65°C 保溫 I. 5h ;加入 10 μ L 蛋白酶 K(5mg/mL)，60 °C水浴搖床lh,4500r/min離心IOmin,收集上清液;用等體積酌·:氯仿異戍醇(25:24:1)抽提，4°C 10000r/min離心lOmin，收集上清液；用等體積氯仿異戊醇(24:1)抽提，IOOOOr/min離心lOmin，取上清液移至干凈管中；加入O. 6倍體積預冷的異丙醇，-20 °C下放置2h以上，4°C 13000r/min離心20min，去上清液；用預冷的無水乙醇洗滌沉淀2_3次，冷凍真空干燥。將 DNA 溶解于 IOOyL TE (IOmM Tris-HCl, I mM EDTA，ρΗ8· O)溶液中，保存于 _20°C冰箱，PCR-DGGE檢測提取高質(zhì)量DNA的有效性。
權(quán)利要求
1.一種用于白酒釀造微生物群落結(jié)構(gòu)分析的高質(zhì)量DNA提取方法，其特征在于包括以下步驟⑴樣品預處理稱取一定量的大曲，加入 30mL PBS 緩沖液(O. 0557mol/L Na2HPO4,0. 0423mol/LNaH2PO4,pH8. O),潤旋均勻，800r/min 離心 IOmin,取上清液,并 10000r/min 離心 IOmin 得固態(tài)菌團。⑵DNA提取與檢測將上述固態(tài)菌團重懸于 500 μ L DNA 提取液(0. IM Tris-HCl, 0. IM EDTA，I. 5Μ NaCl,1%CTAB, pH8. 0)中，加入 10μ L 纖維素酶(75mg/mL)、蝸牛酶(50mg/mL)和溶菌酶(40mg/mL)，37°C 裂解 Ih ;加入 IOyL 20%SDS，65°C 保溫 I. 5h ;加入 10 μ L 蛋白酶 K(5mg/mL)，60 °C水浴搖床lh,4500r/min離心IOmin,收集上清液;用等體積酌·:氯仿:異戍醇(25:24:1)抽提，4°C 10000r/min離心lOmin，收集上清液；用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，IOOOOr/min離心lOmin，取上清液移至干凈管中；加入0. 6倍體積預冷的異丙醇，-20 °C下放置2h以上，4°C 13000r/min離心20min，去上清液；用預冷的無水乙醇洗滌沉淀2_3次，真空冷凍干燥。將DNA溶解于100 μ L TE溶液中，保存于_20°C冰箱，PCR-DGGE檢測提取高質(zhì)量DNA的有效性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種大曲及窖泥微生物總基因組DNA的提取方法，其特征在于所述步驟 2) TE 溶液為 IOmM Tris-HCl，I mM EDTA, pH8. O。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種白酒釀造微生物高質(zhì)量DNA提取方法。其特征在于⑴通過對樣品進行簡單前處理后獲得菌體混合物；⑵向混合物中加入DNA提取液、各種酶液、SDS及蛋白酶K等使菌體中的DNA充分釋放；⑶加入酚氯仿異戊醇及氯仿異戊醇抽提除去雜蛋白以純化DNA；⑷異丙醇在低溫下沉淀DNA，無水乙醇洗滌，獲得高質(zhì)量的微生物基因組總DNA。本發(fā)明具有的優(yōu)點是所用試劑均為常規(guī)試劑，成本低廉，適用范圍廣、操作簡單、條件溫和、提取的DNA純度較高，無需對基因組DNA進行純化即可進行后續(xù)PCR擴增及DGGE分析等優(yōu)點。
文檔編號C12N15/10GK102911933SQ20121043521
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月5日
發(fā)明者周榮清, 張立強, 鄭佳 申請人:四川大學