專(zhuān)利名稱(chēng)：一組特異識(shí)別黃曲霉毒素B₁的寡核苷酸適配子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到利用分子生物學(xué)技術(shù)中的SELEX技術(shù)(指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù))制備一組與黃曲霉毒素B1高特異性和高親和力的核酸適配予，為該核酸適配子在檢測(cè)黃曲霉毒素B1中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(aflatoxins，AF)主要是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的二次代謝產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。目前已確 定黃曲霉毒素結(jié)構(gòu)的有AFBpAFB2、AFM1等18種，它們的基本結(jié)構(gòu)中都含有二呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)?又名香豆素)，前者為其毒性結(jié)構(gòu)，后者可能與其致癌有關(guān)。黃曲霉毒素耐高溫，通常加熱處理對(duì)其破壞很小，只有在熔點(diǎn)溫度下才發(fā)生分解。黃曲霉毒素遇堿能迅速分解，但此反應(yīng)可逆，即在酸性條件下又復(fù)原。在溫暖潮濕氣候地區(qū)的糧食和飼料，凡被黃曲霉菌和寄生曲霉菌污染都可能存在黃曲霉毒素。黃曲霉毒素最易污染花生、玉米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品，其次是小麥、高粱和甘薯，大豆柏被黃曲霉毒素污染的程度輕些。我國(guó)糧食和飼料被黃曲毒素污染率很高，給飼料企業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)主帶來(lái)了很大損失。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類(lèi)致癌物，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)。黃曲霉毒素的危害性在于對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織有破壞作用，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝癌甚至死亡，在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為多見(jiàn)，其毒性和致癌性也最強(qiáng)，其致癌力是奶油黃的900倍，比二甲基亞硝胺誘發(fā)肝癌的能力大75倍，比3，4_苯并芘大4000倍。它主要誘使動(dòng)物發(fā)生肝癌，也能誘發(fā)胃癌、腎癌、直腸癌及乳腺、卵巢、小腸等部位的癌癥；其毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氰化物、砷化物和有機(jī)農(nóng)藥，比氰化鉀大100倍，比砒霜大68倍。因此，如何快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出黃曲霉毒素B1具有重要研究意義。目前，對(duì)真菌毒素B1的檢測(cè)方法應(yīng)用最多的是抗原抗體法即免疫學(xué)方法，但這種方法需要制備特異性的抗體，抗體具有不穩(wěn)定性，制備的成本較高而且不宜保存，受免疫原性等的限制。這些不足制約了免疫學(xué)方法在真菌毒素領(lǐng)域中的應(yīng)用。而且目前存在的檢測(cè)方法檢測(cè)限普遍較高，不適合真菌毒素中毒具有隱蔽性和微量性的特點(diǎn)。因此，建立新的對(duì)真菌毒素尤其是黃曲霉毒素B1為典型代表的快速而靈敏的檢測(cè)方法尤為必要。近些年來(lái)，寡核苷酸適配子作為抗體分子的前景性替代分子，其研究較為引人注目。寡核苷酸適配子是通過(guò)SELEX過(guò)程篩選的與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù))是20世紀(jì)90年代初研制的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，是一種研究核酸結(jié)構(gòu)和功能的有效方法。其基本原理是體外化學(xué)合成一個(gè)隨機(jī)單鏈寡核苷酸庫(kù)，用它與靶物質(zhì)混合形成靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物，洗去未與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，分離與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，以此核酸分子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行下輪的篩選過(guò)程。通過(guò)數(shù)輪重復(fù)篩選與擴(kuò)增，最后得到高親和力和高特異性的寡核苷酸適配子即Aptamer。利用SELEX技術(shù)篩選獲得的Aptamer識(shí)別分子的模式與蛋白抗體類(lèi)似，但與蛋白類(lèi)抗體相比，適配子具有更明顯的優(yōu)越性，如不依賴(lài)動(dòng)物細(xì)胞，不受免疫條件和免疫原性限制，適配子的篩選完全在體外進(jìn)行，具有時(shí)間、質(zhì)量和數(shù)量上的選擇彈性，可以在合成時(shí)精確、定點(diǎn)、隨意連接其他功能基團(tuán)和分子；適配子變性與復(fù)性可逆且速度快，可反復(fù)使用、長(zhǎng)期保存和室溫運(yùn)輸；靶分子范圍更廣，除蛋白質(zhì)、核苷酸大分子外，還有小分子(如染料、可卡因、咖啡因和茶堿等)、生長(zhǎng)因子、肽鏈、類(lèi)固醇、糖類(lèi)、輔因子(如FMN等)，甚至可用于完整的細(xì)胞、病毒、孢子等；與靶分子結(jié)合具有更強(qiáng)的特異性和親和力，不受組織或樣品中非靶蛋白的干擾，可以在靶目標(biāo)性質(zhì)未知的情況下篩選出其相應(yīng)的適配子；適配子通過(guò)占據(jù)靶物質(zhì)表位，使疾病得到控制，作為臨床藥物的治療，已顯現(xiàn)了潛在的應(yīng)用前景，已有研究通過(guò)SELEX技術(shù)篩選到相應(yīng)靶物質(zhì)的適配子作為拮抗劑，抑制腫瘤生長(zhǎng)時(shí)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血栓生成因子、ー些毒素蛋白等的作用，以達(dá)到治療目的。在微生物檢測(cè)方面，特別是對(duì)ー些致病性細(xì)菌或病毒的研究，雖然不知道其內(nèi)部結(jié)構(gòu)、功能及這些物質(zhì)的表位，但將其作為靶物質(zhì)，通過(guò)SELEX過(guò)程篩選到與其對(duì)應(yīng)的適配子，檢測(cè)靶物質(zhì)，已成為該領(lǐng)域的研究探索熱點(diǎn)。鑒于SELEX技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)抗原抗體技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，具有更高的選擇性，特異性和親和性，以及能區(qū)分結(jié)構(gòu)極其相似的物質(zhì)的特性，而且目前SELEX技術(shù)主要應(yīng)用在整體菌 及細(xì)胞等大分子的篩選中，在小分子領(lǐng)域尤其是真菌毒素的應(yīng)用中很少，據(jù)報(bào)道篩選出的真菌毒素適配體只有赭曲霉毒素和伏馬菌素的適配子，若能篩選出黃曲霉毒素B1的適配子對(duì)真菌毒素的檢測(cè)將有重要的意義，同時(shí)也將推動(dòng)SELEX技術(shù)在小分子領(lǐng)域的發(fā)展，也是SELEX技術(shù)自身的完善。本發(fā)明以食品和糧食中常見(jiàn)的黃曲霉毒素B1為靶標(biāo)，利用SELEX技術(shù)獲得了與黃曲霉毒素B1特異性結(jié)合的核酸適配子序列，該序列可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)黃曲霉毒素B1，由于單鏈DNA寡核苷酸適配子性能穩(wěn)定、合成方便且廉價(jià)、經(jīng)修飾后可直接用于熒光或化學(xué)發(fā)光、發(fā)色方法檢測(cè)黃曲霉毒素B1，因此操作簡(jiǎn)單、直接。該發(fā)明可以在食品安全檢測(cè)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供ー種真菌毒素檢測(cè)方法，特別涉及ー種利用適配子技術(shù)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法。本發(fā)明方法利用指數(shù)級(jí)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX技術(shù))，以黃曲霉毒素B1為靶標(biāo)，篩選獲得與靶標(biāo)高親和性特異結(jié)合的適配子，通過(guò)羧基熒光素(FAM)標(biāo)記方法達(dá)到快速、準(zhǔn)確診斷食品或糧食中黃曲霉毒素B1的目的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(I)與蛋白類(lèi)的抗體相比，單鏈寡核苷酸更為穩(wěn)定；Aptamer可直接體外合成、標(biāo)記，不需要標(biāo)記的ニ抗，使得操作更為簡(jiǎn)單、迅速;Aptamer的合成成本較抗體制備成本低，周期短。(2)該序列是從結(jié)構(gòu)顯著、與靶標(biāo)具有不同親和カ的9條適配子序列中選取出的親和カ和特異性均最強(qiáng)的一組適配子序列，能夠特異識(shí)別黃曲霉毒素


圖I是第ト10輪篩選得到的AFbi-SSDNA變性聚丙烯酰胺電泳圖
圖2是AFBfaptamer飽和結(jié)合曲線(xiàn)3是AFBfaptamer特異性圖表I代表適配子與AFBi的解離常數(shù)
具體實(shí)施例方式下面是通過(guò)SELEX技術(shù)篩選特異結(jié)合部分適配子與AFBl的解離常數(shù)的核酸適配子制備方法及其快速檢出部分適配子與AFB1的解離常數(shù)方面的應(yīng)用。I、合成隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物(IDT公司合成)隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)文庫(kù)5’_AGCAGC ACA GAG GTC AGATG(N40)CCTATGCGT GCTACC GTG AA-3’，構(gòu)建了長(zhǎng)度為80nt的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)，兩端為固定引物序列，中間為40·個(gè)堿基的隨機(jī)序列，庫(kù)容量為IO14以上；引物I :5’ -AGCAGCACAGAG GTCAGATG-3’ ；引物II 5’-P04-TTC ACG GTA GCA CGC ATA GG-3’，將隨機(jī)ssDNA文庫(kù)和兩種引物均用TE緩沖液配制成100 u mo I/L貯存液_20°C貯存?zhèn)溆谩?、雙鏈 DNA (dsDNA)及單鏈 DNA (ssDNA)文庫(kù)的 PCR 擴(kuò)增取2mol隨機(jī)ssDNA文庫(kù)(第二輪開(kāi)始每次加入200pmol)加入500 U L結(jié)合緩沖液 BB(pH7. 0 :100mmol/L NaCI,20mmol/L Tris-HCl pH7.6,2mmol/L MgCl2,5mmol/L KCl,lmmol/L CaCl2,0. 02% Tween20)，95°C水浴 5min，冰浴 5min 然后取 200 u L 連有目標(biāo)物質(zhì)AFB1的磁珠，事先用BB沖洗，用磁鐵將其吸附在管子底部棄上清，然后將冰浴產(chǎn)物加入其中37°C搖床孵化2h。將孵化體系用混勻器震蕩20s，加磁鐵棄上清，反復(fù)用BB沖洗5次，每次lmL。在磁珠中加入洗脫緩沖液I XPCR擴(kuò)增緩沖液100 u L，95°C水浴5min，冰浴5min，迅速震蕩20s加磁鐵將上清吸出即為洗脫液，再在磁珠中加入IOOii LI XPCR擴(kuò)增緩沖液重復(fù)洗脫。將兩次洗脫液混勻作為模板PCR加樣模板5 u L，上下游引物各I U L，dNTPl u L，10XPCR擴(kuò)增緩沖液5 ii L，滅菌水36. 5 ii L，Taq酶0. 5 ii L,總體積為50 y L在95°C 5min,95°C 30s, 60°C 40s, 72°C 30s，循環(huán) 30 次，72°C 7min, 12°C 2min 條件下擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物用6 X DNA凝膠上樣緩沖液(溴酚藍(lán)0.25%，蔗糖40 %，水59. 75 % )跑變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，驗(yàn)證擴(kuò)增是否成功，然后在同樣條件下進(jìn)行大批量擴(kuò)增以備純化和單鏈制備，將酶切好的單鏈置4°C環(huán)境中儲(chǔ)存?zhèn)溆?，進(jìn)行下ー輪的篩選。3、篩選所用黃曲霉毒素B1的獲取與處理黃曲霉毒素B1屬于小分子，要與SELEX技術(shù)結(jié)合必須借用一定的載體，首先選擇了氨基化的磁珠作為載體，然后對(duì)黃曲霉毒素B1進(jìn)行了活化使其帶上羧基，采用EDC-NHS連接方法將黃曲霉毒素B1固定在磁珠的表面，表征活化連接成功后4°C環(huán)境中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?、克隆和測(cè)序?qū)⒌谑喐患膕sDNA文庫(kù)，PCR擴(kuò)增為雙鏈，送上海生エ生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，獲得30條適配子序列。5、適配子序列結(jié)構(gòu)分析采用DNAMAN軟件和RNA Structure4. 2軟件分別對(duì)適配子序列進(jìn)行ー級(jí)結(jié)構(gòu)和ニ級(jí)結(jié)構(gòu)分析，獲得30條序列的同源性信息和ニ級(jí)結(jié)構(gòu)圖譜。結(jié)合一級(jí)結(jié)構(gòu)同源性和ニ級(jí)結(jié)構(gòu)將序列分為9個(gè)家族，從每個(gè)家族中選出I條結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能級(jí)較低的序列為代表進(jìn)行下一步鑒定，共9條。
6、適配子與黃曲霉毒素B1親和力和特異性測(cè)定6. I適配子親和力分析根據(jù)AFB1Iptamer的一、二級(jí)結(jié)構(gòu)特征，把測(cè)序得到的所有序列進(jìn)行分組，從每組中挑選出能級(jí)較低，結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定的一條序列，由上海生工合成并在其5’端標(biāo)記生物素。將合成的9條標(biāo)有生物素的AFBi-aptamer與親和素化的磁珠組裝成適配體探針，用BB分別稀釋成10、20、40、60、80、100、120、150鹽01/1，再在上述不同濃度適配子的溶液中加入AFB1 (應(yīng)用中的AFB1用甲醇-BB溶解)，使AFB1的最后濃度為1000ng/L，37°C、3000rpm搖床孵育lh，磁分離棄上清，用BB反復(fù)沖洗5次，在激發(fā)波長(zhǎng)375nm，發(fā)射波長(zhǎng)425nm,電壓800V下測(cè)磁珠上的熒光強(qiáng)度，平行三次，應(yīng)用GraphPad Prism5軟件計(jì)算各個(gè)代表序列的解離常數(shù)&值，并繪制各不同濃度適配子對(duì)AFB1的飽和曲線(xiàn)，結(jié)果如圖2所示。
表I
權(quán)利要求
1.ー組特異識(shí)別黃曲霉毒素B1的寡核苷酸適配子，其寡核苷酸序列為 1)序列表中序列1、2、3所示的序列； 2)序列表中序列1所示的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失和/或者插入ー個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的具有序列表中序列1同等功能的序列； 3)序列表中序列2所示的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失和/或者插入ー個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的具有序列表中序列2同等功能的序列； 4)序列表中序列3所示的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失和/或者插入ー個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的具有序列表中序列3同等功能的序列。
2.權(quán)利要求1所述的寡核苷酸適配子在檢測(cè)食品中黃曲霉毒素B1方面的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的應(yīng)用，其特征在于所述寡核苷酸適配子的5’端或3’端可以經(jīng)過(guò)FITC,或FAM,或生物素,或地高辛標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一組黃曲霉毒素B1的寡核苷酸適配子。通過(guò)SELEX技術(shù)獲得了能夠特異識(shí)別黃曲霉毒素B1的單鏈DNA寡核苷酸適配子，該適配子可以通過(guò)熒光素標(biāo)記等轉(zhuǎn)為報(bào)告適配子用于檢測(cè)黃曲霉毒素B1，該適配子序列在準(zhǔn)確、快速檢出食品中的黃曲霉毒素B1方面具有廣泛應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/115GK102952802SQ201210370140
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者王周平, 王文鳳, 段諾, 吳世嘉, 夏雨, 馬小媛 申請(qǐng)人:江南大學(xué)