專利名稱：一組特異識別黃曲霉毒素B₂的寡核苷酸適配子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，特別涉及到利用分子生物學技術中的SELEX技術(指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術)制備一組與黃曲霉毒素B2高特異性和高親和力的核酸適配子，為該核酸適配子在檢測黃曲霉毒素B2中的應用提供科學依據(jù)和理論基礎。
背景技術：
黃曲霉毒素(aflatoxins，AF)主要是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的二次代謝產(chǎn)物，其化學結構類似，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。目前已確定黃曲霉毒素結構的有AFBpAFB2、AFM1等18種，它們的基本結構中都含有二呋喃環(huán)和氧雜萘鄰酮(又名香豆素)，前者為其毒性結構，后者可能與其致癌有關。黃曲霉毒素耐高溫，通常加熱處理對其破壞很小，只有在
熔點溫度下才發(fā)生分解。黃曲霉毒素遇堿能迅速分解，但此反應可逆，即在酸性條件下又復原。在溫暖潮濕氣候地區(qū)的糧食和飼料，凡被黃曲霉菌和寄生曲霉菌污染都可能存在黃曲霉毒素。黃曲霉毒素最易污染花生、玉米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品，其次是小麥、高粱和甘薯，大豆柏被黃曲霉毒素污染的程度輕些。我國糧食和飼料被黃曲毒素污染率很高，給飼料企業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)主帶來了很大損失。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構劃定為I類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質。黃曲霉毒素的危害性在于對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴重時，可導致肝癌甚至死亡。黃曲霉毒素B2與黃曲霉毒素B1結構極其相似，只差一個雙鍵的位置，鑒于黃曲霉毒素B1的強致癌性與毒性，黃曲霉毒素B2也具有其性質，因此，如何快速、準確檢測出黃曲霉毒素B2具有重要研究意義。目前，對真菌毒素B2的檢測方法應用最多的是抗原抗體法即免疫學方法，但這種方法需要制備特異性的抗體，抗體具有不穩(wěn)定性，制備的成本較高而且不宜保存，受免疫原性等的限制。這些不足制約了免疫學方法在真菌毒素領域中的應用。而且目前存在的檢測方法檢測限普遍較高，不適合真菌毒素中毒具有隱蔽性和微量性的特點。因此，建立新的對真菌毒素尤其是黃曲霉毒素B2為典型代表的快速而靈敏的檢測方法尤為必要。近些年來，寡核苷酸適配子作為抗體分子的前景性替代分子，其研究較為引人注目。寡核苷酸適配子是通過SELEX過程篩選的與靶物質特異性結合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX 技術(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,系統(tǒng)進化指數(shù)富集技術)是20世紀90年代初研制的一種新的組合化學技術，是一種研究核酸結構和功能的有效方法。其基本原理是體外化學合成一個隨機單鏈寡核苷酸庫，與靶物質混合孵育，形成靶物質-核酸復合物，洗去未與靶物質結合的核酸分子，分離與靶物質結合的核酸分子，以此核酸分子為模板進行PCR擴增，再進行下輪的篩選過程。通過數(shù)輪重復篩選與擴增，最后得到高親和力和高特異性的寡核苷酸適配子，即Aptamer。利用SELEX技術篩選獲得的Aptamer識別分子的模式與蛋白抗體類似，但與蛋白類抗體相比，適配子具有更明顯的優(yōu)越性，如不依賴動物細胞，不受免疫條件和免疫原性限制，適配子的篩選完全在體外進行，具有時間、質量和數(shù)量上的選擇彈性，可以在合成時精確、定點、隨意連接其他功能基團和分子；適配子變性與復性可逆且速度快，可反復使用、長期保存和室溫運輸；靶分子范圍更廣，除蛋白質、核苷酸大分子外，還有小分子(如染料、可卡因、咖啡因和茶堿等)、生長因子、肽鏈、類固醇、糖類、輔因子(如FMN等)，甚至可用于完整的細胞、病毒、孢子等；與靶分子結合具有更強的特異性和親和力，不受組織或樣品中非靶蛋白的干擾，可以在靶目標性質未知的情況下篩選出其相應的適配子；適配子通過占據(jù)靶物質表位，使疾病得到控制，作為臨床藥物的治療，已顯現(xiàn)了潛在的應用前景，已有研究通過SELEX技術篩選到相應靶物質的適配子作為拮抗劑，抑制腫瘤生長時的血管內(nèi)皮生長因子、血栓生成因子、ー些毒素蛋白等的作用，以達到治療目的。在微生物檢測方面，特別是對ー些致病性細菌或病毒的研究，雖然不知道其內(nèi)部結構、功能及這些物質的表位，但將其作為靶物質，通過SELEX過程篩選到與其對應的適配子，檢測靶物質，已成為該領域的研究探索熱點。鑒于SELEX技術相對于傳統(tǒng)抗原抗體技術的優(yōu)勢，具有更高的選擇性，特異性和親和性，以及能區(qū)分結構極其相似的物質的特性，而且目前SELEX技術主要應用在整體菌及細胞等大分子的篩選中，在小分子領域尤其是真菌毒素的應用中很少，據(jù)報道篩選出的 真菌毒素適配體只有赭曲霉毒素和伏馬菌素的適配子，若能篩選出黃曲霉毒素B2的適配子對真菌毒素的檢測將有重要的意義，同時也將推動SELEX技術在小分子領域的發(fā)展，也是SELEX技術自身的完善。本發(fā)明以食品和糧食中常見的黃曲霉毒素B2為靶標，利用SELEX技術獲得了與黃曲霉毒素B2特異性結合的核酸適配子序列，該序列可以快速、準確檢測黃曲霉毒素B2,由于單鏈DNA寡核苷酸適配子性能穩(wěn)定、合成方便且廉價、經(jīng)修飾后可直接用于熒光或化學發(fā)光、發(fā)色方法檢測黃曲霉毒素B2，因此操作簡單、直接。該發(fā)明可以在食品安全檢測、臨床醫(yī)學等領域得到廣泛應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供ー種真菌毒素檢測方法，特別涉及ー種利用適配子技術快速、準確檢測黃曲霉毒素B2的方法。本發(fā)明方法利用指數(shù)級富集配體的系統(tǒng)進化技術(SELEX技術)，以黃曲霉毒素B2為靶標，篩選獲得與靶標高親和性特異結合的適配子，通過羧基熒光素(FAM)標記方法達到快速、準確診斷食品或糧食中黃曲霉毒素B2的目的。本發(fā)明的優(yōu)點(I)與蛋白類的抗體相比，單鏈寡核苷酸更為穩(wěn)定；Aptamer可直接體外合成、標記，不需要標記的ニ抗，使得操作更為簡單、迅速;Aptamer的合成成本較抗體制備成本低，周期短。(2)該序列是從結構顯著、與靶標具有不同親和カ的9條適配子序列中選取出的親和カ和特異性均最強的一組適配子序列，能夠特異識別黃曲霉毒素B2。


圖I是第ト10輪篩選得到的AFb2-SSDNA變性聚丙烯酰胺電泳2是AFB2_aptamer飽和結合曲線3 是 AFB2_aptamer 特異性圖表I代表適配子與AFB2的解離常數(shù)
具體實施例方式下面是通過SELEX技術篩選特異結合部分適配子與AFB2的解離常數(shù)的核酸適配子制備方法及其快速檢出部分適配子與AFB2的解離常數(shù)方面的應用。I、合成隨機單鏈DNA文庫和引物(IDT公司合成)隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫5’ -AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG (N40) CCT ATGCGTGCT ACC GTG AA-3’，構建了長度為80nt的隨機ssDNA文庫，兩端為固定引物序列，中間為40個堿基的隨機序列，庫容量為1014以上；引物I :5’ -AGCAGCACAGAG GTCAGATG-3’ ；引物II :5’ -PO4-TTC ACG GTA GCA CGC ATA GG-3’，將隨機ssDNA文庫和兩種引物均用TE緩沖液配制成100 μ mol/L貯存液_20°C貯存?zhèn)溆谩?、雙鏈 DNA (dsDNA)及單鏈 DNA (ssDNA)文庫的 PCR 擴增 取2nmol隨機ssDNA文庫(第二輪開始每次加入200pmol)加入500 μ L結合緩沖液ΒΒ(ρΗ7· O :100mmol/L NaCl,20mmol/L Tris-HCl ρΗ7·6，2mmol/L MgCl2,5mmol/L KCl,lmmol/L CaCl2,0. 02% Tween20)，95°C水浴 5min，冰浴 5min 然后取 200 μ L 連有目標物質AFB2的磁珠，事先用BB沖洗，用磁鐵將其吸附在管子底部棄上清，然后將冰浴產(chǎn)物加入其中37°C搖床孵化2h。將孵化體系用混勻器震蕩20s，加磁鐵棄上清，反復用BB沖洗5次，每次lmL。在磁珠中加入洗脫緩沖液I XPCR擴增緩沖液100 μ L，95°C水浴5min，冰浴5min，迅速震蕩20s加磁鐵將上清吸出即為洗脫液，再在磁珠中加入100 μ LI X PCR擴增緩沖液重復洗脫。將兩次洗脫液混勻作為模板PCR加樣模板5 μ L，上下游引物各I μ L，dNTPl μ L，10XPCR擴增緩沖液5 μ L，滅菌水36. 5 μ L，Taq酶O. 5 μ L,總體積為50 μ L在95°C 5min,95°C 30s, 60°C 40s, 72°C 30s，循環(huán) 30 次，72。。7min, 12°C 2min 條件下擴增。將擴增產(chǎn)物用6 X DNA凝膠上樣緩沖液(溴酚藍0.25%，蔗糖40 %，水59. 75 % )跑變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，驗證擴增是否成功，然后在同樣條件下進行批量擴增以備純化和單鏈制備，將酶切好的單鏈置4°C環(huán)境中儲存?zhèn)溆?，進行下一輪的篩選。3、篩選所用黃曲霉毒素B2的獲取與處理黃曲霉毒素B2屬于小分子，要與SELEX技術結合必須借用一定的載體，首先選擇了氨基化的磁珠作為載體，然后對黃曲霉毒素B2進行了活化使其帶上羧基，采用EDC-NHS連接方法將黃曲霉毒素B2固定在磁珠的表面，表征活化連接成功后4°C環(huán)境中儲存?zhèn)溆谩?、克隆和測序將第十輪富集的ssDNA文庫，PCR擴增為雙鏈，送上海生工生物技術有限公司進行DNA序列測定，獲得30條適配子序列。5、適配子序列結構分析采用DNAMAN軟件和RNA Structure4. 2軟件分別對適配子序列進行一級結構和二級結構分析，獲得30條序列的同源性信息和二級結構圖譜。結合一級結構同源性和二級結構將序列分為8個家族，從每個家族中選出I條結構穩(wěn)定，能級較低的序列為代表進行下一步鑒定，共8條。6、適配子與黃曲霉毒素B2親和力和特異性測定6. I適配子親和力分析根據(jù)AFB2-aptamer的一、二級結構特征，把測序得到的所有序列進行分組，從每組中挑選出能級較低，結構較穩(wěn)定的一條序列，送上海生工合成并在其5’端標記生物素。將合成的9條標有生物素的AFB2-aptamer與親和素化的磁珠組裝成適配體探針，用BB分別稀釋成10、20、40、60、80、100、120、150鹽01/1，再在上述不同濃度適配子的溶液中加入AFB2 (應用中的AFB2用甲醇-BB溶解)，使AFB2的最后濃度為1000ng/L，37°C、3000rpm搖床孵育lh，磁分離棄上清，用BB反復沖洗5次，在激發(fā)波長375nm，發(fā)射波長425mm,電壓800V下測磁珠上的熒光強度，平行三次，應用GraphPad Prism5軟件計算各個代表序列的解離常數(shù)Kd值，并繪制各不同濃度適配子對AFB2的飽和曲線，結果如圖2所示。
表I
權利要求
1.ー組特異識別黃曲霉毒素B2的寡核苷酸適配子，其寡核苷酸序列為 1)序列表中序列1、2、3所示的序列； 2)序列表中序列1所示的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失和/或者插入ー個或幾個核苷酸形成的具有序列表中序列1同等功能的序列； 3)序列表中序列2所示的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失和/或者插入ー個或幾個核苷酸形成的具有序列表中序列2同等功能的序列； 4)序列表中序列3所示的核苷酸序列經(jīng)替換、缺失和/或者插入ー個或幾個核苷酸形成的具有序列表中序列3同等功能的序列。
2.權利要求1所述的寡核苷酸適配子在檢測食品中黃曲霉毒素B2方面的應用。
3.根據(jù)權利要求2中所述的應用，其特征在于所述寡核苷酸適配子的5’端或3’端可以經(jīng)過FITC,或FAM,或生物素,或地高辛標記。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組黃曲霉毒素B2的寡核苷酸適配子。通過SELEX技術獲得了能夠特異識別黃曲霉毒素B2的單鏈DNA寡核苷酸適配子，該適配子可以通過熒光素標記等轉為報告適配子用于檢測黃曲霉毒素B2，該適配子序列在準確、快速檢出食品中的黃曲霉毒素B2方面具有廣泛應用前景。
文檔編號C12N15/115GK102952801SQ201210370139
公開日2013年3月6日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權日2012年9月29日
發(fā)明者王周平, 王文鳳, 段諾, 吳世嘉, 夏雨, 馬小媛 申請人:江南大學