專利名稱：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測貝氏柯克斯體的非診斷性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種改進(jìn)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增新方法及其在檢測貝氏柯克斯體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
貝氏柯克斯體又稱伯納特柯克斯體(Coxiella burnetti),俗稱Q熱立克次體,是引起Q熱的病原體，屬于立克次體科、立克次體族、柯克斯體屬，為革蘭陰性小桿菌或球桿菌，能通過細(xì)菌濾器。電鏡觀察，伯納特柯克斯體整個細(xì)胞可分為三部分由微莢膜、細(xì)胞壁和胞質(zhì)膜構(gòu)成的外表層；胞質(zhì)膜內(nèi)的含核糖體顆粒的致密外周層；由染色體細(xì)絲纏繞而成的中央致密體。系統(tǒng)發(fā)育研究表明，貝氏柯克斯體與其他立克次體親緣關(guān)系相距甚遠(yuǎn)，它屬變形菌綱的Y亞群，與肺炎軍團(tuán)菌關(guān)系密切。 貝氏柯克斯體的實(shí)驗(yàn)室檢測常用血清學(xué)診斷和病原體分離，但耗時長、檢出率不高。因此，國內(nèi)外都相繼將聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)用于其實(shí)驗(yàn)室檢測的研究，其方式各有差異。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在必須經(jīng)電泳凝膠成像才可以觀察結(jié)果，或濁度儀顯示的結(jié)果信噪比低的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種具有操作簡單、反應(yīng)快速、耗時短等優(yōu)點(diǎn)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測貝氏柯克斯體的非診斷性方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測貝氏柯克斯體的非診斷性方法，包括根據(jù)貝氏柯克斯體coml基因序列作為靶序列，比對后選取保守區(qū)域，引物設(shè)計(jì)和合成過程中包括兩個外引物和兩個內(nèi)引物的設(shè)計(jì)和合成，內(nèi)引物FIP(上端內(nèi)引物)包含F(xiàn)lc序列和F2(F2c區(qū)域的互補(bǔ)序列)，即5' -Flc-F2;內(nèi)引物BIP (下端內(nèi)引物)包含Blc (BI區(qū)域的互補(bǔ)序列)和B2序列，即5，-B1C-B2。外引物為F3和B3序列，能特異結(jié)合靶序列上的6個特異區(qū)域。第一組靶基因序列及設(shè)計(jì)引物位置5 ' -TCCACCATTATTTAGTCAACCACCCAGAAGTTTTAGTAGAAGTATCCCA
GCATTGCAAAAAAAGACAGA^GCGCAACAAGAAGAACAf F3F2
gctcmcmgcmttamgaamtgcamG^TTATT^^^^
Flc
GGCAATGTTACATTGGTTGAATTTT TTCGATTATCAATGBlcB2
TGGCCA TTGCAAA G￡CMGMEI^rMncAAGC. TATCGTGAAACAAAATAAAAACCTCCGCGTTGTCTTCAAAGAACTGCCCATTTTTGGCGGCCAA-3，。
第二組靶基因序列及設(shè)計(jì)引物位置
5’ -AATACGCTGCCAAA GTATCATTAGCAGCCGCT^AACAAGGAAAATATTA
F3F "I
τγγλγγλγγγγγτγγτγλγτ QJCGACGGCCAATTATCAGATGCTT TCCACGACGCGCTGCTCAGT
__-- Γ I C
ACAAATCACCC τ「C AA ACCGC AG A A A A AGTAGG ,AJ TAAATGTTGCTCAGCTCAAB Ic
AAAAGACATGGATAATCCTGCT 從[[AM·叢AXAACX TTCCAAT
B 2<-
τα「丫1Tf，λ w'm
η -, ‘■ACAGCTAGCAGGCACCCCGACGTTCGTCATTGGTAATAAAGCGTTA-3’。
B j設(shè)計(jì)外引物和內(nèi)引物為下面序列或其全部對應(yīng)的互補(bǔ)序列第一組
F3 S--Gcattgcaaaaaaagacagaaj
B75 -GCTTGAATAACAGAATTCATGG-3 ■
FIP5 -GTGATGCAGGGTCGTTAAATAATTTGCGCAACAAGAAGAACAC-3 ’
BlP5 -C AGTGGCAGGCAATCCTCATTGGCCACATTGATAATCGA-3’_
LUUl 4」 第二組
Γ35GTATCATTAGCAGCCGCTA -3 ’
B'35 : GTAACGATTGAGCTAATTGGA -3
FIPr 5 '-TTGTTCTGATAATTGGCCGTCGA-CAAGGAAAATATTATGCTTTCCAC-3 -BIP_5,- TCAAACCGCAGAAAAAGTAGGAT-CACGCAGTTGTTTTTGGA-/進(jìn)一步，所述外引物、內(nèi)引物優(yōu)選第一組。進(jìn)一步，所述外引物內(nèi)引物=比例范圍為I :Γ 12ο進(jìn)一步,所述外引物:內(nèi)引物=I 8ο進(jìn)一步，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增溫度為58°C 66°C。進(jìn)一步，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增溫度為63°C。進(jìn)一步，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增時間為15分鐘飛O分鐘。進(jìn)一步，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增時間為4(Γ60分鐘。進(jìn)一步，所述非診斷性方法包括步驟①提取基因組DNA :取培養(yǎng)后菌液于EP管，離心，收集后，棄上清，用dH20重懸洗滌細(xì)菌，離心，棄上清，重復(fù)一次，最后用dH20重懸，沸水浴處理裂解細(xì)菌，離心，使細(xì)菌蛋白質(zhì)等雜質(zhì)沉淀于底部，取上清于EP管，上清即成DNA溶液，_20°C冰箱放置備用或采用基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提??；②利用所述外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP、樣品基因組NDA、酶、緩沖液配制25 μ L反應(yīng)體系；③環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。進(jìn)一步，所述25 μ L反應(yīng)體系組分如下
權(quán)利要求
1.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測貝氏柯克斯體的非診斷性方法，其特征在干，該非診斷性方法包括 以貝氏柯克斯體coml基因序列作為靶序列，比對后選取保守區(qū)域，設(shè)計(jì)外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP為下面序列或其全部對應(yīng)的互補(bǔ)序列
2.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述外引物內(nèi)引物=比例范圍為I :4 I 12o
3.如權(quán)利要求2所述的非診斷性方法，其特征在于，所述外引物內(nèi)引物=I:8。
4.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增溫度為58 0C "65 0C ο
5.如權(quán)利要求4所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增溫度為63°C。
6.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增時間為15分鐘 60分鐘。
7.如權(quán)利要求6所述的非診斷性方法，其特征在于，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增時間為60分鐘。
8.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述非診斷性方法包括步驟 ①提取樣品基因組DNA:取培養(yǎng)后菌液于EP管，離心，收集后，棄上清，用dH20重懸洗滌細(xì)菌，離心，棄上清，重復(fù)一次，最后用dH20重懸沸水浴處理裂解細(xì)菌，離心，使細(xì)菌蛋白質(zhì)等雜質(zhì)沉淀于底部，取上清于EP管，上清即成DNA溶液，_20°C冰箱放置備用或使用基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提??； ②利用所述外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP、提取的基因組DNA、酶、緩沖液配制25μ L反應(yīng)體系； ③環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。
9.如權(quán)利要求8所述的非診斷性方法，其特征在于，所述25μ L反應(yīng)體系組分如下
10.如權(quán)利要求8所述的非診斷性方法，其特征在于，所述等溫?cái)U(kuò)增采用恒溫水浴、PCR、Real-time PCR、LC320濁度儀、Geniell，使用儀器GenieII進(jìn)行擴(kuò)增時，試劑中加入SYBR Green I染料再進(jìn)行擴(kuò)增；使用所述熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增時，試劑中加入SYBRGreen I染料，進(jìn)行擴(kuò)增時選用SYBR通道進(jìn)行熒光信號收集；試劑中加入鈣黃綠素進(jìn)行擴(kuò)增時選用FAM通道進(jìn)行熒光信號收集。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測貝氏柯克斯體的非診斷性方法，LAMP方法操作簡單，反應(yīng)快速，在恒溫條件下進(jìn)行1小時完成，耗時短實(shí)現(xiàn)反應(yīng)及產(chǎn)物檢測一步完成，操作簡便，檢測成本低。本發(fā)明為貝氏柯克斯體的檢測提供了新的發(fā)展方向，有望成為簡易的常規(guī)檢測手段，尤其適用于基層檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)，對于提高衛(wèi)生水平、保證人類生命安全和推動衛(wèi)生檢驗(yàn)事業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK102851386SQ20121036774
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者王靜, 楊宇, 楊永莉, 劉麗娟, 趙婷婷, 王旺, 王莎莎 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院