專利名稱：豬肉及其制品中弓形蟲rt-lamp快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種快速檢測肉制品中弓形蟲(7 gondii)的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Reverse Transcription Loop-Mediated IsothermalAmplification, RT-LAMP)檢測方法，具體涉及一種豬肉及其制品中弓形蟲RT-LAMP快速檢測方法。
背景技術(shù)：
弓形蟲病(toxoplasmosis)由剛地弓形蟲)引起的一種人畜共患病，弓形蟲病不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失，還嚴(yán)重威脅著人類的食品衛(wèi)生安全和人類健康。豬肉是人們生活中最主要的動(dòng)物性食品來源，人群可通過攜帶弓形蟲的豬肉、肝臟等 動(dòng)物源性產(chǎn)品而感染，豬弓形蟲病的高發(fā)嚴(yán)重威脅著人類健康，對公共食品安全造成極大危害，目前，弓形蟲的檢測主要依靠血清學(xué)、病原形態(tài)鑒定等傳統(tǒng)方法，然而，這些檢測方法都有不足之處，如檢測時(shí)間長，檢測程序繁瑣，工作量大，很難適應(yīng)現(xiàn)代化食品安全快速檢測的需要，嚴(yán)格的病原體檢測是保障食品安全的重要環(huán)節(jié)，因此亟需建立一種操作簡便、快速準(zhǔn)確、靈敏度和特異性都較高的現(xiàn)代化檢測弓形蟲方法。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(ReverseTranscription Loop-Mediated
Iso thermal Amp I i f i cat i on, RT-LAMP)特點(diǎn)是針對祀基因的8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)6種特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在大約65°C恒溫條件下保溫I小時(shí)左右即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，通過直接觀察擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度即可判斷擴(kuò)增反應(yīng)是否進(jìn)行，具有高特異性、高效性、快速、簡便、易檢測等特點(diǎn)。弓形蟲核糖體RNA (ISsRNA)具有很好的種屬特異性，而且18sRNA占細(xì)胞RNA總數(shù)的80%以上，以弓形蟲18sRNA為目的基金診斷肉制品中弓形蟲可以提高檢測方法的特異性及敏感性，基于ISsRNA的優(yōu)異性，結(jié)合RT-LAMP的快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)，建立以18sRNA為目的基因的RT-LAMP快速檢測方法，從而為肉制品的安全檢測提供有效的手段和研究工具，為動(dòng)物源性食品安全的監(jiān)控及政府決策提供系統(tǒng)、科學(xué)的資料與依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種豬肉及其制品中弓形蟲RT-LAMP快速檢測方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下
步驟(I).樣品前處理
豬肉及其制品取樣25g，加入10倍豬肉及其制品體積的滅菌蒸餾水中，用組織勻漿機(jī)均質(zhì)I min,制成組織勻楽；樣品；
步驟(2).弓形蟲RNA提取
取組織勻漿樣品轉(zhuǎn)移到離心管后，加入Trizol試劑，其中組織勻漿樣品與Trizol試劑的體積含量比為1:10，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心5 min，取上清液至新的離心管中，加入200 μ 氯仿，蓋上離心管蓋，充分混合至溶液呈乳白狀后，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，取上清液至新的離心管中，加入與該上清液等體積的異丙醇，充分混合后，常溫靜置10 min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，棄掉上清液，加入I ml體積含量為75%的乙醇洗滌離心管壁，在轉(zhuǎn)速12000 rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min后，取沉淀物；常溫下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；
將RNA提取物采用核酸蛋白檢測儀測定模板DNA的濃度與純度；
步驟(3). RT-LAMP擴(kuò)增
將RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，置于65°C水浴鍋中反應(yīng)I h后，置于80°C水浴鍋中2 min滅活Bst DNA聚合酶，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
所述的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制劑，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, O. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜堿，1.0μ I的反轉(zhuǎn)錄酶，1.0μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物組成；
步驟(4).擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測
反應(yīng)結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混勻后置于桌面上拍照并肉眼觀察結(jié)果；顏色變?yōu)榫G色為陽性，說明有弓形蟲感染，橙色則為陰性，說明無弓形蟲感染；或取擴(kuò)增產(chǎn)物2 3 yL，于2.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，有梯形條帶為陽性，說明有弓形蟲感染，無條帶則為陰性，說明無弓形蟲感染。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明進(jìn)行了反應(yīng)的特異性驗(yàn)證和靈敏度檢驗(yàn)，證明了引物設(shè)計(jì)的種間特異性和種內(nèi)保守性，確保該反應(yīng)能特異性檢測出目標(biāo)病原體，而避免假陽性的出現(xiàn)；同時(shí)確認(rèn)了該方法可以檢測出至少I個(gè)弓形蟲速殖子。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明作進(jìn)一步的分析。實(shí)施例I
步驟(I).樣品前處理
取可疑病豬肉25g，加入10倍可疑病豬肉體積的滅菌蒸餾水中，用組織勻漿機(jī)均質(zhì)Imin,制成組織勻楽；樣品；
步驟(2).弓形蟲RNA提取
取組織勻漿樣品轉(zhuǎn)移到離心管后，加入Trizol試劑，其中組織勻漿樣品與Trizol試劑的體積含量比為1:10，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心5 min，取上清液至新的離心管中，加入200 μ 氯仿，蓋上離心管蓋，充分混合至溶液呈乳白狀后，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，取上清液至新的離心管中，加入與該上清液等體積的異丙醇，充分混合后，常溫靜置10 min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，棄掉上清液，加入I ml體積含量為75%的乙醇洗滌離心管壁，在轉(zhuǎn)速12000 rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min后，取沉淀物；常溫下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；
將RNA提取物采用核酸蛋白檢測儀測定模板DNA的濃度與純度；
步驟(3). RT-LAMP擴(kuò)增
將RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，置于65°C水浴鍋中反應(yīng)I h后，置于80°C水浴鍋中2 min滅活Bst DNA聚合酶，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
所述的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制劑，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, O. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜堿，I. O μ I的反轉(zhuǎn)錄酶，I. O μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物組成；·
步驟(4).擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測
反應(yīng)結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中直接加入IyL的SYBR Green I染料，混勻后置于桌面上，顏色變?yōu)榫G色為陽性，說明有弓形蟲感染；取擴(kuò)增產(chǎn)物3 μ L，于2.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察，有梯形條帶為陽性，說明有弓形蟲感染。實(shí)施例2
步驟(I).樣品前處理
取合格豬肉25 g，加入10倍可疑病豬肉體積的滅菌蒸餾水中，用組織勻漿機(jī)均質(zhì)Imin,制成組織勻楽；樣品；
步驟(2).弓形蟲RNA提取
取組織勻漿樣品轉(zhuǎn)移到離心管后，加入Trizol試劑，其中組織勻漿樣品與Trizol試劑的體積含量比為1:10，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心5 min，取上清液至新的離心管中，加入200 μ 氯仿，蓋上離心管蓋，充分混合至溶液呈乳白狀后，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，取上清液至新的離心管中，加入與該上清液等體積的異丙醇，充分混合后，常溫靜置10 min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，棄掉上清液，加入I ml體積含量為75%的乙醇洗滌離心管壁，在轉(zhuǎn)速12000 rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min后，取沉淀物；常溫下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；
將RNA提取物采用核酸蛋白檢測儀測定模板DNA的濃度與純度；
步驟(3). RT-LAMP擴(kuò)增
將RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，置于65°C水浴鍋中反應(yīng)I h后，置于80°C水浴鍋中2 min滅活Bst DNA聚合酶，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
所述的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制劑，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, 0. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜堿，I. 0μ I的反轉(zhuǎn)錄酶，I. 0μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物組成；步驟(4).擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測
反應(yīng)結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混勻后置于桌面上拍照并肉眼觀察結(jié)果；顏色呈橙色則為陰性，說明無弓形蟲感染；或取擴(kuò)增產(chǎn)物2 yL，于2. 0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，無梯形條帶則為陰性，說明無弓形蟲感染。實(shí)施例3
步驟(I).樣品前處理
取樣可疑豬肝25 g，加入10倍豬肝體積的滅菌蒸餾水中，用組織勻漿機(jī)均質(zhì)I min，制成組織勻漿樣品；
步驟(2).弓形蟲RNA提取
取組織勻漿樣品轉(zhuǎn)移到離心管后，加入Trizol試劑，其中組織勻漿樣品與Trizol試劑的體積含量比為1:10，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心5 min，取上清液至新的離心管中，加入200 μ 氯仿，蓋上離心管蓋，充分混合至溶液呈乳白狀后，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，取上清液至新的離心管中，加入與該上清液等體積的異丙醇，充分混合后，常溫靜置10 min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，棄掉上清液，加入I ml體積含量為75%的乙醇洗滌離心管壁，在轉(zhuǎn)速12000 rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min后，取沉淀物；常溫下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；
將RNA提取物采用核酸蛋白檢測儀測定模板DNA的濃度與純度；
步驟(3). RT-LAMP擴(kuò)增
將RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，置于65°C水浴鍋中反應(yīng)I h后，置于80°C水浴鍋中2 min滅活Bst DNA聚合酶，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
所述的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制劑，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, O. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜堿，I. 0μ I的反轉(zhuǎn)錄酶，I. 0μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物組成；
步驟(4).擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測
反應(yīng)結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混勻后置于桌面上拍照并肉眼觀察結(jié)果；顏色呈綠色為陽性，說明有弓形蟲感染，或取擴(kuò)增產(chǎn)物2 yL，于2.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，有梯形條帶為陽性，說明有弓形蟲感染。實(shí)施例4
步驟(I).樣品前處理
取樣合格豬肝25 g，加入10倍豬肝體積的滅菌蒸餾水中，用組織勻漿機(jī)均質(zhì)I min，制成組織勻漿樣品；
步驟(2).弓形蟲RNA提取
取組織勻漿樣品轉(zhuǎn)移到離心管后，加入Trizol試劑，其中組織勻漿樣品與Trizol試劑的體積含量比為1:10，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心5 min，取上清液至新的離心管中，加入200 μ 氯仿，蓋上離心管蓋，充分混合至溶液呈乳白狀后，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，取上清液至新的離心管中，加入與該上清液等體積的異丙醇，充分混合后，常溫靜置10 min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，棄掉上清液，加入I ml體積含量為75%的乙醇洗滌離心管壁，在轉(zhuǎn)速12000 rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min后，取沉淀物；常溫下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；
將RNA提取物采用核酸蛋白檢測儀測定模板DNA的濃度與純度；
步驟(3). RT-LAMP擴(kuò)增
將RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，置于65°C水浴鍋中反應(yīng)I h后，置于80°C水浴 鍋中2 min滅活Bst DNA聚合酶，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
所述的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制劑，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, O. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜堿，I. 0μ I的反轉(zhuǎn)錄酶，I. 0μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物組成；
步驟(4).擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測
反應(yīng)結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混勻后置于桌面上拍照并肉眼觀察結(jié)果；顏色呈橙色則為陰性，說明無弓形蟲感染；或取擴(kuò)增產(chǎn)物2 yL，于2. 0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，無梯形條帶則為陰性，說明無弓形蟲感染。實(shí)施例5
步驟(I).樣品前處理
取樣可疑肉丸25 g,加入10倍肉丸體積的滅菌蒸懼水中，用組織勻衆(zhòng)機(jī)均質(zhì)I min,制成組織勻漿樣品；
步驟(2).弓形蟲RNA提取
取組織勻漿樣品轉(zhuǎn)移到離心管后，加入Trizol試劑，其中組織勻漿樣品與Trizol試劑的體積含量比為1:10，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心5 min，取上清液至新的離心管中，加入200 μ 氯仿，蓋上離心管蓋，充分混合至溶液呈乳白狀后，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，取上清液至新的離心管中，加入與該上清液等體積的異丙醇，充分混合后，常溫靜置10 min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，棄掉上清液，加入I ml體積含量為75%的乙醇洗滌離心管壁，在轉(zhuǎn)速12000 rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min后，取沉淀物；常溫下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；
將RNA提取物采用核酸蛋白檢測儀測定模板DNA的濃度與純度；
步驟(3). RT-LAMP擴(kuò)增
將RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，置于65°C水浴鍋中反應(yīng)I h后，置于80°C水浴鍋中2 min滅活Bst DNA聚合酶，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；所述的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制劑，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, O. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜堿，I. 0μ I的反轉(zhuǎn)錄酶，I. 0μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物組成；
步驟(4).擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測
反應(yīng)結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混勻后置于桌面上拍照并肉眼觀察結(jié)果；顏色呈綠色為陽性，說明有弓形蟲感染，或取擴(kuò)增產(chǎn)物2 μ L，于2. 0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，有梯形條帶為陽性，說明有弓形蟲感染。實(shí)施例6
步驟(I).樣品前處理
取樣合格肉丸25 g,加入10倍肉丸體積的滅菌蒸懼水中,用組織勻衆(zhòng)機(jī)均質(zhì)I min,制成組織勻漿樣品；
步驟(2).弓形蟲RNA提取
取組織勻漿樣品轉(zhuǎn)移到離心管后，加入Trizol試劑，其中組織勻漿樣品與Trizol試劑的體積含量比為1:10，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心5 min，取上清液至新的離心管中，加入200 μ 氯仿，蓋上離心管蓋，充分混合至溶液呈乳白狀后，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，取上清液至新的離心管中，加入與該上清液等體積的異丙醇，充分混合后，常溫靜置10 min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，棄掉上清液，加入I ml體積含量為75%的乙醇洗滌離心管壁，在轉(zhuǎn)速12000 rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min后，取沉淀物；常溫下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；
將RNA提取物采用核酸蛋白檢測儀測定模板DNA的濃度與純度；
步驟(3). RT-LAMP擴(kuò)增
將RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，置于65°C水浴鍋中反應(yīng)I h后，置于80°C水浴鍋中2 min滅活Bst DNA聚合酶，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
所述的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制劑，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, 0. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜堿，I. O μ I的反轉(zhuǎn)錄酶，I. O μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物組成；
步驟(4).擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測
反應(yīng)結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混勻后置于桌面上拍照并肉眼觀察結(jié)果；顏色呈橙色則為陰性，說明無弓形蟲感染；或取擴(kuò)增產(chǎn)物2 yL，于2. 0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，無梯形條帶則為陰性，說明無弓形蟲感染。
上述所述的卩3、83、卩1卩、81卩、1^、1^引物如表I所示。表I
權(quán)利要求
1.豬肉及其制品中弓形蟲RT-LAMP快速檢測方法，其特征在于該方法包括以下步驟 步驟(I).樣品前處理 豬肉及其制品取樣25g，加入10倍豬肉及其制品體積的滅菌蒸餾水中，用組織勻漿機(jī)均質(zhì)I min,制成組織勻楽；樣品； 步驟(2).弓形蟲RNA提取 取組織勻漿樣品轉(zhuǎn)移到離心管后，加入Trizol試劑，其中組織勻漿樣品與Trizol試劑的體積含量比為1:10，常溫靜置511^11;在轉(zhuǎn)速12000印111，溫度為4 °C條件下離心5 min，取上清液至新的離心管中，加入200 μ 氯仿，蓋上離心管蓋，充分混合至溶液呈乳白狀后，常溫靜置5min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，取上清液至新的離心管中，加入與該上清液等體積的異丙醇，充分混合后，常溫靜置10 min ;在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min，棄掉上清液，加入I ml體積含量為75%的乙醇洗滌離心管壁，在轉(zhuǎn)速12000 rpm，溫度為4 °C條件下離心10 min后，取沉淀物；常溫下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物； 將RNA提取物采用核酸蛋白檢測儀測定模板DNA的濃度與純度； 步驟(3). RT-LAMP擴(kuò)增 將RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，置于65°C水浴鍋中反應(yīng)I h后，置于80°C水浴鍋中2 min滅活Bst DNA聚合酶，得到擴(kuò)增產(chǎn)物； 所述的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制劑，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, O. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜堿，I. O μ I的反轉(zhuǎn)錄酶，I. O μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物組成； 步驟(4).擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測 反應(yīng)結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混勻后置于桌面上拍照并肉眼觀察結(jié)果；顏色變?yōu)榫G色為陽性，說明有弓形蟲感染，橙色則為陰性，說明無弓形蟲感染；或取擴(kuò)增產(chǎn)物2 3 yL，于2.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，有梯形條帶為陽性，說明有弓形蟲感染，無條帶則為陰性，說明無弓形蟲感染。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種豬肉及其制品中弓形蟲RT-LAMP快速檢測方法?，F(xiàn)有技術(shù)中檢測時(shí)間長且繁瑣，工作量大，很難適應(yīng)現(xiàn)代化食品安全快速檢測的需要。本發(fā)明取樣加入Trizol試劑，離心取上清液加入200μl氯仿，充分混合離心后取上清液，加入與該上清液等體積的異丙醇，離心后加入1ml體積含量為75%的乙醇，離心后干燥沉淀物，加入20μlRNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；將RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體滅活BstDNA聚合酶，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；加入1μL的SYBRGreenⅠ染料，或于2.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。本發(fā)明具有較高的特異性和靈敏度，且避免假陽性的出現(xiàn)。
文檔編號C12Q1/68GK102899410SQ20121035740
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者曲道峰, 韓劍眾, 陶斯悅, 鄭柏玲, 蘇春雷, 杜愛芳, 池娜 申請人:浙江工商大學(xué)