專利名稱：運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因epo熒光檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因EPO熒光檢測試劑盒及檢測方法，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組計(jì)劃的完成，后基因組計(jì)劃的全面展開，以基因工程為主導(dǎo)的生物技術(shù)在體育運(yùn)動問題領(lǐng)域的應(yīng)用得到廣泛的關(guān)注?；蜻z傳工程應(yīng)用于運(yùn)動員選材是歷史必然、大勢所趨，它必將從根本上引起運(yùn)動選材理論和方法的革命。運(yùn)用遺傳學(xué)的理論和方法進(jìn)行運(yùn)動選材已經(jīng)有了初步進(jìn)展。促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因作用于紅骨髄造血干細(xì)胞，促使干細(xì)胞分裂、分化，生成紅細(xì)胞的過程稱為“促紅細(xì)胞生成”，這是機(jī)體產(chǎn)生新生紅細(xì)胞的唯一途徑。EPO對人體生理作用是這樣的重要，以至于20年前就把它作為第一個(gè)造血因子來克隆用于臨床治療。重組人促紅細(xì)胞生成素(EPO)已為人們所熟知。也就是把人體紅細(xì)胞生成素基因轉(zhuǎn)移到動物細(xì)胞中，増加了其體內(nèi)的血紅細(xì)胞數(shù)量和促紅細(xì)胞生成素濃度。EPO能通過增加人的最大攝氧量而增加人的有氧耐力，可見是醫(yī)學(xué)技術(shù)促進(jìn)了把EPO作為興奮劑用于有氧耐カ型項(xiàng)目?？梢源蟠髩埣尤梭w血紅細(xì)胞的變異基因現(xiàn)在已經(jīng)找到。人類在低氧環(huán)境下產(chǎn)生的適應(yīng)性生理性變化存在明顯個(gè)體差異性。有報(bào)道指出，在模擬海抜2800m低氧暴露24h血清促紅細(xì)胞生成素濃度變化存在明顯的不同(-41% — 400%)。部分長跑選手進(jìn)行低氧訓(xùn)練研究發(fā)現(xiàn)，訓(xùn)練后最大攝氧量(V02max)的變化從-3. 2到18. 7ml/(min · kg)不等。EPO能促進(jìn)紅細(xì)胞釋放進(jìn)入血液，最終減輕低氧對機(jī)體的損傷，因此EPO基因序列多態(tài)性可能與不同個(gè)體間對低氧適應(yīng)性具有差異性。針對位于人類EPO基因全序列第3541bp處，在EPO基因3 ‘端增強(qiáng)子上，ー個(gè)T/G單核苷酸多態(tài)性，即SNP/T3541G的研究表明，在EPO基因T3541G位點(diǎn)的三種基因型TT型、TG型、GG型中，攜帯T等位基因的人群低氧適應(yīng)能力較GG型更強(qiáng)。目前常用的基因檢測方法有直接測序(direct sequencing, DS)、連接酶檢測反應(yīng)(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段長度多態(tài)性分析(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)> 變性高效液相色譜分析(denaturing highperformance liquid chromotography,DHPLC)、定量PCR。這些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁瑣、結(jié)果不易判讀、重復(fù)性差、假陰性假陽性多等問題。采用熒光標(biāo)記技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)，通過帶不同熒光標(biāo)記物的引物對運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因EPO特異性的擴(kuò)增，而后經(jīng)毛細(xì)管電泳后分析PCR產(chǎn)物出峰情況，即可實(shí)現(xiàn)對該運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因位點(diǎn)的檢測，靈敏度高、判讀清晰準(zhǔn)確、采樣方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因EPO熒光檢測試劑盒及檢測方法。本發(fā)明所述的檢測運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因EPO熒光檢測試劑盒，包括擴(kuò)增試劑和擴(kuò)增后的基因分型用試劑；所述擴(kuò)增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，引物混合物以及超純水；所述擴(kuò)增后試劑包括內(nèi)標(biāo)和用于基因分型的基因分型標(biāo)準(zhǔn)物；使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件PCR擴(kuò)增體系的pH值為8. 0-9. 0，鎂離子濃度為I. 5-3. 5mM，4種dNTP的終濃度各為200-300 μ Μ, Taq酶的用量為O. 1-0. 4U/μ L，引物終濃度為O. 2-0. 4 μ M0用于EPO基因檢測的引物為 SEQ NO. I :5’ -CAT CAG CCG AAG AGA CCA AAG Α-3，；SEQ NO. 2 :5’ -GTAAGCC TAC GCT GGT CAA TAA GGT GG-3’SEQ NO. 3 :5’ -GCC TAC GCT GGT CAA TAA GGT GT-3，；所述的引物中SEQ NO. I的5’端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記，內(nèi)標(biāo)所用的熒光染料為不同
的熒光素。所述擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測。采用所述試劑盒應(yīng)用于運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因檢測的方法，是通過熒光引物PCR及毛細(xì)管電泳特異性檢測運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因EPO ;用于EPO檢測的引物為SEQ NO. USEQ NO. 2、SEQ NO. 3，所述基因的擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測。其中所檢測的人基因組DNA為使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法對來源樣本進(jìn)行處理得到的DNA ;所述的來源樣本為來源于人類的濾紙片血斑/ 口腔拭子樣本、FTA卡血斑/ 口腔拭子樣本、口腔拭子樣本、血液。使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增階段反應(yīng)在任何型號的PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序:94-980C l-5min ;26_32 個(gè)循環(huán)的 94-98°C 15_60s，55-65 °C 15_60s，72°C 15_60s ；60 °C 30-60min。本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明以EPO基因?yàn)闄z測對象，通過PCR擴(kuò)增，毛細(xì)管電泳檢測，與基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的對比，即可進(jìn)行基因分型，篩選出具有特定基因型的個(gè)體，為體育選材提供參考。在體育選材方面首次采用了熒光標(biāo)記技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)實(shí)現(xiàn)對運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因的高靈敏度特異性檢測，節(jié)約了人力物力和時(shí)間。


圖I是本發(fā)明的試劑盒對71-2號樣本EPO基因DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明的試劑盒對73-4號樣本EPO基因DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明的試劑盒對83號樣本EPO基因DNA擴(kuò)增后的分型結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)ー步描述。實(shí)施例I本發(fā)明的試劑盒檢測40個(gè)不同個(gè)體的DNA樣本。用于運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因檢測的引物采用藍(lán)色熒光染料標(biāo)記，內(nèi)標(biāo)采用紅色熒光染料標(biāo)記。I、待測樣本40份，下文列舉的是不同基因型個(gè)體3份的結(jié)果。相關(guān)樣本都已經(jīng)使用“DNA提取-PCR擴(kuò)增-測序”的技術(shù)方法對EPO進(jìn)行過測序檢測。其中，71_2號、73_4號、83號樣本的分型結(jié)果依次為T/G、T/T、G/G。2、檢材的基因組DNA提取Chelex提取法剪下I 3mm血斑置于I. 5mL離心管中，加入SdH2OlmL,振蕩離心，棄上清液，重復(fù)步驟兩次，棄上清液，將5%Chelex-100震蕩懸浮后快速用剪掉的槍頭吸取200 μ L加入離心管中，振蕩數(shù)秒，。于56°C水浴保溫30min后，振蕩數(shù)秒。95°C沸水浴IOmin,輕微振蕩數(shù)秒。2000rpm離心5min,上清中為提取的DNA。3、擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測分析3. IPCR 擴(kuò)增體系
權(quán)利要求
1.一種運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因EPO熒光檢測試劑盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其緩沖溶液、擴(kuò)增各基因的引物、內(nèi)標(biāo)及基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于 用于EPO基因檢測的引物為SEQ NO. I :5’ -CAT CAG CCG AAG AGA CCA AAG A-3’SEQ NO. 2 :5’ -GTAAGCC TAC GCT GGT CAA TAA GGT GG-3’SEQ NO. 3 :5’ -GCC TAC GCT GGT CAA TAA GGT GT-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述的用于EPO基因擴(kuò)增的引物，其中，引物SEQ NO. I的5’端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記，內(nèi)標(biāo)選用不同于上述的熒光染料標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述EPO基因的擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測。
5.一種采用權(quán)利要求I所述試劑盒應(yīng)用于運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因檢測的方法，其特征在于通過熒光引物PCR及毛細(xì)管電泳特異性檢測運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因EPO ;用于EPO檢測的引物為SEQ NO. USEQ NO. 2,SEQ NO. 3，所述基因的擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來實(shí)現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因EPO熒光檢測試劑盒及檢測方法，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括擴(kuò)增前試劑和擴(kuò)增后試劑；所述擴(kuò)增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應(yīng)混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴(kuò)增EPO基因熱點(diǎn)突變的引物混合物；所述擴(kuò)增后試劑包括基因分型標(biāo)準(zhǔn)物和內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明以上述基因?yàn)闄z測對象，通過PCR擴(kuò)增，毛細(xì)管電泳檢測，與基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的對比，即可進(jìn)行基因分型，篩選出具有特定基因型的個(gè)體，為體育選材提供參考。在體育選材方面首次采用了熒光標(biāo)記技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)實(shí)現(xiàn)對運(yùn)動機(jī)能相關(guān)基因的高靈敏度特異性檢測，節(jié)約了人力物力和時(shí)間。
文檔編號C12Q1/68GK102816853SQ20121031561
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者步迅, 夏子芳 申請人:山東百?；蚩萍加邢薰? 步迅, 夏子芳, 田雪文, 張全芳