專利名稱：黃鱔芳香化酶保守區(qū)的原核表達載體pMAL-Arom19及其構建方法和應用方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領域，具體涉及一種高效表達黃鱔芳香化酶保守區(qū)蛋白(Aroml9)的原核表達載體pMAL_Aroml9及其構建方法，以及在Aroml9保守區(qū)蛋白的原核表達和制備抗Aroml9多克隆抗體中的應用，及其具體應用方法。
背景技術：
芳香化酶(Aromatase 19，Aroml9)是類固醇激素代謝中的一種重要酶類，屬于細胞色素P450家族中的一員，廣泛存在于大多數脊椎動物的腦和垂體中，它可催化某些雄激素轉化為雌激素，是雌激素生物合成中的關鍵酶和限速酶。研究表明，芳香化酶可以影響哺乳動物中樞神經系統(tǒng)的功能和發(fā)育，調節(jié)神經內分泌和繁殖功能以及性行為，并參與非哺乳動物性腺分化的調控，很多實驗已證實芳香化酶可控制多種魚類的性別分化和性別轉 化。迄今為止，已從虹鱒、鯽、斑馬魚、日本鰻鱺等淡水硬骨魚和牙鲆、歐洲舌齒鱸等海水硬骨魚類的卵巢中克隆出性腺芳香化酶基因，甚至軟骨魚類大西洋中的芳香化酶基因也被克隆。此外，在金魚、斑馬魚、虹鱒等魚類中已克隆出芳香化酶基因的第二種形式一腦芳香化酶，舌齒鱸腦中較低的芳香化酶活性也暗示著在這種魚可能也存在著芳香化酶的第二種基因形式。Andersen與Riley等研究了抗虹鱒Aroml9的免疫接種,提出了一種有望控制魚類性成熟的方法，認為免疫抑制技術在控制虹鱒生殖方面有一定的應用潛力。黃鱔(Monopterus albus),俗稱鱔魚,屬于硬骨魚綱、合觸目、合觸科、黃鱔屬，廣泛存在于亞洲地區(qū)，中國僅產I種。其體型細，形狀似蛇或鰻，營養(yǎng)價值極高。在黃鱔的生活史中存在著特殊的生殖發(fā)育現(xiàn)象——自然性逆轉。研究表明，第一次性成熟發(fā)育周期內黃鱔為雌性發(fā)育，雌性性成熟產卵后，生殖腺內卵細胞敗育，卵巢結構逐步退化，同時雄性生殖細胞開始發(fā)育，通過雌雄間性階段過渡到雄性發(fā)育。黃鱔性逆轉在基因水平上的調控以及性別決定基因一直是研究者們關注的熱點，而性別決定又是一個涉及進化時空的多基因活動的復雜調控過程。因此對性激素具有調節(jié)作用的芳香化酶研究具有一定的生產意義。高效表達芳香化酶基因的重組載體的制備可以高效獲取重組蛋白，可以滿足其在魚類人工繁殖中的運用，同時制備的抗體在現(xiàn)有研究中還未見有報道。

發(fā)明內容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種Aroml9的原核表達載體pMAL- Aroml9,該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點RBS和Aroml9基因保守區(qū)序列及一個麥芽糖結合蛋白標簽；利用該載體轉化大腸桿菌，可實現(xiàn)Aroml9蛋白的高水平表達，表達的重組蛋白質以可溶性形式存在于上清中(占大腸桿菌可溶性總蛋白43. 8%)，通過親和層析純化很容易獲得高純度的重組蛋白質，用于蛋白質的制備。純化Aroml9蛋白的操作相當簡單，成本也不高，極易重復使用。技術方案為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案
本發(fā)明提供一種黃鱔芳香化酶保守區(qū)的原核表達載體pMAL_Aroml9，該載體由表達載體pMAL-c2x構建而得，含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點PBS、Aroml9基因保守區(qū)序列及一個麥芽糖結合蛋白標簽序列。作為本發(fā)明一種方案，所述載體中的Aroml9來源于黃鱔。進一步說明所述原核表達載體pMAL-Aroml9,其特征在于所述Aroml9基因的上游有T7啟動子和細菌核糖體結合位點RBS，T7啟動子的下游有可被IPTG誘導的操作子序列，緊靠Aroml9基因的起始密碼子上游還有一個麥芽糖結合蛋白標簽序列。本發(fā)明還提供所述的原核表達載體pMAL_Aroml9的構建方法,包括如下步驟(I)從GenBank中查找黃鱔Aroml9的全長基因序列，并米用Primer5. O設ii 對特異性引物上游引物I: 5’- CAGTGTGTGTTGGAGATGGTGA-3'下游引物2: 5’- TTCATCATCACCATGGCAATGT -3'以提取自黃鱔的腦總RNA為模板進行反轉錄合成第一鏈cDNA，以反轉錄產物為模板及合成的上下游引物進行PCR擴增，反應條件為94 °C預變性3min，94 °C變性30s，58 °C退火 45s, 72°C延伸 lmin, 30 個循環(huán)，72°C延伸 7min ；(2) PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用凝膠回收試劑盒回收，將回收產物與pMD18-T載體，16 °C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌JM109，隨機挑取細菌，提取質粒后用EcoR I、Hind III雙酶切初步鑒定后，將陽性克隆進行DNA測序，測序結果用生物軟件DNAstar、CLUSTAL X 等進行分析；(3)將陽性質粒和原核表達質粒pMAL-C2X分別用EcoR I、Hind III 37°C雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收Aroml9片段和線性化pMAL質粒,按照T4 DNA連接酶的說明書設計連接反應體系，構建表達質粒pMAL-Aroml9，并轉化大腸桿菌JM109，篩選陽性克隆，隨機挑取1-2個克隆進行酶切鑒定，獲得黃鱔芳香化酶保守區(qū)的原核表達載體pMAL-Aroml9。本發(fā)明還提供所述的原核表達載體pMAL-Aroml9在制備Aroml9抗體的抗原中的應用。本發(fā)明同時提供所述的原核表達載體pMAL-Aroml9在制備Aroml9重組蛋白中的應用，其具體應用方法如下(I)將pMAL_Aroml9轉化大腸桿菌TBl,挑取陽性克隆接種含50 μ g/mL的氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖振培養(yǎng)過夜；(2)取培養(yǎng)菌液以1/10的比例接種于新鮮的含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，分別以O. 5、lmol/L濃度的IPTG誘導，37°C搖振培養(yǎng)4h后，收集菌體，加入溶菌酶至終濃度為lmg/mL,冰浴 30min ；(3)加入DNA酶和RNA酶至終濃度為5 μ g/mL, 4°C孵育10 min ;所得產物9000g離心30 min，將上清轉移備用，上清即為表達的融合蛋白；(4)將上清蛋白質上樣于平衡緩沖液平衡好的Amylose_sepharoml9se親和柱中，其中所述平衡緩沖液為 20mmol/LTris-HCL, 200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, pH7. 4 ；(5)用緩沖液平衡至基線后，開始用洗脫緩沖液，所述洗脫緩沖液為平衡緩沖液，再加lOmmol/L麥芽糖，洗脫液中即為純化后的融合蛋白；(6 )最后SDS-PAGE電泳檢測；在純化好的蛋白中加入Factor Xa至終濃度為200 μ g/mL,室溫作用4h,同上過Amylose- sepharomse親和柱,用平衡緩沖液洗脫下的即為Aroml9蛋白。有益效果與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果I、本發(fā)明構建的黃鱔Aroml9基因保守區(qū)片段的原核表達載體能高效的表達目的蛋白，并滿足相關實驗的需要。2、用重組蛋白免疫小鼠制備的多克隆抗血清具有較高的效價，特異性也較好；該抗體能特異性的與黃鱔Aroml9保守區(qū)蛋白反應,具有較高的抗體效價。 3、本發(fā)明中Aroml9蛋白高效價抗體的成功制備表明Aroml9保守區(qū)蛋白具有較強的免疫原性，能夠刺激機體產生免疫應答，為調控黃鱔性逆轉的研究提供了一個新的方法。


圖I Aroml9基因的TA克隆策略；圖 2 黃鱔 Aroml9 基因的檢測，M: DNAmarker; I: Product of RT-PCR ;圖3 重組質粒pMD18-T-Aroml9的限制性酶切分析，M:DNA分子量標記I :pMD18-T-Aroml9 經 EcoRI 和 Hind III雙酶切；圖4鑒定大腸桿菌中Aroml9融合蛋白的SDS-PAGE分析,M:蛋白質分子量標記；I: TBl/pMAL-Aroml9 經 O. 3M IPTG 誘導 4h 后表達的 MBP_Aroml9 蛋白；2: TBl/pMAL 經 O. 3MIPTG誘導4h后產生的MBP蛋白；3: E. coli TBl。
具體實施例方式試劑與儀器設備試劑主要為分子生物學試劑，TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、AMV反轉錄試劑盒、凝膠回收試劑盒、EcoR I、Hind III等為大連寶生物公司產品；聚丙烯酰胺、RNase抑制劑等購自上海生工生物工程公司；Factor Xa、Amylose-sepharomrose柱、抗麥芽糖結合蛋白(MBP)單抗均購自紐英倫生物技術(北京)公司；其他生化試劑均為國產分析純。弗氏完全、不完全佐劑，ELISA反應板等均購自上海申能博彩生物有限公司。儀器PCR儀購自BioRad公司，實驗結果記錄和蛋白分析使用的是柯達公司的凝膠成像系統(tǒng)，DNA序列分析使用DNAstar軟件，全自動測序工作由上海生工生物工程公司完成，酶標測定儀購自TECAN公司。所有引物和DNA序列均在上海生工生物工程公司合成。本發(fā)明實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例I Aroml9保守區(qū)基因的擴增與TA克隆Aroml9基因的擴增及TA克隆的策略如圖I所示，首先從GenBanK中查找Aroml9的全長基因序列(GenBanK號EU840259. I),采用Primer5. O設計了一對特異性引物上游引物I :5’_ CAGTGTGTGTTGGAGATGGTGA-3'下游引物2:5’- TTCATCATCACCATGGCAATGT -3'反轉錄引物AP購自上海生工生物工程公司。采用RNA抽提試劑盒提取黃鱔(購自無錫中橋菜市場)腦總RNA進行純度鑒定后合成第一鏈cDNA，以反轉錄產物為模板及合成的上下游引物進行PCR擴增，反應條件為94°C預變性3 min，94°C預變性30s，58°C退火45s，72°C延伸lmin，30個循環(huán)，72°C延伸5 min。PCR產物的克隆與鑒定PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用凝膠回收試劑盒回收，將回收產物與PMD18-T載體連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌JM109，隨機挑取細菌，提取質粒后用EcoR I、HindIII雙酶切初步鑒定后，將陽性克隆送交上海生工進行DNA測序。測序結果用DNAstar、CLUSTAL X等軟件進行分析。實驗結果表明擴增到了預期大小即約639bp的目的cDNA片段(見圖2)，將其進行BLAST檢索，進行同源性比對，結果表明其同源性為94%。實施例2原核表達載體pMAL_Aroml9的構建在用實施例I中方法獲得正確的Aroml9保守區(qū)序列后將其和原核表達質粒pMAL分別用EcoR I ,Hind III37°C雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收Aroml9片段和線性化pMAL質粒，按照T4 DNA連接酶的說明書設計連接反應體系,構建表達質粒pMAL- Aroml9(見圖2), 并轉化大腸桿菌JM109，篩選陽性克隆，隨機挑取10個克隆提取質粒，提取的質粒經EcoR I和Hind III雙酶切鑒定，酶切結果表明pMAL-Aroml9酶切后有一條約639 bp的條帶(見圖3)，說明Aroml9成功克隆入T載體中，將重組質粒pMAL_Aroml9送測序公司測序，測序結果表明成功的將Aroml9 cDNA克隆到表達載體中。實施例3黃鱔芳香化酶保守區(qū)的原核表達載體pMAL-Aroml9用實施例2所述方法構建的黃鱔芳香化酶保守區(qū)的原核表達載體pMAL-Aroml9，其特征為由表達載體pMAL-c2x構建而得，該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點PBS、Aroml9基因保守區(qū)序列及一個麥芽糖結合蛋白標簽序列。進一步說明所述原核表達載體pMAL-Aroml9,其特征在于所述Aroml9基因的上游有T7啟動子和細菌核糖體結合位點RBS，T7啟動子的下游有可被IPTG誘導的操作子序列，緊靠Aroml9基因的起始密碼子上游還有一個麥芽糖結合蛋白標簽序列。實施例4重組Aroml9蛋白的表達與鑒定將pMAL-Aroml9轉化大腸桿菌TBl，挑取陽性克隆接種含50 μ g/mL的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖振培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)菌液以1/10的比例接種于新鮮的含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，分別以O. 5、I mo I/L濃度的IPTG誘導，37°C搖振培養(yǎng)4h后，收集菌體，重懸于100 μ L SDS-PAGE上樣緩沖液中，離心后加上樣緩沖液煮沸破碎細胞，參照《分子克隆》及試劑手冊進行12%濃度的SDS-PAGE電泳(見圖4)鑒定蛋白的表達量。由圖4可知，加入IPTG誘導后，轉入載體pMAL的細菌總蛋白提取物中出現(xiàn)了分子量約為42kD的蛋白條帶(圖4泳道2中)，而轉入重組質粒的細菌總蛋白提取物中出現(xiàn)了新的蛋白質，分子量約為65. 6kD (圖4泳道I中)。由于pMAL表達質粒本身可編碼42. 5kD的麥芽糖結合蛋白(Maltosebinding protein, MBP),而Aroml9分子量約為23. I kD,理論上融合蛋白的分子量約為65. 6kD。這與預期結果相一致，重組表達載體經IPTG誘導后，融合蛋白得到表達，而大腸桿菌TBl沒有相應的蛋白表達。目的蛋白表達量經軟件分析，約達到了細菌表達蛋白總量的43.8%。以抗MBP蛋白的抗血清進行的Western blot試驗表明在大小為65. 6 kD和42. 5 kD可見兩條清楚的蛋白條帶。實施例5重組Aroml9蛋白的大量表達與純化取過夜培養(yǎng)的10 mL細菌于IL LB (含葡萄糖)中，37°C搖振培養(yǎng)3h，加入IPTG至終濃度為O. 5mmol/L再繼續(xù)培養(yǎng)2h，4000g離心20min收集菌體，重懸于50mL柱緩沖液中。加入溶菌酶至終濃度為lmg/mL，冰浴30min。最后加入DNA酶和RNA酶至終濃度為5 μ g/11^，41孵育101^11。9000g離心30min，將上清轉移備用，上清即為表達的融合蛋白。將上清蛋白質上樣于平衡緩沖液(20mmol/LTris-HCL，200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, pH7. 4)平衡好的Amylose-sepharomse親和柱中，用緩沖液平衡至基線后，開始用洗脫緩沖液(平衡緩沖液+lOmmol/L麥芽糖中)洗脫，洗脫液中即為純化后的融合蛋白，最后SDS-PAGE電泳檢測。在純化好的蛋白中加入Factor Xa至終濃度為200 μ g/mL,室溫作用4h,同上過Amylose-sepharomse親和柱,用平衡緩沖液洗脫下的即為Aroml9蛋白。同樣作SDS-PAGE電泳檢測。檢測結果表明純化蛋白為單一條帶，分子量為65. 6kD左右,相對于未融合蛋白MBP的分子量明顯偏大。取純化好的蛋白經Factor X酶切4h后，經SDS-PAGE電泳檢測，目的蛋白為兩個條帶即分子量為42. 5kD的為MBP，分子量為23. IkD的Aro m19蛋白。再經Amylose sepharoml9se過柱后，得到純化的Aroml9蛋白。實施例6對ICR小鼠免疫原性試驗結果(I)疫苗準備與免疫程序取重組菌37°C培養(yǎng)、純化后，與完全弗氏佐劑以I: I的比例混合均勻，免疫15只小鼠,每只小鼠腹腔注射70 μ g純化蛋白進行免疫,初免后小鼠每間隔2周以與初免相同的劑量加強免疫4次。每次免疫后I周尾靜脈采血，制備血清。同時以生理鹽水腹腔注射10只小鼠為空白對照。最后大量取血制備抗血清。(2)間接ELISA檢測Aroml9血清抗體通過間接ELISA方法測定Aroml9特異的血清抗體效價=ELISA按常規(guī)方法進行。將純化的重組蛋白4°C過夜包被，PBST (含O. 02%Tween-20的PBS)洗滌3次后，用含10%FCS的PBS加滿各孔4°C封閉24h，PBST洗滌3次。樣品血清作倍比稀釋(100 μ L/孔)，同時設立陰性對照(I :100稀釋的免疫前小鼠血清)和空白對照(PBS)，37°C水浴孵育2h，PBST洗滌3次，每孔加入IOOyL I 25000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG酶標二抗，37°C水浴孵育2h，PBST洗滌3次，每孔加入100 μ L OPD底物進行，測定0D490值，以Ρ/Ν (待檢樣品0D490/陰性樣品0D490)彡2. I判為陽性。(3)初免I周后，免疫組小鼠的血清中就能檢測到重組蛋白誘導產生的特異抗體，在加強免疫后第6周抗體滴度為I. 542±0. 23，達到峰值，而空白對照組不能產生特異抗體，且免疫組與空白組抗體效價值差異顯著(Ρ〈0. 05)。通過上述的實驗，本發(fā)明達到了如下的結果利用本發(fā)明的原核表達載體pMAL-Aroml9，該載體是含有黃鱔芳香化酶保守區(qū)的原核表達載體。本發(fā)明采用RT-PCR方法從黃鱔腦中擴增出長約639bp的目的序列Aroml9基因保守區(qū)片段，克隆至T載體中，經酶切鑒定和序列測定分析確認序列的正確性后將其克隆到表達載體pMAL-c2x中構建重組表達質粒pMAL-Aroml9，并在大腸桿菌TBl中獲得了高表達，目的蛋白約占菌體總蛋白的43. 8%。菌體經溶菌酶裂解,制備無細胞抽提液,Amylose-sepharomse柱層析后得到分子量為65. 6kD單一條帶的目的蛋白。目的蛋白經Factor Xa酶切裂解,Amylose-sepharomse過柱純化后得到純化的Aroml9蛋白。以70 μ g/只的劑量4次免疫ICR小鼠，免疫小鼠可以檢測到特異性針對Aroml9蛋白的血清抗體應答，免疫組抗體水平顯著高于空白組(P〈0. 05)，且加強免疫第6周后抗體效價為I. 542±0. 23，達到高峰值，說明表達產物具有免疫原性，可以刺激機體產生免疫應答。
權利要求
1.黃鱔芳香化酶保守區(qū)的原核表達載體pMAL-Aroml9,其特征在于所述原核表達載體由表達載體pMAL-c2x構建而得，該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點PBS、Aroml9基因保守區(qū)序列及一個麥芽糖結合蛋白標簽序列。
2.如權利要求I所述的原核表達載體pMAL-Aroml9,其特征在于所述載體中的Arom19來源于黃鱔。
3.如權利要求I所述的原核表達載體pMAL-Aroml9,其特征在于所述Aroml9基因的上游有17啟動子和細菌核糖體結合位點RBS，T7啟動子的下游有可被IPTG誘導的操作子序列，緊靠Aroml9基因的起始密碼子上游還有一個麥芽糖結合蛋白標簽序列。
4.如權利要求1 3中任一項所述的原核表達載體pMAL-Aroml9的構建方法,其特征在于由下述方法構建而得 從GenBank中查找黃鱔Aroml9的全長基因序列，并米用Primer5. 0設ii^一對特異性引物 上游引物 1:5’- CAGTGTGTGTTGGAGATGGTGA-3' 下游引物 2: 5’- TTCATCATCACCATGGCAATGT -3' 以提取自黃鱔的腦總RNA為模板進行反轉錄合成第一鏈cDNA，以反轉錄產物為模板及合成的上下游引物進行PCR擴增，反應條件為94°C預變性3min，94°C變性30s，58°C退火45s, 72°C延伸 lmin, 30 個循環(huán)，72°C延伸 7min ； PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用凝膠回收試劑盒回收，將回收產物與PMD18-T載體，16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌JM109，隨機挑取細菌，提取質粒后用EcoR I、Hind III雙酶切初步鑒定后，將陽性克隆進行DNA測序，測序結果用生物軟件DNAstar、CLUSTAL X等進行分析； 將陽性質粒和原核表達質粒PMAL-C2X分別用I ,Hindlll 37°C雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收Aroml9保守區(qū)片段和線性化pMAL質粒,按照T4 DNA連接酶的說明書設計連接反應體系，構建表達質粒pMAL-Aroml9，并轉化大腸桿菌JM109，篩選陽性克隆，隨機挑取1-2個克隆進行酶切鑒定，獲得黃鱔芳香化酶保守區(qū)的原核表達載體pMAL-Aroml9。
5.如權利要求3中任一項所述的原核表達載體pMAL-Aroml9在制備Aroml9保守區(qū)抗體的抗原中的應用。
6.用權利要求I 3中任一項所述的原核表達載體pMAL-Aroml9在制備Aroml9重組蛋白中的應用，其具體應用方法如下 將pMAL-Aroml9轉化大腸桿菌TBl，挑取陽性克隆接種含50 u g/mL的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖振培養(yǎng)過夜； 取培養(yǎng)菌液以1/10的比例接種于新鮮的含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，分別以.0.5、lmol/L濃度的IPTG誘導，37°C搖振培養(yǎng)4h后，收集菌體，加入溶菌酶至終濃度為Img/mL,冰浴 30min ； 加入DNA酶和RNA酶至終濃度為5 u g/mL，4°C孵育10 min ;所得產物9000g離心30min，將上清轉移備用，上清即為表達的融合蛋白； 將上清蛋白質上樣于平衡緩沖液平衡好的Amylose_sepharoml9se親和柱中，其中所述平衡緩沖液為 20mmoI/LTris-HCL, 200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, pH7. 4 ； 用緩沖液平衡至基線后，開始用洗脫緩沖液，所述洗脫緩沖液為平衡緩沖液，再加lOmmol/L麥牙糖，洗脫液中即為純化后的融合蛋白； 最后SDS-PAGE電泳檢測；在純化好的蛋白中加入Factor Xa至終濃度為200 u g/mL，室溫作用4h，同上過Amylose- sepharoml9se親和柱，用平衡緩沖液洗脫下的即為Aroml9蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供一種Arom19的原核表達載體pMAL-Arom19，該載體含有T7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點RBS和Arom19基因保守區(qū)片段及一個麥芽糖結合蛋白標簽。構建此載體的方法為采用RT-PCR方法從黃鱔腦中擴增出長約639bp的目的序列Arom19基因保守區(qū)，克隆至T載體中，經酶切鑒定和序列測定分析確認序列的正確性后，將此片段克隆到表達載體pMAL-c2x中構建重組表達質粒pMAL-Arom19。利用該載體轉化大腸桿菌實現(xiàn)Arom19保守區(qū)蛋白的高水平表達，進一步純化獲得高純度的重組Arom19蛋白質。實驗證實，用本發(fā)明提供載體制備Arom19保守區(qū)蛋白具有較強的免疫原性，能刺激機體產生免疫應答。
文檔編號C12N15/70GK102796754SQ201210275140
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月3日 優(yōu)先權日2012年8月3日
發(fā)明者丁煒東, 曹麗萍, 曹哲明, 邴旭文 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心