專利名稱：抗腫瘤蛋白p53單克隆抗體及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗腫瘤蛋白P53的單克隆抗體及其在檢測P53蛋白中的應用。
背景技術：
P53基因是一種抑癌基因，是迄今發(fā)現與人類腫瘤相關性最高的基因，分為野生型和突變型兩種，其蛋白產物為定位于人類染色體17pl3. 1，由393個氨基酸組成的核內磷酸 化蛋白，其分子量為53kD，因此被稱為p53蛋白(Tumor protein p53)。P53蛋白分為野生型和突變型，野生型P53蛋白極不穩(wěn)定，半衰期僅數分鐘，并具有反式激活功能和廣譜的腫瘤抑制作用；突變型P53蛋白穩(wěn)定性增加，半衰期延長，可被免疫組化方法檢測出來。p53基因的突變、缺失是人類腫瘤的常見事件，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切。目前研究認為引起腫瘤形成或細胞轉化的P53蛋白是p53基因突變的產物，是一種腫瘤促進因子，它可以消除正常P53的功能；而野生型p53基因是一種抑癌基因，它的失活對腫瘤形成起重要作用。一般認為，突變型P53的過表達與腫瘤的轉移、復發(fā)及不良預后相關。p53蛋白臨床意義包括(1)肝癌患者有一定比例的P53蛋白過表達，p53基因突變可能與肝癌的惡性分化程度有關；(2)p53突變還可見于胃癌、肝癌、大腸癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴造血系統(tǒng)腫瘤、膠質細胞瘤、軟組織肉瘤等惡性腫瘤。因此目前臨床上在進行腫瘤治療之前，通常通過免疫組織化學(IHC)病理實驗確定腫瘤細胞中突變型P53的表達水平，起到輔助診斷的目的。IHC實驗的核心為特異性結合P53的單克隆抗體，其性能的優(yōu)劣直接決定著整個檢測的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結合特異性較高的抗P53蛋白的單克隆抗體具有重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題為提供一種結合特異性較高的抗P53蛋白的單克隆抗體，及其在制備用于檢測P53蛋白的免疫檢測工具中的應用。為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱為CGMCC)，保藏日期為2012年5月16日，保藏編號為 CGMCC No. 6136。本發(fā)明還提供了一種特異性結合P53蛋白的單克隆抗體2C4，由上述雜交瘤細胞株產生。本發(fā)明所述單克隆抗體的制備方法如下(I)重組表達載體的構建根據p53基因的ORF全序列(如SEQID No. I所示)設計弓I物進行PCR擴增，基因兩側分別弓丨入限制性內切酶位點SgfI和MluI，并在其C末端引入Myc-DDK標簽序列(如SEQ ID No. 2所示),插入表達載體pCMV6_Entry,構建p53重組表達質粒;(2)P53重組蛋白的表達與純化以該質粒轉染HEK293T細胞，裂解離心取上清，DDK親和層析柱純化，獲得純化的P53重組蛋白；
(3)單抗的篩選與制備采用上述P53重組蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾臟細胞與SP2/0細胞進行融合，有限稀釋法獲得單克隆，ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，獲得能分泌抗P53特異性抗體的雜交瘤細胞株，命名為2C4，亞型鑒定為IgGl ;制備小鼠腹水，通過親和層析柱純化P53單抗2C4。分別通過Western Blot、免疫組化實驗、免疫熒光驗證該單抗的靈敏度和特異性。上述單克隆抗體的特異性驗證OriGene高密度蛋白芯片上包含10400個HEK293T細胞蛋白過表達裂解物，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過Excel文件進行準確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣,每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監(jiān)控每次免疫反應數據的重復性，以及定位陽性信號的方向。將本發(fā)明單克隆抗體2C4與上述芯片雜交并確定陽性信號位點，結果顯示本發(fā)明單克隆抗體2C4特異性結合P53蛋白，與其他蛋白無交叉反應。 本發(fā)明還提供了單克隆抗體2C4在制備用于檢測P53蛋白的免疫檢測工具中的應用。具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。在具體的實施例中，本發(fā)明提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述單克隆抗體2C4 ;可檢測組織細胞中突變型p53的表達狀況。本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體在制備用于診斷p53相關性腫瘤的病理診斷試劑盒中的應用。由于突變型P53的表達增高與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切，因此使用本發(fā)明單克隆抗體檢測突變型P53的水平高低，可用于輔助診斷p53相關性腫瘤。所述p53相關性腫瘤為胃癌、肝癌、大腸癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴造血系統(tǒng)腫瘤、膠質細胞瘤、軟組織肉瘤等惡性腫瘤。保藏信息用于保藏的雜交瘤細胞株的科學描述為抗人TP53單克隆抗體雜交瘤細胞株2C4 ；保藏單位全稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位簡稱CGMCC ；保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所；保藏日期2012年5月16日；保藏編號CGMCCNo. 6136。


圖I為Western blot驗證p53重組質粒在HEK293T細胞中的表達；左邊泳道的上樣樣品為轉染PCMV6空載體的HEK293T細胞裂解液，右邊泳道的上樣樣品為轉染重組質粒pCMV6-p53的HEK293T細胞裂解液，雜交所用一抗為DDK標簽抗體；圖2為p53重組蛋白的SDS-PAGE鑒定圖；圖3為單克隆抗體2C4在9種不同細胞系中的Western blot結果；圖4為免疫組化檢測肺癌組織中突變型P53蛋白的表達(以2C4單抗為一抗)。
具體實施例方式為了使本領域的技術人員更好地理解本發(fā)明的技術方案，下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。實施例I抗p53單克隆抗體的制備一、p53重組表達質粒的構建以從ATCC獲得的質粒BC003596 (含SEQ ID No. I所示p530RF序列)為模板，設計兩條引物并分別引入酶切位點SgfI、MluI，以及C末端Myc-DDK標簽(標簽序列如SEQ IDNo. 2所示),并克隆入表達載體pCMV6-Entry,構建p53重組表達質粒。二、p53重組蛋白的表達與純化I、轉染 HEK293T 細胞 HEK293T細胞以1:3傳至直徑IOcm的細胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)；取7. 5ml DMEM (無血清及抗生素)培養(yǎng)基至50ml管中，加入300 μ IPEI MegaTranl. O混勻，然后加入75 μ g上述p53重組質粒DNA混勻并靜置30分鐘；分別取515 μ I上述混合液至上述各細胞培養(yǎng)皿中，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉染24小時后，每培養(yǎng)皿細胞添加25 μ I 2Μ 丁酸鈉至終濃度5mM。2、裂解細胞轉染48小時后，進行細胞裂解。吸去培養(yǎng)基，加入Iml PBS進行漂洗，吸去PBS。加入Iml裂解緩沖液，使用前加入蛋白酶抑制劑PI和PMSF。置于冰盒中在搖床上振蕩，收集所有培養(yǎng)皿中得裂解液，4 °C離心，收集上清。3、DDK親和層析柱純化以孔徑為O. 45 μ m,直徑為33mm的PVDF膜濾器過濾離心后的裂解液上清并轉入15ml管中，加入混合好的Sepharose Beads 1ml,封口后放入360度混勻器中，于4°C結合2小時；取出15ml管，將裂解液倒入BIO-RAD層析柱中，并接住穿透液，滴盡后穿透液取樣WB檢測，見圖I (圖I顯示p53重組質粒在HEK293T細胞中正常表達)；以裂解緩沖液沖洗柱料1-2次，滴盡后再用TBST沖洗Beads 3次，滴盡后用O. IM Glycine (pH3. 5)洗脫，第一次200 μ 1，滴盡不收集，第二、三次各500 μ 1，第四次250 μ 1，收集至一個1.5mlTube中，并迅速加入NaH2PO4 CpH=Il. O)中和至pH7. O左右，每管加入甘油至終濃度為10%，Tween-80至終濃度為O. 1%。純化后的p53重組蛋白用SDS-PAGE鑒定，結果見圖2。三、單抗的篩選與制備I、動物免疫上述純化的p53重組蛋白以完全弗氏佐劑乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周齡BALB/c小鼠，免疫劑量為50 μ g/只，間隔兩周后進行第二次免疫，以不完全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為50 μ g/只。免疫兩次后取尾血以ELISA法梯度稀釋測定血清效價；根據結果確定是否加強免疫，選取抗體效價最高的小鼠進行細胞融合。2、細胞融合骨髓瘤細胞采用BALB/c小鼠來源的sp2/0，融合時處于對數生長期；取上述免疫的小鼠脾臟，制成淋巴細胞單細胞懸液；免疫小鼠脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞以1:5-1:10混合，滴加370C的50%PEG (PH 8. O) 1ml，加入不完全培養(yǎng)基及其余終止液，離心棄上清后加入HAT培養(yǎng)基懸浮混勻，MC定容到50ml，分裝到3. 5cm培養(yǎng)皿中，放于濕盒中，置于37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
3、篩選和克隆融合7-10天內挑選細胞克隆，使用上述純化的p53重組蛋白進行ELISA測試，標記細胞株號。對陽性孔細胞進行有限稀釋，每次有限稀釋后5-6天測定ELISA值，挑取0D280陽性值較高的單克隆孔進行有限稀釋，直至ELISA測定96孔板全板結果為陽性；挑取陽性值高的單克隆定株，其對應融合板細胞株為2C4。4、腹水單抗的制備與純化10-12周齡的雄性BALB/c小鼠腹腔注射O. 5ml降植烷，一周后每只小鼠用Iml注射器腹腔注射經PBS洗滌重懸的單克隆細胞懸液，細胞用量為
5X IO6/只，每株抗體打2只小鼠。待小鼠腹水積聚后收集腹水，離心取上清，親和層析法進行腹水純化，根據抗體亞型選擇相應柱料，單抗2C4亞型為IgG I,采用proteinG進行純化。純化后的單抗?jié)舛葴y定、分裝、凍存在_20°C。以單抗 2C4 為一抗，對 H印G2、HeLa、SVT2、A549、C0S7、Jurkat、MDCK、PC 12、MCF7九種細胞系的蛋白裂解液進行雜交、顯色，其結果如圖3所示，由圖3可見p53蛋白在細胞系H印G2、HeLa, C0S7中有不同程度的表達。 實施例2以單抗2C4為一抗對肺癌組織進行免疫組化檢測I、取肺癌組織進行石蠟包埋，使用Finesse組織切片機進行切片，組織厚度為
6μ m ；2、脫錯與水化分析純二甲苯3次X IOmin,無水乙醇3次X IOmin, 95 %乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min，去離子水浸泡3minX 3次；3、加入抗原修復液(O. 01M, pH6. O枸櫞酸鈉緩沖液)高壓鍋高壓熱修復2min，待高壓鍋溫度降至約90°C時，打開高壓鍋，取出標本，然后自然冷卻至室溫。去離子水浸泡3minX 3 次。4、使用3%過氧化氫滅活組織內源性過氧化物酶,室溫靜置lOmin。去離子水浸泡5minX 3 次。5、加上封閉液(PBS+5%脫脂奶粉+5%正常山羊血清)，37°C孵育60min。6、去除封閉液，勿沖洗，加入1:150比例稀釋的本發(fā)明單抗2C4 ;置于濕盒中，37°C孵育 60min。PBST (含 O. l%Tween_20)洗滌 2 次，每次洗滌 5min。PBST (含 O. 02%Tween_20)洗漆I次，每次洗漆5min。7、滴加 Polink-試劑盒 2 (Catlog No. D37-15)中的試劑 1，37°C孵育 10-20 分鐘。使用PBS洗滌3次，每次5min。滴加Pol ink-2試劑盒(Catlog No. D37-15)中的試劑2，37°C孵育10-20分鐘，使用PBS洗滌3次，每次5min。8、應用DAB溶液(中杉金橋ZLI-9019)顯色，顯色3 lOmin。蒸餾水洗滌。9、蘇木精復染細胞核2min，蒸餾水漂洗，1%鹽酸分化。蒸餾水漂洗3次，室溫靜置lmin。10、脫水和透明75%乙醇5min, 100%乙醇5minX3次，85%乙醇乙醇5min, 100%乙醇3X 5min ;二甲苯3X 5min,中性樹膠封片。11、鏡檢，見圖4。由圖4可見肺癌組織可見大量棕黃色顆粒，為p53蛋白表達陽性細胞。實施例3、單克隆抗體2C4的特異性檢測OriGene高密度蛋白芯片上包含10400個HEK293T細胞蛋白過表達裂解物，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過Excel文件進行準確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣,每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監(jiān)控每次免疫反應數據的重復性，以及定位陽性信號的方向。以下為使用OriGene蛋白(OriGene Cat PA100001)芯片對2C4單克隆抗體進行特異性鑒定的具體步驟I、將一張蛋白芯片放在50ml離心管中，使用40ml去離子水浸潤芯片，置于搖床上，室溫混合30分鐘；棄掉去離子水，使用IOmlPBST平衡芯片，室溫處理10分鐘。2、向50ml離心管中加入40ml 5%脫脂牛奶(用PBST進行稀釋)置于搖床上，室溫封閉30分鐘。3、使用封閉液(5%脫脂牛奶)稀釋一抗2C4 (稀釋比例I :200)。
4、將潔凈的封口膜粘貼到實驗臺上，滴加250-300 μ I上述稀釋一抗在封口膜上。5、將蛋白芯片從封閉液中抽出，將蛋白芯片NC 旲的一面朝下，從芯片的一邊接觸抗體，慢慢滑下，依靠液體表面張力，抗體將慢慢浸潤芯片NC膜，直至整張NC膜浸潤在一抗溶液中。整個操作過程避免產生氣泡。將芯片移到4度環(huán)境下，靜置，一抗孵育過夜。在芯片上加蓋培養(yǎng)皿蓋，其上黏附一張濕紙巾，以防止長時間孵育導致抗體蒸發(fā)。6、第二天將芯片移至50ml離心管中，使用PBST漂洗芯片兩次，去除多余的抗體。使用40ml PBSTC O. l%Tween_20)洗滌芯片，置于搖床上混合均勻，洗滌三次，每次洗滌5min。7、使用封閉液(5% 脫脂牛奶)稀釋二抗 DyLight649_conjugated AffiniPureFragment Goat-anti-Mouse IgG,稀釋比例為 I :400。8、按照上述步驟4，步驟5進行二抗孵育操作。室溫孵育I小時。在芯片上方用鋁箔紙遮蓋，以防止發(fā)生信號漂白。9、按照上述步驟6，使用PBST洗滌芯片。10、使用去離子水沖洗芯片，以去除殘余的鹽分和變性劑。11、室溫干燥芯片，確保芯片完全干燥。12、使用芯片掃描儀讀取突光信號。13、根據B SA-Cy3以及BSA_Cy5確定芯片方向以及陽性信號的位點。14、根據陽性信號位點找出對應蛋白裂解液ID，根據裂解液數據庫信息，查找到對應蛋白名稱，NCBI錄入號(accession number),蛋白ID,蛋白大小等信息。以單純封閉液替代單克隆抗體2C4作為空白對照組，芯片雜交結果顯示實驗組芯片上出現兩個陽性信號點，對應蛋白分別為TP53和UNC5A ;空白對照組的芯片上出現了一個陽性信號位點，對應蛋白為UNC5A，因此，UNC5A為假陽性信號位點；結論本發(fā)明單克隆抗體2C4僅特異性結合TP53蛋白，而與其他蛋白無交叉反應。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種特異性結合P53蛋白的單克隆抗體2C4，由保藏編號為CGMCC No. 6136的雜交瘤細胞株產生。
2.一種雜交瘤細胞株，其保藏編號為CGMCC No. 6136。
3.如權利要求I所述的單克隆抗體在制備用于檢測P53蛋白的免疫檢測工具中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試 紙。
5.一種免疫組化檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求I所述的單克隆抗體。
6.如權利要求I所述的單克隆抗體在制備用于診斷p53相關性腫瘤的病理診斷試劑盒中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述p53相關性腫瘤為胃癌、肝癌、大腸癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴造血系統(tǒng)腫瘤、膠質細胞瘤、軟組織肉瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雜交瘤細胞株(保藏編號為CGMCC No.6136)，以及由此雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體2C4。本發(fā)明還涉及單克隆抗體2C4在制備用于檢測p53蛋白的免疫檢測工具中的應用，含單克隆抗體2C4的免疫組化試劑盒，以及單克隆抗體2C4在制備用于診斷p53相關性腫瘤的試劑盒中的應用。本發(fā)明所述單克隆抗體可與p53蛋白特異性結合，而與細胞內其他蛋白無交叉反應，顯著提高了p53蛋白免疫檢測的特異性和可靠性。
文檔編號C12R1/91GK102827278SQ201210274649
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月3日 優(yōu)先權日2012年8月3日
發(fā)明者何為無, 馬東輝, 袁克湖, 陳堅, 王超, 陳思, 袁麗, 龔世妍, 周春 申請人:無錫傲銳東源生物科技有限公司