專利名稱：犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于病毒培養(yǎng)的敏感細(xì)胞系，特別涉及一種用于犬瘟熱病毒培養(yǎng)的敏感細(xì)胞系，本發(fā)明還涉及該細(xì)胞系的建立方法及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
犬痕熱(Caninedistemper,CD)是由犬痕熱病毒(Canine distemper virus, CDV)感染犬所引起的急性、高度接觸性傳染病。自1809年首次報(bào)道以來，該病已呈世界性分布，給養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)造成巨大危害。CDV屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疫病毒屬(Morbillivirus)。盡管 CDV 分為亞洲 I 型(Asia- I )、亞洲II型(Asia- II)、歐洲型(Europe)、美國II型(USA- II )、北極型(Arctic)和疫苗型(Vaccine)6個(gè)不同基因亞型，但公認(rèn)只有一個(gè)血清型。⑶V不易在環(huán)境中存活，現(xiàn)地分離病 毒成功率低，限制了對(duì)CDV的研究。目前分離⑶V多采用犬腎細(xì)胞系(MDCK)、非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero)及絨猴B淋巴細(xì)胞系(B95a)。使用MDCK分離CDV野毒株時(shí)病毒所形成的細(xì)胞病變不明顯且形成時(shí)間較長(zhǎng)，而VeiO會(huì)導(dǎo)致CDV毒力下降。雖然B95a分離CDV的成功率較高，但利用其所分離到的病毒株除能與犬源SLAM(SALM，⑶V的已知受體)發(fā)生作用外，也能利用人源及絨猴源SLAM，人為的擴(kuò)大⑶V的宿主范圍，給生物安全帶來了嚴(yán)重隱患。因此建立能用于⑶V分離與繁殖的敏感細(xì)胞系，在CDV的研究中具有重要意義。在轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)到細(xì)胞基因組中的工作中，重組慢病毒載體是一個(gè)強(qiáng)大和有效地工具。慢病毒能作用于細(xì)胞周期的G0/G1期，同時(shí)具有嗜核性，所以可以感染分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞，感染包括所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)、干細(xì)胞和原代培養(yǎng)的細(xì)胞。慢病毒載體還具有轉(zhuǎn)移基因片段容量大(9kb)、目的基因可整合至靶基因細(xì)胞組長(zhǎng)期表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，所以獲得了較廣的應(yīng)用范圍。慢病毒載體也是RNAi表達(dá)的主要手段，同化學(xué)合成和酶切形成的SiRNA相比具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)其一，可以攜帶GFP或熒光素酶等報(bào)告基因共表達(dá)，便于跟蹤、選擇和富集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；其二，可以根據(jù)需要表達(dá)不同類型的小RNA分子(siRNA、shRNA或miRNA);其三，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，使基因沉默維持較長(zhǎng)時(shí)間。本發(fā)明立足于CDV野毒株的分離及檢測(cè)，采用慢病毒四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)建立了用于分離CDV病毒株的敏感細(xì)胞系MDCK-CSL，為CDV野毒株的分離及其完整的生物學(xué)特性研究提供了技術(shù)平臺(tái)，也為CDV感染進(jìn)行早期診斷，防止CD感染蔓延，及制定CD防控策略提供了依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一株能夠用于分離犬瘟熱病毒株的敏感細(xì)胞系；本發(fā)明的目的之二在于提供所述敏感細(xì)胞系在培養(yǎng)或分離犬瘟熱病毒株中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的本研究采用慢病毒四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，將犬源SLAM目的基因重組于轉(zhuǎn)移載體pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A-Puro后，利用包裝質(zhì)粒pMDlg-pRRE，包膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒PMD2G，輔助基因質(zhì)粒pRsv-REV，四質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝，經(jīng)純化濃縮后獲得的病毒滴度為5. 4X 108TU/ml。將包裝后的慢病毒感染MDCK細(xì)胞，利用標(biāo)志基因表達(dá)的綠色熒光蛋白(EGFP)及嘌呤霉素抗性，通過有限稀釋法獲得了一株表達(dá)犬源SLAM的犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系。本發(fā)明的一株犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系，命名為MDCK-CSL，建議的分類命名為采用慢病毒重組構(gòu)建的表達(dá)SLAM的MDCK細(xì)胞，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中科院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC No. 5881，保藏日期為2012年3月6日。
利用間接免疫熒光及激光共聚焦技術(shù)對(duì)MDCK-CSL細(xì)胞系外源基因SLAM進(jìn)行了定性及定位檢測(cè)，在非嘌呤霉素壓力維持下，該犬源SLAM外源基因至30代仍能在MDCK-CSL細(xì)胞膜上穩(wěn)定表達(dá)。通過比較CDV標(biāo)準(zhǔn)株(Snyder Hi 11毒株)在MDCK-CSL和MDCK細(xì)胞上的繁殖情況，表明Snyder Hill標(biāo)準(zhǔn)毒株感染MDCK-CSL細(xì)胞系24h即可觀察到細(xì)胞相互融合、圓縮、明顯死亡等細(xì)胞病變；而感染MDCK細(xì)胞持續(xù)6d僅表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，未出現(xiàn)細(xì)胞病變。因此，本發(fā)明又提出了所述的犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系在培養(yǎng)或分離犬瘟熱病毒中的應(yīng)用。其中，所述的犬瘟熱病毒可以為犬瘟熱病毒野毒株。利用現(xiàn)有的RT-PCR方法，對(duì)Snyder Hill毒株在MDCK-CSL細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代CDV核酸檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)在MDCK-CSL細(xì)胞連續(xù)傳代后第5代仍可檢測(cè)到病毒核酸。利用免疫印跡法(Western blotting)對(duì)Snyder Hill毒株在MDCK細(xì)胞及MDCK-CSL細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代進(jìn)行抗原檢測(cè)，在MDCK-CSL細(xì)胞連續(xù)傳至第5代后仍可檢測(cè)到目的條帶，證明該犬源SLAM在MDCK-CSL細(xì)胞中具有良好地生物學(xué)活性。對(duì)送檢⑶V疑似臨床病料，在RT-PCR診斷為陽性的基礎(chǔ)上，利用本發(fā)明所建立的表達(dá)犬源SLAM的穩(wěn)定細(xì)胞系，接種MDCK-CSL細(xì)胞系后24h即可觀察到細(xì)胞相互融合、圓縮、明顯死亡等特征性細(xì)胞病變；對(duì)送檢CDV疑似臨床病料進(jìn)行連續(xù)傳代，RT-PCR方法仍可檢測(cè)到該病毒存在。本發(fā)明的一種用于分離犬瘟熱病毒野毒株的方法，其特征在于包括以下步驟(I)疑似犬瘟熱病病料的采集及處理采集疑似犬瘟熱病毒感染的動(dòng)物糞便及血液，將其混合物經(jīng)磷酸緩沖液重懸混勻后，4°C離心，取上清經(jīng)濾膜除菌后分裝于-70°C備用；(2)病毒在MDCK-CSL的增值將本發(fā)明所述的犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系MDCK-CSL培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)至80%單層后，棄去培養(yǎng)基，經(jīng)磷酸緩沖液清洗2遍后，將步驟(I)處理過的病料上清接種于MDCK-CSL細(xì)胞感作2h后，棄去上清后換維持液培養(yǎng)至80%病變后收獲病毒； (3)病毒RNA的提取及cDNA合成病變的MDCK-CSL細(xì)胞反復(fù)凍融3次后經(jīng)提取病毒RNA，進(jìn)行cDNA合成；
(4)⑶V疑似病料的RT-PCR鑒定及H基因的擴(kuò)增、克隆利用現(xiàn)有的RT-PCR方法鑒定該疑似病料，并利用合成的用于擴(kuò)增⑶V H基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物克隆于pMD18-T中，進(jìn)行酶切鑒定。其中，優(yōu)選的，所述的用于擴(kuò)增⑶V的RT-PCR鑒定引物為NI 上游 5，-GATCATAGACGACCCTGATG-3’NI 下游 5，-GACCCTTCGTCTACAATTTTG-3，擴(kuò)增片段144bp，95°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，55. 5°C退火 30s，72°C延伸 45s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。其中，優(yōu)選的，所述的用于擴(kuò)增⑶V H基因的引物為 上游5，-GGGGTACCGCCACCATGCTCTCTTACCAAGACAAG-3’下游5 ’ -AAGCGGCCGCTACCATCAAGGTTTTGAAC-3，。本研究立足于⑶V野毒株的分離及檢測(cè)，建立⑶V敏感細(xì)胞系MDCK-CSL，為⑶V野毒株的分離及其完整的生物學(xué)特性研究提供了技術(shù)平臺(tái)，也為犬瘟熱病的防控奠定了基礎(chǔ)。


圖I 為慢病毒載體 pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A-Puro 圖譜；圖2為慢病毒載體pRsv-REV圖譜；圖3為慢病毒載體pMDlg-pRRE圖譜；圖4為慢病毒載體PMD2G圖譜；圖5 為 SLAM 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果及轉(zhuǎn)移載體 pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A_Puro 的酶切結(jié)果；M:DL15000Marker ； I:載體 pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A_Puroo 經(jīng) Smi I 單酶切結(jié)果；2:目的基因SLAM PCR擴(kuò)增結(jié)果；3:DL2000 Marker圖6為重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果；M DL2000Marker ; I 8 :陽性克隆圖7為重組質(zhì)粒中目的片段插入方向的確定；M DL2000 ;1 8:經(jīng)Bam HI酶切后的重組質(zhì)粒圖8為重組質(zhì)粒的酶切鑒定；M 1000Marker;l-3:重組質(zhì)粒 pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A-Puro-SLAM 經(jīng) EcoR I和Not I酶切鑒定圖9為包裝完成后的慢病毒感染293T 20h后結(jié)果；A (明場(chǎng))和B (熒光)圖10為不同濃度的慢病毒感染293T細(xì)胞后48h的結(jié)果；A (明場(chǎng))和么1 (熒光)0.014 1^病毒感染2931'細(xì)胞后4811出(明場(chǎng))和BI (熒光)0.1口1^病毒感染2931'細(xì)胞后4811< (明場(chǎng))和Cl (熒光)I. O μ L病毒感染293T細(xì)胞后48h ；圖11為流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果；圖12為陽性細(xì)胞的篩選結(jié)果；
A:明場(chǎng)；B:突光圖13為激光共聚焦分析結(jié)果；A:為B、C及D圖的疊加；B:表達(dá)綠色熒光蛋白的MDCK-CSL ；C:抗SLAM抗體標(biāo)記的MDCK-CSL ；D:經(jīng)H3325染色后的細(xì)胞核圖14為不同代次MDCK-CSL細(xì)胞SLAM基因的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果；M:DL 2000Marker; 1:MDCK 細(xì)胞;2:第 2 代 MDCK-CSL 細(xì)胞;3:第 5 代 MDCK-CSL 細(xì)胞；4:第 10 代 MDCK-CSL 細(xì)胞；5:第 15 代 MDCK-CSL 細(xì)胞;6:第 20 代 MDCK-CSL 細(xì)胞;7:第25代MDCK-CSL細(xì)胞；8:第30代MDCK-CSL細(xì)胞。圖15為IFA檢測(cè)SLAM在MDCK-CSL中的表達(dá)結(jié)果；A (明場(chǎng))MDCK-CSL 細(xì)胞；Al (綠色熒光)MDCK-CSL 細(xì)胞；A2 (紅色熒光)MDCK-CSL細(xì)胞(明場(chǎng))MDCK細(xì)胞；B1 (綠色熒光)MDCK細(xì)胞；B2 (紅色熒光)MDCK細(xì)胞 圖16為SLAM在MDCK細(xì)胞中的生物活性檢測(cè)結(jié)果；A: MDCK-CSL 細(xì)胞感染 Snyder Hi 11 毒株 24h ；A1: MDCK-CSL 對(duì)照細(xì)胞；B: MDCK 細(xì)胞感染Snyder Hill毒株6d ;B1:MDCK對(duì)照細(xì)胞圖17為RT-PCR鑒定結(jié)果；M:DL 2000Marker; I:第 I 代 MDCK-CSL Snyder Hill 細(xì)胞毒；2:第 2 代 MDCK-CSLSnyder Hill 細(xì)胞毒；3:第 3代MDCK-CSL Snyder Hill 細(xì)胞毒；4:第 4代MDCK-CSL SnyderHill細(xì)胞毒;5:第5代MDCK-CSL Snyder Hill細(xì)胞毒;6:陰性對(duì)照?qǐng)D18 為 Western blot 鑒定 CDV 在 MDCK-CSL 中的繁殖；I:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2 =MDCK-CSL細(xì)胞；3 :第四代MDCK-CSL細(xì)胞毒；4 :第五代MDCK-CSL細(xì)胞毒；5 =Snyder Hill標(biāo)準(zhǔn)毒株陽性對(duì)照?qǐng)D19為分離毒株在MDCK和MDCK-CSL上的繁殖；AiMDCK-CSL細(xì)胞感染野毒株24h ；A1:MDCK-CSL感染后綠色熒光；B:MDCK細(xì)胞感染野毒株24h ；B1:MDCK對(duì)照細(xì)胞圖20為分離毒株的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果；M: DL2000Marker; I: CDV RT-PCR 2:陰性對(duì)照?qǐng)D21為pMD18-T重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果；Ml: DL2000Marker; M2: DL15000Marker; I:重組質(zhì)粒 EcoR I 酶切鑒定圖22為分離株與其他⑶V疫苗株H基因同源性比較結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明具體實(shí)施例中涉及的材料及試劑I、細(xì)胞與毒株犬腎細(xì)胞(MDCK)、293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物庫。pMD18_T克隆載體購自寶生物工程(大連)有限公司，P⑶H-CMV-MCS-EFI-GFP-T2A-Puro載體，慢病毒包裝載體 pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G，購自 SBI 公司。CDV 標(biāo)準(zhǔn)毒株 Snyder Hill，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection, ATCC)，ATCC 編號(hào)VR-158TM。2、常用生物學(xué)試劑DMEM 培養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，Ex Taq 酶，DNA Marker DL2000, Ex Taq 聚合酶，dNTP，Ribonuclease Inhibitor (40U/ μ L),M-MLV Reverse Transcriptase (200U/yL)均購自寶生物工程(大連)有限公司；Trizol購自Invitrogen公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自Axygen公司；嘌呤霉素購自Sigma公司3、主要儀器設(shè)備臺(tái)式低溫高速離心機(jī)Beckman Avanti30型；
超高速離心機(jī)Beckman ；PCR 循環(huán)儀BI0_RADCYCLER ；CR21型高速立式離心機(jī)日本日立(HITACHI)公司；KADAK 凝膠成像分析系統(tǒng)ALPHA INNOTECH MULTILMAGE ；DHP-9162型恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；電子天平METTLER AE240 ；核酸電泳儀DYY-III-8B型；791型磁力攪拌器上海南匯電訊器材廠；立式超低溫保存箱青島海爾特種電器有限公司；CENTRIFUGE 5810R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)艾本德(EPPEND0RF)公司；生物安全柜LABL0NC0PURIRIER;普通光學(xué)顯微鏡OLYMPUS CKX31型；恒溫水浴槽DK-80型購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床ZHWY-2102C購自上海智城分析儀器制造有限公司；實(shí)施例I慢病毒介導(dǎo)表達(dá)犬源SLAM MDCK-CSL細(xì)胞系的建立一、方法I犬源SLAM重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建I. I慢病毒表達(dá)載體信息選擇慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A-Puro(SBI:CD513B-l)(Transfer Vector)為載體(載體圖譜如圖I所示)。將犬源SLAM目的基因構(gòu)建到該載體后同包裝質(zhì)粒及包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞包裝出慢病毒顆粒。I. 2pCDH-CMV-MCS-EFI-GFP-T2A-Puro-SLAM 載體構(gòu)建l)pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A-Puro 載體酶切pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A-Puro 使用 Saw I 進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系
,Vmv I (10 /μ )1.0 μ
IOxH Buffer4.0 μ Plasmid DNA (500 ng/μ )10.0 μL
_ddHQ_25.0 μL
Total40.0 μ
充分混勻后置37°C水浴4h，1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。2)載體去磷將I)中酶切獲得的載體片段做載體去磷
權(quán)利要求
1.一株犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系，命名為MDCK-CSL，其特征在于所述的細(xì)胞系保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC No. 5881，保藏日期為2012年3月6日。
2.權(quán)利要求I所述的犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系在培養(yǎng)或分離犬瘟熱病毒中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的犬瘟熱病毒為犬瘟熱病毒野毒株。
4.一種用于分離犬瘟熱病毒野毒株的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)疑似犬瘟熱病病料的采集及處理 采集疑似犬瘟熱病毒感染的動(dòng)物糞便及血液，將其混合物經(jīng)磷酸緩沖液重懸混勻后，4°C離心，取上清經(jīng)濾膜除菌后分裝于-70°C備用； (2)病毒在MDCK-CSL的增值 權(quán)利要求I所述的犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系MDCK-CSL培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)至80%單層后，棄去培養(yǎng)基經(jīng)磷酸緩沖液清洗2遍后，將步驟(I)處理過的病料上清接種于MDCK-CSL細(xì)胞感作2h后,棄去上清后換維持液培養(yǎng)至80%病變后收獲病毒； (3)病毒RNA的提取及cDNA合成 病變的MDCK-CSL細(xì)胞反復(fù)凍融3次后經(jīng)提取病毒RNA，進(jìn)行cDNA合成； (4)⑶V疑似病料的RT-PCR鑒定及H基因的擴(kuò)增、克隆 利用現(xiàn)有的RT-PCR方法鑒定該疑似病料，并利用合成的用于擴(kuò)增CDV H基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物克隆于pMD18-T中，進(jìn)行酶切鑒定。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(4)中用于CDV疑似病料的RT-PCR鑒定的引物為N I 上游 5’ -GATCATAGACGACCCTGATG-3’N I 下游 5，-GACCCTTCGTCTACAATTTTG-3 。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(4)中用于擴(kuò)增CDVH基因的引物為上游5’ -GGGGTACCGCCACCATGCTCTCTTACCAAGACAAG-3下游5’ -AAGCGGCCGCTACCATCAAGGTTTTGAAC-3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用慢病毒四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，獲得了一株表達(dá)犬源SLAM的穩(wěn)定細(xì)胞系MDCK-CSL，其菌種保藏編號(hào)為CGMCC No.5881。通過比較CDV標(biāo)準(zhǔn)株在MDCK-CSL和MDCK細(xì)胞上的繁殖情況，表明CDV-Snyder Hill標(biāo)準(zhǔn)毒株感染MDCK-CSL細(xì)胞系24小時(shí)即可觀察到細(xì)胞相互融合、圓縮、明顯死亡等細(xì)胞病變；而感染MDCK細(xì)胞持續(xù)6天僅表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，未出現(xiàn)細(xì)胞病變。本發(fā)明建立的CDV敏感細(xì)胞系MDCK-CSL，為CDV野毒株的分離及其完整的生物學(xué)特性研究提供了技術(shù)平臺(tái)，也為犬瘟熱病的防控奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/91GK102807970SQ201210152860
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月17日
發(fā)明者姜騫, 曲連東, 林歡, 劉加森, 郭冬春, 司昌德 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所