專利名稱：紅色熒光特異性標記線粒體細胞系的建立及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種紅色熒光特異性標記線粒體的細胞系
V-Mito的建立及應用。
背景技術：
線粒體為細胞內的能量轉換細胞器，廣泛存在于各類真核細胞中，通過氧 化磷酸化將質子濃度梯度轉換為ATP，為細胞的各種生命活動提供能量。線粒 體的主要功能是進行氧化磷酸化和儲積鈣離子，在動物細胞中，80%以上的ATP 是在線粒體中合成的。它含有自身的DNA，是細胞的一種半自主性細胞器。 線粒體形態(tài)一般呈線狀或點狀，在細胞質中均勻分布，當細胞的代謝和能量需 求狀態(tài)改變時，線粒體可在細胞質中自由移動。線粒體參與代謝，鈣信號與細 胞凋亡等多種生物學活動，很多疾病的發(fā)生與線粒體的異常有關，實時檢測線 粒體的變化與疾病發(fā)生的關系具有重要的研究與應用價值。采用熒光成像顯微 技術實時監(jiān)測細胞的生物學活動具有高靈敏性、高時效性等諸多優(yōu)點。通常情 況下，線粒體的標記多采用特異性染料對線粒體進行染色，雖然用熒光染料可 以觀察一些細胞器的形態(tài),但該方法有很大的缺點和局限性，但這些染料不能長 時間對線粒體進行標記，并且會對細胞產生一定的毒性,在處理過程中必須染 色，而染色往往會影響細胞狀態(tài)，同時干預了藥物的作用和對細胞的相關處理。 另外，光漂白現(xiàn)象也較明顯,隨著激光共聚焦顯微鏡、活細胞工作站及全內反射 熒光顯微鏡的成像技術的應用和發(fā)展，熒光染料已很難滿足對細胞器進行長期 地觀察。更重要的是，當今的研究對研究材料盡量符合生理狀態(tài)的要求更高， 而熒光染料必須添加染色這一步驟，而且染色的方法、染色的濃度都對細胞狀 態(tài)影響很大，同時某些染料的不穩(wěn)定性也影響了相關研究結果和進程。而且實 驗人員在配制熒光染料時需要防護，長時間接觸也會對實驗人員造成傷害。
熒光蛋白作為分子標簽，在生物學尤其是在細胞生物學研究方面具有廣泛 的應用，是現(xiàn)階段細胞內分子事件"可視化"的重要技術。第一個熒光蛋白是從 水母(Aequorea victoria)中克隆的綠色熒光蛋白(GFP)，綠色熒光蛋白已經廣泛 用于蛋白質分子標記和細胞內分子示蹤，促進了生物學的研究，不足的是，這些熒光蛋白的發(fā)射光譜局限在440 529nm，激發(fā)和發(fā)射波長較短，能激發(fā)細 胞內的某些物質產生熒光，細胞內成像時背景較高。1999年報道了第一個紅色 熒光蛋白drFP583(DsRed)，其優(yōu)點是激發(fā)和發(fā)射波長較長，細胞內成像背景 低。應用熒光蛋白對細胞器進行標記成像，實時監(jiān)測細胞的生物學活動具有高 靈敏性、高時效性等諸多優(yōu)點。本發(fā)明所要解決的技術問題就是建立一種紅色 熒光蛋白特異性標記線粒體的細胞系，細胞的細胞器線粒體在激發(fā)光下能穩(wěn)定 發(fā)出紅色熒光，特異性地顯示出線粒體形態(tài)。該紅色熒光特異性標記線粒體的 細胞系，對細胞無損傷，不影響細胞生物學活性，遺傳性能穩(wěn)定，可多次傳代， 無限增殖，使用方便，成本低廉。該細胞系在細胞正常和非正常生理狀態(tài)下及 其在病原菌或病毒感染狀態(tài)下的研究方面有著廣闊的應用前景，為深入研究線 粒體的功能及其與疾病的關系奠定基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種紅色熒光特異性標記線粒體的細胞系，是一種線 粒體特異性標記的Vero細胞系，其細胞的細胞器線粒體在激發(fā)光下能穩(wěn)定發(fā) 出紅色熒光，特異性地顯示出線粒體形態(tài)，其微生物保藏號為 CGMCCNO.2770,命名為Vero細胞，微生物(株)是V-Mto，保藏單位是 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期是2008年12月4 曰。
本發(fā)明提供的細胞系通過以下方案建立在脂質體LipofectamineTM2000 介導下將超純質粒pDsRed2-Mito轉染80%單層鋪滿的Vero細胞，經含G418
的培養(yǎng)基進行篩選陽性克隆，激光共聚焦顯微鏡觀察，線粒體特異性染料進行 染色，反復傳代、凍存、復蘇建立穩(wěn)定的紅色熒光特異性標記線粒的細胞系 V德o。
本發(fā)明的第二個目的是提供所述的紅色熒光特異性標記線粒體的細胞系 V-Mito在線粒體功能研究中的應用。
所述的紅色熒光特異性標記線粒體的細胞系V-Mito在細胞正常和非正常 生理狀態(tài)下其線粒體變化的研究。
所述的紅色熒光特異性標記線粒體的細胞系V-Mito在細胞正常生理狀態(tài) 下其線粒體研究和病原菌或病毒感染狀態(tài)下其線粒體研究。
發(fā)明提供的線粒體特異性標記的Vero細胞系的優(yōu)勢表現(xiàn)在(1)線粒體 特異性標記的Vero細胞系，對細胞無損傷，不影響細胞生物學活性；(2)線 粒體特異性標記的Vero細胞系遺傳性能穩(wěn)定，可多次傳代，無限增殖，使用 方便，成本低廉；(3)線粒體特異性標記的Vero細胞系可用于細胞在正常和 非正常生理狀態(tài)下其線粒體研究。


圖l:本發(fā)明提供的線粒體標記的細胞V-MitO克隆島。
圖2:本發(fā)明提供的線粒體標記的細胞V-Mito線粒體熒光觀測。
圖3:本發(fā)明提供的線粒體標記的細胞V-Mito線粒體染料標記觀測。
圖4:本發(fā)明提供的線粒體標記的細胞V-Mito陽性率觀測。
圖5:本發(fā)明提供的線粒體標記的細胞V-Mito細胞增殖曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明結合附圖和實施例作進一步的說明。 實施例l
本實施例描述了本發(fā)明提供的紅色熒光特異性標記線粒體的Vero細胞系 的篩選方法。
(一) Vero細胞G418篩殺濃度的確定 接種Vero細胞于6孔板，待細胞生長至80%單層時吸去培養(yǎng)基，分別用
200pg/ml、 400(xg/ml、 600|ag/ml、 800^ig/ml和1000iig/ml的G418的培養(yǎng)基進行篩 殺。每3天分別更換培養(yǎng)基一次(各組培養(yǎng)基含G418濃度不變)，持續(xù)培養(yǎng)2周， 根據(jù)細胞死亡情況確定篩殺Vero細胞的G418濃度。
結果表明用不同濃度的含G418的培養(yǎng)基進行篩殺Vero，每3天分別更 換培養(yǎng)基一次，持續(xù)培養(yǎng)2周，根據(jù)細胞死亡情況確定篩殺Vero細胞的G418 最佳濃度為800嗎/ml。
(二) 陽性細胞克隆的篩選
應用超純質粒提取試劑盒(Promega公司)制備超純質粒pDsRed2-Mito， 在脂質體LipofectamineTM2000 (Invitrogen公司)介導下將其轉染80°/。單層 鋪滿的Vero細胞，轉染方法按LipofectamineTM2000說明書進行。在6孔板上 接種2xl(^細胞/孔(2ml/孔)；C02培養(yǎng)箱37-C培養(yǎng)細胞至80。/。鋪滿(24 48hrs)。 由于轉染效率對細胞匯集度很敏感，因此，各個實驗都要維持標準的細胞接種 方案及平均的細胞匯集度；棄去細胞培養(yǎng)液，用PBS洗一次，接著加入2ml/ 孔OPTI-MEM， 37。C培養(yǎng)lh;在此期間，按每孔含量2叫DNA質粒/100pl OPTI-MEM，以及10plLipofectamine/10(^lOPTI-MEM計算轉染量，分別在幾 個1.5ml eppendorf中混合DNA質粒-培養(yǎng)基、脂質體-培養(yǎng)基，室溫放置20min; 質粒加入Lipofectamine中，輕輕吹打混勻，室溫放置30min，使DNA-脂質體 復合物形成；每eppendorf管補加700~800|il OPTI-MEM稀釋復合物，混勻后 加至已培養(yǎng)lh并棄去培養(yǎng)基的6孔板每孔細胞上，37'C培養(yǎng)6h;用PBS洗2次，，加入2ml正常DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；轉染48小時后，將培養(yǎng)基更換為含G418的培養(yǎng)基(G418濃度為上述實驗中確認的濃度800pg/ml)，每3天更換培養(yǎng)基一次(含G418)，持續(xù)培養(yǎng)2周；在熒光倒置顯微鏡下觀測克隆島的形成，待抗性克隆生長至克隆島時，挑取克隆島至24孔板，用正常培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)；待各克隆島在24孔板中生長至單層后，轉移至6孔板，用含G418的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；生長至單層后轉移至培養(yǎng)瓶擴大培養(yǎng)。
結果表明超純質粒pDsRed2-Mito轉染Vero細胞，經含800(ig/ml G418的培養(yǎng)基篩殺2周后，可形成線粒體標記的Vero細胞克隆島(參見圖l)，擴大培養(yǎng)后獲得紅色熒光特異性標記線粒體的細胞系V-Mito。
實施例2
本實施例描述了本發(fā)明提供的紅色熒光特異性標記線粒體的細胞系V-Mito的鑒定。
(一) 激光共聚焦顯微鏡觀察
挑取抗性克隆島擴大培養(yǎng)后，將細胞種植于玻璃底的35mm培養(yǎng)皿中，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。掃描參數(shù)設定為激發(fā)波長設定為488nm，檢測激發(fā)波長為585 nm，分辨率為512x512，采用8 bit。熒光圖像經過軟件得到圈定細胞區(qū)域的熒光強度。
結果表明本發(fā)明提供的紅色熒光特異性標記線粒體的細胞系V-Mito在激光共聚焦顯微鏡下掃描，可見細胞線粒體被紅色熒光蛋白特異性地標記(參見圖2)。
(二) 線粒體特異性標記染料鑒定待線紅色熒光特異性標記線粒體的細胞系V-Mito在培養(yǎng)瓶生長70-80%時
進行傳代，種植于玻璃底面的35mm培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時之后。用PBS (pH7.4， 37°C)沖3次，加入Rhodamine 123 (Invitrogen公司)37°C孵育30min， PBS沖洗3次。使用用激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss 510)雙通道檢測，激發(fā)波長為488/545nm，檢測波長545/585nm，
結果表明本研究應用Rhodamine 123熒對建立的線粒體標記的細胞系進行染色，在激光共聚焦顯微鏡下對同一細胞在紅色激發(fā)光和綠色激發(fā)光分別進行觀測，可見線粒體特異性染料標記的亞細胞單位線粒體與建立的細胞系本身標記的細胞亞單位在同一位置(參見圖3，其中A:線粒體標記細胞系V-Mito觀測，B:熒光染料染色觀測，C: 二者疊加圖)，說明建立的細胞系成功標記
6了線粒體。
實施例3
本實施例描述了本發(fā)明提供的紅色熒光特異性標記線粒體的細胞系 V-Mito穩(wěn)定性情況。
將上述建立的紅色熒光特異性標記線粒體的細胞系V-Mito在無G418的正 常培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞生長至單層后，進行傳代培養(yǎng)，在無G418的正常培 養(yǎng)基中反復傳代30次，觀測細胞系的穩(wěn)定性。將上述建立的線粒體特異性標 記的細胞系V-Mito傳代30次后，凍存于液氮罐中， 一周后復蘇細胞，加正常 培養(yǎng)基培養(yǎng)，再次凍存于液氮罐中，反復進行3次，觀測線粒體標記Vero細 胞的熒光蛋白表達情況。
結果表明建立的線粒體標記Vero細胞系V-Mito在無G418的正常培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，反復傳代30次和反復凍存復蘇3次，線粒體標記Vero細胞系陽性 率仍能高達95%以上(參見圖4 )，說明建立的紅色熒光特異性標記線粒體的 細胞系V-Mito遺傳性能穩(wěn)定性。
實施例4
本實施例描述了本發(fā)明提供的紅色熒光特異性標記線粒體的細胞系 V-Mito的增殖情況。
MTT法(噻唑藍比色分析法)檢測V-Mito的增殖情況。將V-Mito和正常Vero 細胞分別接種于96孔板(細胞接種量為3000個/孔)，每個樣品設3個重復，分 別于接種后ld、 2d、 3d、 4d、 5d后進行MTT檢測。檢測步驟如下:將濃度為 5mg/mL的MTT以每孔20^1加入待測96孔板內，37。C培養(yǎng)4h,棄上清液，每孔 加DMSO 200pl并振蕩15min，測定OD490值(參考波長630nm),應用SPSS 軟件進行統(tǒng)計分析，繪制細胞增殖曲線。
結果表明分別于接種后ld、 2d、 3d、 4d、 5d后進行MTT檢測表明細 胞系V-Mito和正常Vero細胞增殖速度差異無顯著性(P>0.05)，細胞增殖曲線 一致(參見圖5)，說明線粒體標記的細胞系對細胞無損傷，不影響細胞生物學 活性。
權利要求
1. 一種紅色熒光特異性標記線粒體細胞系，其特征在于所述細胞的細胞器線粒體在激發(fā)光下能穩(wěn)定發(fā)出紅色熒光，特異性地顯示出線粒體形態(tài)，其微生物保藏號為CGMCC NO.2770，命名為Vero細胞，微生物(株)是V-Mito，所述細胞系通過以下方案建立在脂質體LipofectamineTM2000介導下將超純質粒pDsRed2-Mito轉染80％單層鋪滿的Vero細胞，經含G418的培養(yǎng)基進行篩選陽性克隆，激光共聚焦顯微鏡觀察，線粒體特異性染料進行染色，反復傳代、凍存、復蘇建立穩(wěn)定的紅色熒光特異性標記線粒的細胞系V-Mito。
2. 根據(jù)權利要求1所述的紅色熒光特異性標記線粒體細胞系在線粒體功能研究中的應用。
3. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于所述細胞系在正常和非正常生理狀態(tài)下對其線粒體變化的研究。
4. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于所述細胞系在正常生理狀態(tài)下對其線粒體研究和病原菌或病毒感染狀態(tài)下對其線粒體研究。
全文摘要
本發(fā)明提供一種紅色熒光特異性標記線粒體的Vero細胞系V-Mito，通過在脂質體LipofectamineTM2000介導下將超純質粒pDsRed2-Mito轉染Vero細胞，經含G418的培養(yǎng)基進行陽性克隆篩選，挑取陽性克隆擴大培養(yǎng)建系，命名為V-Mito。所述細胞的細胞器線粒體在激發(fā)光下能穩(wěn)定發(fā)出紅色熒光，特異性地顯示出線粒體形態(tài)。紅色熒光特異性標記線粒體的細胞系V-Mito，對細胞無損傷，不影響細胞生物學活性，遺傳性能穩(wěn)定，可多次傳代，無限增殖，使用方便，成本低廉。細胞系V-Mito在細胞正常和非正常生理狀態(tài)下及其在病原菌或病毒感染狀態(tài)下的研究方面有著廣闊的應用前景。
文檔編號G01N21/64GK101497875SQ20081016419
公開日2009年8月5日 申請日期2008年12月29日 優(yōu)先權日2008年12月29日
發(fā)明者漣 于, 侯賢宏, 章曉棟, 魏永偉 申請人:浙江大學