專利名稱：一株大豆抗原蛋白降解菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域，涉及一株大豆抗原蛋白降解芽孢桿菌菌株及其在發(fā)酵豆柏生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豆柏是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白飼料，具有蛋白含量高，氨基酸組成合理，動(dòng)物對(duì)其利用率高的特點(diǎn)。近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)大豆中含有豐富的提高動(dòng)物免疫力的大豆異黃酮等物質(zhì)，更是受到人們的歡迎。但是豆柏中存在的大豆抗原蛋白是一種熱穩(wěn)定性抗?fàn)I養(yǎng)因子，嚴(yán)重影響到仔豬等幼齡動(dòng)物的機(jī)體健康和生長(zhǎng)速度，表現(xiàn)為小腸結(jié)構(gòu)受損，食糜滯留時(shí)間縮短，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收紊亂，導(dǎo)致消化不良、腹瀉和生長(zhǎng)受阻?，F(xiàn)已確定仔豬對(duì)大豆抗原蛋白的過(guò)敏反應(yīng)是引起仔豬腹瀉的主要原因之一。如何降低和去除豆柏中的大豆抗原蛋白，進(jìn)而提高豆柏的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和安全性成為飼料工作者研究的熱點(diǎn)。大豆抗原蛋白的熱穩(wěn)定性強(qiáng)，是大豆中對(duì)動(dòng)物(特別是幼齡動(dòng)物)影響最大的一類抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)。在去除豆柏中大豆抗原蛋白的方法中，利用生物酶處理豆柏效果較好，但是成本較高，而微生物發(fā)酵法作為一種無(wú)害的、高效的、低成本的處理方法成為目前處理豆柏的一種趨勢(shì)。但是從目前市場(chǎng)來(lái)看，質(zhì)量良莠不齊，同一產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，是發(fā)酵豆柏產(chǎn)品的主要問(wèn)題。這主要是由于發(fā)酵用的菌種性能不穩(wěn)定，產(chǎn)酶能力不高，針對(duì)性差等原因所導(dǎo)致。因此獲得能夠降解豆柏中大豆抗原蛋白、高產(chǎn)蛋白酶和性能穩(wěn)定的菌株是生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的發(fā)酵豆柏，提高豆柏的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和安全性的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)豆柏中存在的大豆抗原蛋白會(huì)引起仔豬腹瀉和生長(zhǎng)受阻 這一問(wèn)題，提供一株能夠降解豆柏中大豆抗原蛋白的高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌菌株。本發(fā)明生產(chǎn)的菌株能夠降解豆柏中的大豆抗原蛋白，降低其對(duì)仔豬的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高豆柏在仔豬飼料中的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該枯草芽孢桿菌菌株在發(fā)酵豆柏中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一株大豆抗原蛋白降解菌株，該菌株命名為枯草芽孢桿菌(feci77i/5· subtil is)HN013，已于2012年2月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 5788。所述的枯草芽孢桿菌菌株的個(gè)體形態(tài)特征為細(xì)胞大小通常為(0.7μπι
O.8 μ m) X (2. O μ m 3. O μ m),桿狀,很少成連,無(wú)莢膜,芽孢呈橢圓形或柱形，中生或偏生。菌落形態(tài)為規(guī)則圓形，白色，表面濕潤(rùn)，中間隆起，邊緣光滑。所述的枯草芽孢桿菌菌株的主要生理生化特性為革蘭氏反應(yīng)陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性，能發(fā)生乙酰甲基甲醇反應(yīng)；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖產(chǎn)酸，能水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；培養(yǎng)溫度20°C 40°C，最適生長(zhǎng)溫度23°C 25°C，pH6 8，最佳pH7. 2。產(chǎn)蛋白酶能力較高，達(dá)到539. 5 U/mL。該菌株的16 S rDNA序列全長(zhǎng)共1463 bp,經(jīng)Genbank比對(duì)相似性達(dá)至Il 99. 8% 確定為枯草芽孢桿菌。有益效果
本試驗(yàn)通過(guò)初篩、復(fù)篩，最終得到一株能夠降解豆柏中大豆抗原蛋白的高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌菌株HN013，對(duì)其生物學(xué)特性和產(chǎn)蛋白酶能力進(jìn)行了研究，并在發(fā)酵豆柏中的得到了成功應(yīng)用。該菌株能夠降解豆柏中的大豆抗原蛋白，降低其對(duì)仔豬的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高豆柏在仔豬飼料中的應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施例方式實(shí)施例I枯草芽孢桿菌subti I is) HNO13菌株的獲得
I、培養(yǎng)基
富集培養(yǎng)基牛肉膏3g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水lOOOmL，調(diào)節(jié)pH至7. 2 ;初篩培養(yǎng)基牛肉膏3 g，酪素10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水lOOOmL，調(diào)節(jié)pH至7. 2 ;種子培養(yǎng)基葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g, KH2PO4 I g, MgSO4 0. 2 g, Na2CO3 10 g,蒸懼水IOOOmL,調(diào)節(jié)pH至7. 2 ;發(fā)酵培養(yǎng)基豆柏40 g，蒸餾水IOOOmL,調(diào)節(jié)pH至7. 2 ;固體斜面培養(yǎng)基葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，KH2PO4 I g，MgSO4 0· 2 g，Na2CO3 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水IOOOmL,調(diào)節(jié)pH至7. 2 ;
分離培養(yǎng)基(以大豆抗原蛋白為唯一氮源)的制備粉碎過(guò)60目篩的豆柏樣品5g,以
0.03mol/L pH 8. 8 的 Tris-HCl 緩沖液(含 0. 01mol/L 亞硫酸鈉)按 I 20 (ff/V, g/mL)料液比浸提。37°C下，180r/min提取I h，取出，將pH值調(diào)回8. 8。再置搖床180r/min提取I. 5 h, 8000r / min離心20min,取上清并調(diào)pH至4. O,上清渾池,4000r/min離心5min,棄去上清。用蒸懼水溶解沉淀，調(diào)pH至 · 2,加上2. 5g葡萄糖、NaCl 0. 2g、K2HPO4 0. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 2g，加蒸餾水定容至 1000mL，加瓊脂 15g，115°C滅菌 20min。2、菌株的分離純化
取10 g遼寧錦州地區(qū)長(zhǎng)期存放豆柏的土壤置于已加入90 mL無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，漩渦混合儀上震蕩2min，靜止30min，80°C水浴加熱20min，殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。取IOmL所得液加入到IOOmL富集培養(yǎng)基中，25°C，160r/min搖床培養(yǎng)24h。用無(wú)菌生理鹽水對(duì)富集培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行梯度稀釋至10_4，分別取10_2、10_3、10_4稀釋液各0. ImL涂布于分離培養(yǎng)基平板上，25°C培養(yǎng)24 h,挑選出不同菌落形態(tài)的革蘭氏陽(yáng)性菌接入固體斜面培養(yǎng)基中，置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，放入4°C冰箱中保藏，待篩選。、3、產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩
大試管(2.0 cmX 20 cm)內(nèi)裝5 mL富集培養(yǎng)基，分別接入上述分離菌株，25°C條件下160 r/min旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)48 h,發(fā)酵液經(jīng)3500r/min離心后，以0. 5 cm直徑圓形濾紙片沾上清液貼于初篩培養(yǎng)基平板上，于25°C保溫24 h，形成蛋白酶水解圈，然后用直尺測(cè)蛋白酶水解圈直徑，選出水解圈直徑和菌落直徑的比值(R/r)大于3的菌株。4、搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)復(fù)篩高產(chǎn)蛋白酶的菌株
將初篩得到的菌株經(jīng)斜面活化后，接一環(huán)于種子培養(yǎng)基中，25°C條件下160 r/min振蕩培養(yǎng)12h，按5%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，25°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)48 h，3500 r/min離心30min，取上清液測(cè)蛋白酶活力。采用Folin-酚法測(cè)定蛋白酶的活力。酶活定義1 mL酶液在pH 7. 2、40°C下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生Iyg酪氨酸的酶量為一個(gè)酶活力單位，以“U /mL”表示。篩選酶活力大于538. O U/mL的菌株。5、菌種鑒定通過(guò)菌體的群體形態(tài)觀察、個(gè)體形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)結(jié)果及菌株的16 S rDNA序列對(duì)菌株進(jìn)行菌種鑒定。經(jīng)產(chǎn)蛋白酶能力的初篩、復(fù)篩最終得到I株能夠降解豆柏中大豆抗原蛋白的高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌菌株，通過(guò)菌體的群體形態(tài)觀察、個(gè)體形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)結(jié)果及菌株的16 S rDNA序列比對(duì)，確定該菌株為芽孢桿 菌科芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌，命名為枯草芽孢桿菌(feci77心subtilis)mQn,已于2012年2月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院，中科院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5788。實(shí)施例2枯草芽孢桿菌subti I is) HNO13在發(fā)酵豆柏中的應(yīng)用
I、試驗(yàn)材料
(1)普通豆柏；
(2)枯草芽孢桿菌UaciBm種子培養(yǎng)液；枯草芽孢桿菌Al (本實(shí)驗(yàn)室保藏，一株發(fā)酵豆柏生產(chǎn)菌株，作為對(duì)照菌)種子培養(yǎng)液。2、試驗(yàn)方法
豆柏粉碎后過(guò)10目篩，過(guò)篩后的豆柏與水按1:1 (ff/V, g/mL)混合均勻，分為3組，接種量為水體積的5%。I組為空白對(duì)照，加入蒸餾水5% ；2組為枯草芽孢桿菌Al對(duì)照組，加入Al種子培養(yǎng)液5% ；3組為試驗(yàn)組，加入枯草芽孢桿菌subtiHsmQU種子培養(yǎng)液5% ;分別混合均勻，于25°C密閉條件下培養(yǎng)48h。3、指標(biāo)測(cè)定
(1)發(fā)酵樣品抗原蛋白殘留率測(cè)定發(fā)酵結(jié)束后，將各組樣品在50°C烘箱中烘干。每種樣品各稱取I. OO g，加入20 mL O. 03 mo I / L的Tris — HCl抽提緩沖液研磨勻漿，修正各樣品pH值為8.0，浸泡I h后離心(轉(zhuǎn)速8000 r / min，時(shí)間10 min)去渣，調(diào)節(jié)上清液pH值為4. 5,離心(轉(zhuǎn)速10 000 r / min,時(shí)間15 min),上清液干燥稱重即為各樣品中抗原蛋白的質(zhì)量，抗原蛋白的殘留率按下式計(jì)算
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(2)三氯乙酸可溶性氮(TCA-NSI)含量的檢測(cè)參考QB/T2653— 2004大豆肽粉，用于評(píng)定大豆蛋白的降解程度。4、結(jié)果
從表I中可以看出，枯草芽孢桿菌(feci77w5· 5^ii7i5·) HN013發(fā)酵豆柏后抗原蛋白殘留率最低，與枯草芽孢桿菌Al相比，抗原蛋白殘留率降低87. 4%，說(shuō)明枯草芽孢桿菌{Bacillus subtilis)\MOl >菌株降解抗原蛋白的能力較強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.一株大豆抗原蛋白降解菌株，該菌株保藏名稱為枯草芽孢桿菌{Bacillus保藏日期2012年2月24日，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5788。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー株大豆抗原蛋白降解菌株，其特征在于，個(gè)體形態(tài)特征為細(xì)胞大小通常為(0. 7iim 0. 8iim)X(2. Oiim 3. Oii m)，桿狀，很少成連，無(wú)莢膜，芽孢呈橢圓形或柱形，中生或偏生；菌落形態(tài)為規(guī)則圓形，白色，表面濕潤(rùn)，中間隆起，邊緣光滑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー株大豆抗原蛋白降解菌株，其特征在于，主要生理生化特性為革蘭氏反應(yīng)陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性，能發(fā)生こ酰甲基甲醇反應(yīng)；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖產(chǎn)酸，能水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；培養(yǎng)溫度20°C 40°C，最適生長(zhǎng)溫度23。。 25°C，pH6 8，最佳pH7.2 ;產(chǎn)蛋白酶能力較高，達(dá)到539.5 U/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー株大豆抗原蛋白降解菌株的應(yīng)用，其特征在于，用于發(fā)酵豆柏中。
全文摘要
一株大豆抗原蛋白降解菌株(Bacillussubtilis)HN013，該菌株于2012年2月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.5788；該菌株具有降解豆粕中大豆抗原蛋白和高產(chǎn)蛋白酶的特性，在發(fā)酵豆粕生產(chǎn)中應(yīng)用可以降低大豆抗原蛋白含量，同時(shí)增加發(fā)酵豆粕中大豆多肽的含量，提高豆粕的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102660480SQ20121014718
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者張莉力, 王安民, 田玉民, 蘇玉虹, 許云賀, 郭福來(lái), 韓麗娟 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)華年飼料有限公司