專利名稱：一種新型單寧酶及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及一種從海底淤泥宏基因組文庫中分離篩選到的一個新型單寧酶基因、異源表達及其應用。
背景技術：
在茶飲料的生產(chǎn)過程中，茶葉的高溫提取液冷卻后會變渾濁，并產(chǎn)生絮狀沉淀(茶乳酪)，這嚴重影響了茶飲料的口感和香氣。茶乳酪的形成過程為溫度較高時，茶提取液中的茶多酚及其氧化物、咖啡堿、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)等物質(zhì)均以游離態(tài)存在，隨著溫度的降低，茶湯中多酚類(尤其是茶黃素、茶紅素及沒食子酸酯等)分別與咖啡堿的酮氨基、蛋白質(zhì)的肽基氫鍵結(jié)合形成絡合物，逐漸發(fā)生凝聚而沉淀下來。在茶飲料生產(chǎn)過程中，需要采取物理、化學或酶處理的方法來消除茶乳酪或使之形成可溶物。用來去除“茶乳酪”的方法有物理法、化學法和酶法。其中，由于酶法較物理法和化學法具有經(jīng)濟、高效和無二次污染等 優(yōu)點，成為當今的主要研究熱點。近些年來，利用純培養(yǎng)技術已從環(huán)境中篩選到能產(chǎn)生單寧酶的微生物，但種類非常有限，主要集中在真菌類的曲霉屬、青霉屬和根霉屬，并且篩選到的這些微生物酶量極少，酶活性也不高，造成生產(chǎn)成本的增加。于是，有研究者從已篩選到的這些微生物中(如米曲霉和植物乳酸桿菌)克隆單寧酶基因，然后將其在工程菌中表達。但是，這些重組降解酶的穩(wěn)定性較差，在實際應用中有一定的局限性。到目前為止，所有的關于單寧酶的研究都是針對于環(huán)境中可培養(yǎng)微生物來展開的。我們知道，環(huán)境中蘊藏著大量的微生物資源，并且這些微生物中超過99%的微生物難以通過傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)的方式進行研究，所以，傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)技術已經(jīng)大大的限制了人們對可產(chǎn)生單寧酶的微生物自愿的利用和開發(fā)。宏基因組學的出現(xiàn)，則解決了這方面的問題，因為它避開了環(huán)境微生物分離培養(yǎng)的難題，直接從環(huán)境樣品中提取基因組總DNA，建立宏基因組文庫，進而從中篩選新的基因或生物活性物質(zhì)。宏基因組文庫包含了環(huán)境中所有的(可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的)微生物遺傳信息，因此，在挖掘和利用環(huán)境中那些不可培養(yǎng)微生物資源方面，有著巨大的潛力，已成為當前國際上微生物學研究的前沿領域和熱點。至今國內(nèi)外學者已經(jīng)通過該技術從環(huán)境中成功的篩選到了如淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、纖維素酶、酯酶/脂肪酶等新基因，并且這些酶具有一些新酶學特性及工業(yè)應用潛力。到目前為止，尚未利用宏基因組技術從環(huán)境中篩選單寧酶基因的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的提供一種新型單寧酶及所述新型單寧酶的cDNA。本發(fā)明的第二個目的是提供一種上述新型單寧酶的宏基因組學的克隆方法。本發(fā)明的第三個目的是提供一種含有上述單寧酶cDNA的表達載體。本發(fā)明的第四個目的是提供一種利用上述表達載體構(gòu)建的重組單寧酶及其制備方法，以及所述重組單寧酶的應用。
為實現(xiàn)本發(fā)明的第一個目的，采取的技術方案為一種新型單寧酶，所述單寧酶的氨基酸序列如如SEQ ID NO. 3所示。一種上述新型單寧酶的cDNA，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。為實現(xiàn)本發(fā)明的第二個目的，采取的技術方案為一種上述新型單寧酶的宏基因組學克隆方法，包含以下步驟提取南海海洋淤泥總DNA并純化，將純化后的總DNA經(jīng)BamHI酶切處理后，連接到pUC118載體上，電擊轉(zhuǎn)化導入大腸桿菌DH5 a中建立宏基因組文庫，通過高通量篩選得到陽性克隆子，經(jīng)測序和BLAST比較并設計引物，從而克隆到目的片段。為實現(xiàn)本發(fā)明的第三個目的，采取的技術方案為一種包含如上所述的新型單寧酶的cDNA的表達載體。
為實現(xiàn)本發(fā)明的第四個目的，采取的技術方案為一種重組單寧酶的制備方法，包括以下步驟用權(quán)利要求4所述的表達載體轉(zhuǎn)化寄主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重
組單寧酶。優(yōu)選地，上述所述重組單寧酶的制備方法中，所述寄主細胞是大腸桿菌。優(yōu)選地，所述重組單寧酶的制備方法具體包括以下步驟用權(quán)利要求4所述的目的片段經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切，與pET_28a (+)載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導，得到高效可溶性表達。優(yōu)選地，上述所述重組單寧酶的制備方法中，所述的IPTG終濃度為0. 4禮，誘導溫度為25°C。一種采用如上所述方法制備得到的重組單寧酶。一種上述所述的重組單寧酶在降解沒食子酸丙酯、單寧酸、素兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、綠原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯中的應用。所述重組單寧酶對兒茶素及其它底物有降解作用。本發(fā)明的有益效果為(I)本發(fā)明從海底淤泥宏基因組文庫中篩選到一個單寧酶基因，通過基因工程技術對其功能研究，發(fā)現(xiàn)該基因在大腸桿菌中高效可溶表達，經(jīng)蛋白純化及SDS-PAGE電泳，得到一條單一的蛋白條帶，減去融合蛋白，初步確定該單寧酶的分子量約為54kDa。(2)本發(fā)明將SEQ ID NO. I所示的DNA序列克隆到原核表達載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過對陽性克隆子的誘導表達得到重組蛋白，研究其酶學性質(zhì)，結(jié)果如下
①在大腸桿菌表達體系中，該重組蛋白具有高效可溶性表達。②以沒食子酸丙酯為底物，測的重組蛋白的最適反應溫度為30°C，在溫度低于45°C時較為穩(wěn)定，45°C保溫12h仍保有75%的相對酶活性；最適反應pH為6. 4，在中性或弱酸性條件下保存穩(wěn)定；4M的NaCl對其酶活性沒有影響，表現(xiàn)出較高的耐鹽性；測定金屬離子和生化試劑對酶活力影響時發(fā)現(xiàn)，ImMCa2+, Cd2+和Mg2+對其酶活性有激活作用，ImM Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Al3+、EDTA、尿素和Triton X-100對其酶活性沒有明顯的影響，而ImM Ag+、Cr2+、^ -巰基乙醇、Tween 80和PMSF對其的酶活性有強烈的抑制作用。(3)本發(fā)明在研究重組單寧酶以0. 5mg/mL沒食子酸丙酯、單寧酸、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、綠原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯為底物的降解作用時，經(jīng)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，30°C條件下，經(jīng)過40min后，單寧酸、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、綠原酸和阿魏酸乙酯已經(jīng)完全水解，大約有88%的迷迭香酸被水解。


圖I為本發(fā)明實施例I中的SDS-PAGE電泳圖。圖I中，M為標準蛋白分子量maker，I為重組蛋白粗提物，2為純化的重組蛋白。圖2為溫度對重組單寧酶酶活性的影響圖。圖3為溫度對重組單寧酶穩(wěn)定性的影響圖( 代表25°C ;籲代表35°C ;〇代表450C ;■代表 50°C ;□代表 55°C )。圖4為pH對重組單寧酶酶活性的影響圖。 圖5為pH對重組單寧酶穩(wěn)定性的影響圖(■代表pH為5.0 ;A代表pH為6.0 ;口代表pH為7.0 ;〇代表pH為8.0 ; 代表pH為9.0 ; 代表pH為10. 0 ; 代表pH為11. 0)。圖6為NaCl對Tan410酶活性的影響圖。圖7為沒食子酸丙酯、單寧酸、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、綠原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯降解的HPLC分析圖。
具體實施例方式為更好的說明本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點，下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步描述。實施例I宏基因組文庫的建立和陽性克隆子的獲得、基因克隆與表達I、基因組DNA的提取(I)取海底淤泥樣品4g，放入50ml無菌離心管中；(2)加入 13. 5ml DNA 提取液 buffer，37°C，220r/min 搖床震蕩 30min ；(3)加入 I. 5ml 20% SDS ；(4) 65°C水浴2h，期間每隔20min上下輕輕顛倒離心管幾次，混勻；(5)6000父8，4。(離心10111111;(6)取上清，加入等體積的氯仿，上下輕輕顛倒幾次；(7) 16000 X g, 4°C離心 IOmin ;(8)重復(6)、(7)步驟兩次；(9)取上清，加入0. 6v的異丙醇，輕輕混勻后，室溫放置l_2h ；(10) 16000父8，4。(離心20111111;(11)75%的乙醇洗滌兩次；(12)風干后 ddH20 重懸。2、試劑盒法純化DNA :按照膠回收試劑盒說明書進行。3、宏基因組電泳檢測用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA的純度和質(zhì)量4、酶切基因組總DNA :用限制性內(nèi)切酶BamHI部分酶切總DNA，回收3-lOkb的酶切片段，方法同試劑盒法純化DNA。5、酶切片段的電泳檢測方法同宏基因組電泳檢測。6、克隆載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化將回收得到的酶切片段和pUC118/BamHI (BAP)載體連接過夜，連接產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化后與電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞混合，冰上放置5min，轉(zhuǎn)移DNA/細胞混合物至預冷的2_電穿孔容器(無泡)中，對電穿孔容器進行脈沖(2，500V)(檢查時間常數(shù)，應該在4以上)，立即添加900 ii L的LB至電穿孔容器中，37°C，200r/min,震蕩培養(yǎng)45min，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布到含有100 U g/mL氨芐青霉素(Amp)，0. 5mM異丙基-P -D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)和100 UM 5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-半乳糖苷(X-Gal)的平板上，平板倒置放入37°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16-20h。由此構(gòu)建了一個庫容量達96000個轉(zhuǎn)化子、多樣性好的宏基因組文庫。7、文庫篩選和陽性克隆子的鑒定(I)單寧酶基因的初步篩選將文庫中的所有白色轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到含有底物(X-caprylate)篩選培養(yǎng)基上；37°C培養(yǎng)48h后，挑取在篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍色水解圈的克隆子。(2)單寧酶基因的復篩挑取在篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍色水解圈的克隆子，接種到IOml含有100 U g/mLAmp、·
0.5mM IPTG的LB培養(yǎng)基中，37°C，220r/min過夜培養(yǎng)，12000Xg，離心Imin收集菌體，磷酸鹽緩沖液(lOOmM，pH 6.8)洗滌菌體一次，離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液重新懸浮菌體，超聲波破碎菌體，離心收集上清(粗酶液)用作單寧酶活性的檢測。取200 ii L粗酶液，加入200 u L 15mM的沒食子酸丙酯，37°C，水浴5min，接著加入200iiL甲醇繞單寧(0.667%)，37°C放置5min后加入200 u L KOH(0. 5M)，37°C放置5min，能夠使沒食子酸丙酯溶液由橘黃色變?yōu)樽霞t色的為陽性克隆。通過篩選得到一個陽性克隆子(PUC118-13B)。將陽性克隆子的質(zhì)粒送去測序公司進行測序，測序結(jié)果顯示，單寧酶基因的核苷酸序列由1476個堿基組成，其核酸序列如SEQ ID NO. I所示，該DNA編碼的多肽，含491個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，將其命名為Tan410。其中SEQ ID NO. 2為SEQID NO. I 和 SEQ ID NO. 3 的對照圖。8、基因片段的克隆根據(jù)測序結(jié)果設計引物F1和F2，引物兩端引入能插入pET-28a(+)載體的HindIII和BamHI酶切位點，引物序列如下Pl :5 ' -CGCGGATCCATGCTGCCCGCCTTCTGCCGC-3 '，下劃線為 BamHI 酶切位點序列；P2 :5 ' -CCCAAGCTTATAAGTCTTGGGTTCGTAGG-3 '，下劃線為 HindIII 酶切位點序列。利用兩條引物，以質(zhì)粒pUC118-13B為模板進行PCR擴增反應，PCR體系如下
權(quán)利要求
1.一種新型單寧酶，其特征在于，所述單寧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.如權(quán)利要求I所述的新型單寧酶的cDNA，其特征在于，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. I 所示。
3.如權(quán)利要求I所述新型單寧酶的宏基因組學克隆方法，其特征在于，包含以下步驟提取海洋淤泥總DNA并純化，將純化后的總DNA經(jīng)BamHI酶切處理后，連接到pUC118載體上，電擊轉(zhuǎn)化導入大腸桿菌DH5 a中建立宏基因組文庫，通過高通量篩選得到陽性克隆子，經(jīng)測序和BLAST比較并設計引物，從而克隆到目的片段。
4.一種包含如權(quán)利要求2所述的新型單寧酶的cDNA的表達載體。
5.一種重組單寧酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟用權(quán)利要求4所述的表達載體轉(zhuǎn)化寄主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組單寧酶。
6.如權(quán)利要求5所述的重組單寧酶的制備方法，其特征在于，所述寄主細胞是大腸桿菌。
7.如權(quán)利要求6所述的重組單寧酶的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟用權(quán)利要求4所述的目的片段經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切，與pET_28a(+)載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導，得到高效可溶性表達。
8.如權(quán)利要求7所述的重組單寧酶的制備方法，其特征在于，所述的IPTG終濃度為0. 4mM，誘導溫度為25°C。
9.一種采用如權(quán)利要求5所述方法制備得到的重組單寧酶。
10.如權(quán)利要求9所述的重組單寧酶在降解沒食子酸丙酯、單寧酸、素兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、綠原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種新型單寧酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；本發(fā)明還公開了所述新型單寧酶的cDNA，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還公開了含有上述新型單寧酶cDNA的表達載體、重組單寧酶及其制備方法，以及所述重組單寧酶在降解沒食子酸丙酯、單寧酸、素兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、綠原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯中的應用。所述新型單寧酶及重組單寧酶在大腸桿菌表達體系中具有高效的可溶性表達，且該重組單寧酶對單寧酸、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、綠原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯等具有高效降解作用。
文檔編號C12N9/18GK102719413SQ20121013227
公開日2012年10月10日 申請日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者劉玉煥, 姚健, 范新炯 申請人:中山大學