專利名稱：表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，隨著分子遺傳學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外都在嘗試應(yīng)用基因工程技術(shù)來(lái)改造與構(gòu)建高效纖維素降解菌株，由于這些菌株具有獨(dú)特的遺傳特性與生物學(xué)性能，隨之纖維素酶的應(yīng)用范圍在不斷拓展。纖維素酶生產(chǎn)大多采用里氏木霉誘變篩選高產(chǎn)菌株，經(jīng)液態(tài)深層通風(fēng)發(fā)酵精制提取制成。誘變菌株存在性能不穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)幾次傳代后，高產(chǎn)活性往往喪失,因此需要反復(fù)培育新菌株,生產(chǎn)成本大大提高。
基因工程技術(shù)為纖維素酶的生產(chǎn)開(kāi)辟了新途徑，新型的纖維素酶基因的發(fā)現(xiàn)與克隆成功，各種不同性質(zhì)和用途的表達(dá)載體構(gòu)建成功，直到采用不同的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)，涌現(xiàn)了一批新技術(shù)新工藝。其中以細(xì)菌為主的原核細(xì)胞表達(dá)體系首先被用于纖維素酶的生產(chǎn)中，其缺點(diǎn)是酶活性不高，這與細(xì)菌缺乏蛋白質(zhì)翻譯后的加工修飾功能有關(guān)。以啤酒酵母和畢赤酵母為主的真核細(xì)胞表達(dá)體系來(lái)生產(chǎn)纖維素酶獲得人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注，但是發(fā)酵水平較低，一般低于lg/L，仍然無(wú)法滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。目前培育的纖維素酶生產(chǎn)菌種普遍具有容易退化的缺點(diǎn)，需要反復(fù)培育，并且酶產(chǎn)量和活性都不高，生產(chǎn)的菌株的酶活性大多低于300U/mL，酶的酵母發(fā)酵水平低于I克/升。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)提供一種表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株及其在生產(chǎn)纖維素酶方面的應(yīng)用，本發(fā)明的多拷貝纖維素酶基因畢赤酵母菌，具有細(xì)胞外分泌纖維素酶的特性，使得發(fā)酵后酶蛋白的提取純化優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)，經(jīng)過(guò)再生纖維素非晶(RAC)親和層析，得到的酶蛋白純度就能達(dá)到90%，極大地節(jié)約了時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，節(jié)省生產(chǎn)成本，從而提高了經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明的表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株及其應(yīng)用技術(shù)方案是
一種表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株，多拷貝纖維素酶基因整合入分泌型表達(dá)載體，構(gòu)建出酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入畢赤酵母受體菌，得到表達(dá)纖維素酶的重組畢赤酵母菌。所述的多拷貝為2，4，6，8，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 任一拷貝數(shù)。所述畢赤酵母受體菌為巴斯德畢赤酵母GS115。纖維素酶基因多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入畢赤酵母受體菌，得到表達(dá)纖維素酶的重組畢赤酵母菌。具體如下
(1)里氏木酶內(nèi)切酶EGI，GeneBank編號(hào)M15665.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶EGI酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶EGI的重組畢赤酵母菌；
(2)里氏木酶內(nèi)切酶EGII,GeneBank編號(hào)AB003694.I，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶EGII酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶EGII的重組畢赤酵母菌； (3)里氏木酶內(nèi)切酶EGIII，GeneBank編號(hào)M19373.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶EGIII酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶EGIII的重組畢赤酵母菌；
(4)里氏木酶內(nèi)切酶EGIV，GeneBank編號(hào)Y11113.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶EGIV酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶EGIV的重組畢赤酵母菌；
(5)里氏木酶內(nèi)切酶EGV，GeneBank編號(hào)Z33381.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶EGV酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶EGV的重組畢赤酵母菌；
(6)里氏木酶內(nèi)切酶CEL74A，GeneBank編號(hào)AY281371.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶CEL74A酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶CEL74A的重組畢赤酵母菌；
(7)里氏木酶內(nèi)切酶CEL61B，GeneBank編號(hào)AY281372.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶CEL61B酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶CEL61B的重組畢赤酵母菌；
(8)里氏木酶內(nèi)切酶CEL5B，GeneBank編號(hào)AY281373.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶CEL5B酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶CEL5B的重組畢赤酵母菌；
(9)里氏木酶里氏木酶外切酶CBHII,GeneBank編號(hào)M16190. 1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒PPICZaABC中，構(gòu)建出里氏木酶外切酶CBHII M16190. I酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶外切酶CBHII M16190. I的重組畢赤酵母菌。(10)里氏木酶里氏木酶外切酶CBHII ,GeneBank編號(hào)M55080. 1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶外切酶CBHII M55080. I酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶外切酶CBHII M55080. I的重組畢赤酵母菌；
(11)里氏木酶P葡糖苷酶BGLI，GeaneBank編號(hào)U09580.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶P葡糖苷酶BGLI酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶P葡糖苷酶BGLI的重組畢赤酵母菌；
(12)里氏木酶P葡糖苷酶BGLII，GeneBank編號(hào)AB003110.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶P葡糖苷酶BGLII酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶P葡糖苷酶BGLII的重組畢赤酵母菌。所述的表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株在生產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用。發(fā)酵后纖維素酶蛋白的提取純化，采用再生纖維素非晶親和層析工藝，獲得高純度的酶蛋白制劑。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株及其應(yīng)用，是多拷貝纖維素酶基因整合入分泌型表達(dá)載體，構(gòu)建出酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入畢赤酵母受體菌，得到表達(dá)纖維素酶的重組畢赤酵母菌。(I)本發(fā)明使用的纖維素酶基因來(lái)源為里氏木霉，其產(chǎn)生的酶降解纖維素的性能更強(qiáng)大，對(duì)高溫酸堿等環(huán)境的耐受性更強(qiáng)。
(2)生產(chǎn)過(guò)程中轉(zhuǎn)入的基因數(shù)量(拷貝數(shù))的多少與酶的產(chǎn)量有直接的關(guān)系，本發(fā)明的拷貝數(shù)(包括2，4，6，8，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100拷貝數(shù))符合酶制劑并且使其產(chǎn)量最大化的基因拷貝數(shù)，即從2個(gè)到100個(gè)。(3)構(gòu)建的多拷貝纖維素酶基因pPICZ a ABC表達(dá)載體與畢赤酵母GSl 15具有極好的相容性，本發(fā)明的重組畢赤酵母菌具有細(xì)胞外分泌酶蛋白的特性。經(jīng)過(guò)再生纖維素非晶(RAC)親和層析，得到的酶蛋白純度能達(dá)到90%，極大地節(jié)約了時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，節(jié)省生產(chǎn)成本，從而提高了經(jīng)濟(jì)效益。(4)從基因選取，到表達(dá)載體的制造，整個(gè)生產(chǎn)體系所涉及環(huán)節(jié)的實(shí)驗(yàn)條件有明顯優(yōu)化和改善，從而每升發(fā)酵液可以生產(chǎn)出10克左右酶制劑，活性高，產(chǎn)量較現(xiàn)有技術(shù)有大幅度增加。



圖I所示為本發(fā)明的表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株形成示意圖。圖中，I.纖維素酶基因，2.多克隆酶切位點(diǎn)MCS，3 質(zhì)粒pPICZ a ABC，4.表達(dá)載體，5.重組畢赤酵母菌。
具體實(shí)施例方式如說(shuō)明書(shū)附圖所示，纖維素酶的cDNA基因序列從5’端到3’端，PCR擴(kuò)增得到的含EcoRI-XbaI酶切位點(diǎn)的纖維素酶基因I片段，插入圖I質(zhì)粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位點(diǎn)MCS2中，并且構(gòu)建了多拷貝體系，測(cè)序證實(shí)已經(jīng)成功地構(gòu)建了纖維素酶基因表達(dá)載體
4。此基因表達(dá)載體4整合入巴斯德畢赤酵母GS115中。YPD平板篩選后，轉(zhuǎn)入YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。酵母收獲后，酶蛋白提純，篩選得到酶比活性高，產(chǎn)率高的高產(chǎn)株系，即里氏木酶內(nèi)切酶EGI株，得到表達(dá)纖維素酶重組畢赤酵母菌5。下述實(shí)施例，如無(wú)特別說(shuō)明，所用方法均為常規(guī)方法。實(shí)施例I
如說(shuō)明書(shū)附圖所示，里氏木酶內(nèi)切酶EGI的cDNA基因序列從5’端到3’端，PCR擴(kuò)增得到的含EcoRI-XbaI酶切位點(diǎn)的里氏木酶內(nèi)切酶cDNA的片斷，插入圖I質(zhì)粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位點(diǎn)MCS2中，并且構(gòu)建了多拷貝體系，測(cè)序證實(shí)已經(jīng)成功地構(gòu)建了里氏木酶內(nèi)切酶cDNA基因表達(dá)載體4。此表達(dá)載體4整合入巴斯德畢赤酵母GS115中。YPD平板篩選后，轉(zhuǎn)入YH)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。酵母收獲后，酶蛋白提純，篩選得到酶比活性高，產(chǎn)率高的高產(chǎn)株系，即表達(dá)纖維素酶重組畢赤酵母菌5-里氏木酶內(nèi)切酶EGI株。實(shí)施例2
如說(shuō)明書(shū)附圖所示，里氏木酶內(nèi)切酶EGII的cDNA基因序列從5’端到3’端，PCR擴(kuò)增得到的含EcoRI-XbaI酶切位點(diǎn)的里氏木酶內(nèi)切酶cDNA的片斷，插入圖I質(zhì)粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位點(diǎn)MCS2中，并且構(gòu)建了多拷貝體系，測(cè)序證實(shí)已經(jīng)成功地構(gòu)建了里氏木酶內(nèi)切酶cDNA基因表達(dá)載體4。此表達(dá)載體4整合入巴斯德畢赤酵母GS115中。YPD平板篩選后，轉(zhuǎn)入YH)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。酵母收獲后，酶蛋白提純，篩選得到酶比活性高，產(chǎn)率高的高產(chǎn)株系，即表達(dá)纖維素酶重組畢赤酵母菌5-里氏木酶內(nèi)切酶EGII株。實(shí)施例3如說(shuō)明書(shū)附圖所示，里氏木酶內(nèi)切酶EGIII的cDNA基因序列從5’端到3’端，PCR擴(kuò)增得到的含EcoRI-XbaI酶切位點(diǎn)的里氏木酶內(nèi)切酶cDNA的片斷，插入圖I質(zhì)粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位點(diǎn)MCS2中，并且構(gòu)建了多拷貝體系，測(cè)序證實(shí)已經(jīng)成功地構(gòu)建了里氏木酶內(nèi)切酶cDNA基因表達(dá)載體4。此表達(dá)載體4整合入巴斯德畢赤酵母GS115中。YPD平板篩選后，轉(zhuǎn)入YH)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。酵母收獲后，酶蛋白提純，篩選得到酶比活性高，產(chǎn)率高的高產(chǎn)株系，即表達(dá)纖維素酶重組畢赤酵母菌5-里氏木酶內(nèi)切酶EGIII株。實(shí)施例4
如說(shuō)明書(shū)附圖所示，里氏木酶內(nèi)切酶EGIV的cDNA基因序列從5’端到3’端，PCR擴(kuò)增得到的含EcoRI-XbaI酶切位點(diǎn)的里氏木酶內(nèi)切酶cDNA的片斷，插入圖I質(zhì)粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位點(diǎn)MCS2中，并且構(gòu)建了多拷貝體系，測(cè)序證實(shí)已經(jīng)成功地構(gòu)建了里氏木酶內(nèi)切酶cDNA基因表達(dá)載體4。此表達(dá)載體4整合入巴斯德畢赤酵母GSl 15中。YPD平板篩選后，轉(zhuǎn)入YH)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。酵母收獲后，酶蛋白提純，篩選得到酶比活性高，產(chǎn)率高的 高產(chǎn)株系，即表達(dá)纖維素酶重組畢赤酵母菌5-里氏木酶內(nèi)切酶EGIV株。實(shí)施例5
如說(shuō)明書(shū)附圖所示，里氏木酶內(nèi)切酶EGV的cDNA基因序列從5’端到3’端，PCR擴(kuò)增得到的含EcoRI-XbaI酶切位點(diǎn)的里氏木酶內(nèi)切酶cDNA的片斷，插入圖I質(zhì)粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位點(diǎn)MCS2中，并且構(gòu)建了多拷貝體系，測(cè)序證實(shí)已經(jīng)成功地構(gòu)建了里氏木酶內(nèi)切酶cDNA基因表達(dá)載體4。此表達(dá)載體4整合入巴斯德畢赤酵母GS115中。YPD平板篩選后，轉(zhuǎn)入YH)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。酵母收獲后，酶蛋白提純，篩選得到酶比活性高，產(chǎn)率高的高產(chǎn)株系，即表達(dá)纖維素酶重組畢赤酵母菌5-里氏木酶內(nèi)切酶EGV株。實(shí)施例6
如說(shuō)明書(shū)附圖所示，里氏木酶內(nèi)切酶CEL74A的cDNA基因序列從5’端到3’端，PCR擴(kuò)增得到的含KpnI-XbaI酶切位點(diǎn)的里氏木酶內(nèi)切酶cDNA的片斷，插入圖I質(zhì)粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位點(diǎn)MCS2中，并且構(gòu)建了多拷貝體系，測(cè)序證實(shí)已經(jīng)成功地構(gòu)建了里氏木酶內(nèi)切酶cDNA基因表達(dá)載體4。此表達(dá)載體4整合入巴斯德畢赤酵母GSl 15中。YPD平板篩選后，轉(zhuǎn)入YH)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。酵母收獲后，酶蛋白提純，篩選得到酶比活性高，產(chǎn)率高的高產(chǎn)株系，即表達(dá)纖維素酶重組畢赤酵母菌5-里氏木酶內(nèi)切酶CEL74A株。實(shí)施例7
如說(shuō)明書(shū)附圖所示，里氏木酶內(nèi)切酶CEL61B的cDNA基因序列從5’端到3’端，PCR擴(kuò)增得到的含EcoRI-XbaI酶切位點(diǎn)的里氏木酶內(nèi)切酶cDNA的片斷，插入圖I質(zhì)粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位點(diǎn)MCS2中，并且構(gòu)建了多拷貝體系，測(cè)序證實(shí)已經(jīng)成功地構(gòu)建了里氏木酶內(nèi)切酶cDNA基因表達(dá)載體4。此表達(dá)載體4整合入巴斯德畢赤酵母GSl 15中。YPD平板篩選后，轉(zhuǎn)入YH)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。酵母收獲后，酶蛋白提純，篩選得到酶比活性高，產(chǎn)率高的高產(chǎn)株系，即表達(dá)纖維素酶重組畢赤酵母菌5-里氏木酶內(nèi)切酶CEL61B株。實(shí)施例8
如說(shuō)明書(shū)附圖所示，里氏木酶內(nèi)切酶CEL5B的cDNA基因序列從5’端到3’端，PCR擴(kuò)增得到的含EcoRI-XbaI酶切位點(diǎn)的里氏木酶內(nèi)切酶cDNA的片斷，插入圖I質(zhì)粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位點(diǎn)MCS2中，并且構(gòu)建了多拷貝體系，測(cè)序證實(shí)已經(jīng)成功地構(gòu)建了里氏木酶內(nèi)切酶cDNA基因表達(dá)載體4。此表達(dá)載體4整合入巴斯德畢赤酵母GS115中。YPD平板篩選后，轉(zhuǎn)入Yro液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。酵母收獲后，酶蛋白提純，篩選得到酶比活性高，產(chǎn)率高的高產(chǎn)株系，即表達(dá)纖維素酶重組畢赤酵母菌5-里氏木酶內(nèi)切酶CEL5B株。實(shí)施例9
如說(shuō)明書(shū)附圖所示，將里氏木酶外切酶CBHII M16190. I的cDNA基因序列從5’端到3’端，PCR擴(kuò)增得到的含KpnI-NotI酶切位點(diǎn)的里氏木酶外切酶cDNA的片斷，插入圖I質(zhì)粒pPICZaABC3的多克隆酶切位點(diǎn)MCS2中，并且構(gòu)建了多拷貝體系，測(cè)序證實(shí)已經(jīng)成功地構(gòu)建了里氏木酶外切酶cDNA基因表達(dá)載體4。此表達(dá)載體4整合入巴斯德畢赤酵母GSl 15中。YH)平板篩選后，轉(zhuǎn)入YH)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。酵母收獲后，酶蛋白提純，篩選得到酶比活性高，產(chǎn)率高的高產(chǎn)株系，即表達(dá)纖維素酶重組畢赤酵母菌5-里氏木酶外切酶CBHIIM16190. I 株。實(shí)施例10 如說(shuō)明書(shū)附圖所示，將里氏木酶外切酶CBHII M55080. I的cDNA基因序列從5’端到3’端，PCR擴(kuò)增得到的含KpnI-NotI酶切位點(diǎn)的里氏木酶外切酶cDNA的片斷，插入圖I質(zhì)粒pPICZaABC3的多克隆酶切位點(diǎn)MCS2中，并且構(gòu)建了多拷貝體系，測(cè)序證實(shí)已經(jīng)成功地構(gòu)建了里氏木酶外切酶cDNA基因表達(dá)載體4。此表達(dá)載體4整合入巴斯德畢赤酵母GSl 15中。YH)平板篩選后，轉(zhuǎn)入YH)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。酵母收獲后，酶蛋白提純，篩選得到酶比活性高，產(chǎn)率高的高產(chǎn)株系，即表達(dá)纖維素酶重組畢赤酵母菌5-里氏木酶外切酶CBHIIM55080. I 株。實(shí)施例11
如說(shuō)明書(shū)附圖所示，里氏木酶P葡糖苷酶BGLI的cDNA基因序列從5’端到3’端，PCR擴(kuò)增得到的含KpnI-NotI酶切位點(diǎn)的里氏木酶內(nèi)切酶cDNA的片斷，插入圖I質(zhì)粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位點(diǎn)MCS2中，并且構(gòu)建了多拷貝體系，測(cè)序證實(shí)已經(jīng)成功地構(gòu)建了里氏木酶P葡糖苷酶cDNA基因表達(dá)載體4。此表達(dá)載體4整合入巴斯德畢赤酵母GS115中。YPD平板篩選后，轉(zhuǎn)入YH)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。酵母收獲后，酶蛋白提純，篩選得到酶比活性高，產(chǎn)率高的高產(chǎn)株系，即表達(dá)纖維素酶重組畢赤酵母菌5-里氏木酶3葡糖苷酶BGLI 株。實(shí)施例12
如說(shuō)明書(shū)附圖所示，里氏木酶P葡糖苷酶BGLII的cDNA基因序列從5’端到3’端，PCR擴(kuò)增得到的含EcoRI-XbaI酶切位點(diǎn)的里氏木酶P葡糖苷酶cDNA的片斷，插入圖I質(zhì)粒pPICZaABC3的多克隆酶切位點(diǎn)MCS2中，并且構(gòu)建了多拷貝體系，測(cè)序證實(shí)已經(jīng)成功地構(gòu)建了里氏木酶P葡糖苷酶cDNA基因表達(dá)載體4。此表達(dá)載體4整合入巴斯德畢赤酵母GS115中。YPD平板篩選后，轉(zhuǎn)入YH)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。酵母收獲后，酶蛋白提純，篩選得到酶比活性高，產(chǎn)率高的高產(chǎn)株系，即表達(dá)纖維素酶重組畢赤酵母菌5-里氏木酶3葡糖苷酶BGLII 株。實(shí)施例13
上述表達(dá)纖維素酶的重組畢赤酵母菌，經(jīng)過(guò)再生纖維素非晶(RAC)親和層析，得到的酶蛋白純度就能達(dá)到90%。具體實(shí)施例如下
再生纖維素非晶(RAC)親和層析柱的制備，將發(fā)酵液離心后，取上清液100毫升加入親和層析柱，雙蒸水清洗三次后，用60%乙二醇洗脫酶蛋白。含乙二醇的酶蛋白置于10 kDaVivaspin 500超濾膜,購(gòu)自德國(guó)賽多利斯(Sartorius-Stedim)公司，用50 mM,PH 5. 0的醋酸納緩沖液置換去除乙二醇，獲得酶的原液。每克再生纖維素非晶的親和力為360毫克酶蛋白。經(jīng)過(guò)一步親和層析，酶蛋白純化收率就達(dá)90%，明顯高于現(xiàn)有技術(shù)的純度20%左右。纖維素酶活性檢測(cè)方法
纖維素內(nèi)切酶采用羥甲基纖維素法，纖維素外切酶采用微晶纖維素法，3葡糖苷酶采用@水楊苷法，參見(jiàn)常規(guī)手冊(cè)。表I，12個(gè)菌株纖維素酶活性(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株，其特征在于，多拷貝纖維素酶基因整合入分泌型表達(dá)載體，構(gòu)建出酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入畢赤酵母受體菌，得到表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株。
2.如權(quán)利要求I所述的表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株，其特征在于，所述的多拷貝為2,4,6,8,10,20,30,40,50,60,70,80, 90，100 任一拷貝數(shù)。
3.如權(quán)利要求I所述的表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株，其特征在于，所述畢赤酵母受體菌為巴斯德畢赤酵母GSl 15。
4.如權(quán)利要求I至3任一所述的表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株，其特征在于，纖維素酶基因多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒PPICZ a ABC中，構(gòu)建出酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入畢赤酵母受體菌，得到表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株。
5.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株，其特征在于， (1)里氏木酶內(nèi)切酶EGI，GeneBank編號(hào)M15665.I，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶EGI酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶EGI的重組畢赤酵母菌； (2)里氏木酶內(nèi)切酶EGII,GeneBank編號(hào)AB003694.I，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶EGII酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶EGII的重組畢赤酵母菌； (3)里氏木酶內(nèi)切酶EGIII，GeneBank編號(hào)M19373.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶EGIII酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶EGIII的重組畢赤酵母菌； (4)里氏木酶內(nèi)切酶EGIV，GeneBank編號(hào)Y11113.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶EGIV酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶EGIV的重組畢赤酵母菌； (5)里氏木酶內(nèi)切酶EGV，GeneBank編號(hào)Z33381.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶EGV酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶EGV的重組畢赤酵母菌； (6)里氏木酶內(nèi)切酶CEL74A，GeneBank編號(hào)AY281371.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶CEL74A酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶CEL74A的重組畢赤酵母菌； (7)里氏木酶內(nèi)切酶CEL61B，GeneBank編號(hào)AY281372.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶CEL61B酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶CEL61B的重組畢赤酵母菌； (8)里氏木酶內(nèi)切酶CEL5B，GeneBank編號(hào)AY281373.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶內(nèi)切酶CEL5B酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶內(nèi)切酶CEL5B的重組畢赤酵母菌； (9)里氏木酶里氏木酶外切酶CBHII,GeneBank編號(hào)M16190. 1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶外切酶CBHII M16190. I酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶外切酶CBHII M16190. I的重組畢赤酵母菌； (10)里氏木酶里氏木酶外切酶CBHII,GeneBank編號(hào)M55080. I，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶外切酶CBHII M55080. I酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶外切酶CBHII M55080. I的重組畢赤酵母菌； (11)里氏木酶P葡糖苷酶BGLI，GeaneBank編號(hào)U09580.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶P葡糖苷酶BGLI酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶P葡糖苷酶BGLI的重組畢赤酵母菌； (12)里氏木酶P葡糖苷酶BGLII，GeneBank編號(hào)AB003110.1，多拷貝整合到畢赤酵母相容性質(zhì)粒pPICZ a ABC中，構(gòu)建出里氏木酶P葡糖苷酶BGLII酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，獲得表達(dá)里氏木酶P葡糖苷酶BGLII的重組畢赤酵母菌。
6.權(quán)利要求5所述的表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株在生產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株在生產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用，其特征在于，發(fā)酵后纖維素酶蛋白的提取純化，采用再生纖維素非晶親和層析工藝，獲得高純度的酶蛋白制劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種表達(dá)纖維素酶的重組酵母菌株及其在生產(chǎn)纖維素酶方面的應(yīng)用。多拷貝纖維素酶基因整合入分泌型表達(dá)載體，構(gòu)建出酶蛋白分泌表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入畢赤酵母受體菌，得到表達(dá)纖維素酶的重組畢赤酵母菌。本發(fā)明的表達(dá)纖維素酶的重組畢赤酵母菌酶產(chǎn)率高，活性高，可以胞外分泌酶蛋白。
文檔編號(hào)C12R1/84GK102643758SQ20121012614
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月23日
發(fā)明者陳戰(zhàn) 申請(qǐng)人:陳戰(zhàn)