專利名稱：6種食源性致病菌的GeXP多重快速檢測用引物和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及常見食源性致病菌同步檢測方法，特別是涉及ー種基于GenomeLabTM GeXP(GenomeLab eXpress Profiling)多重基因表達(dá)分析技術(shù)的沙門氏菌(Salmonella sp.)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、志賀氏菌(Shigella sp.)、腸出血性大腸桿菌0157:H7 (Escherichia coli 0157: H7)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)等六種致病菌的多重PCR快速檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
食品安全問題以及相關(guān)的食源性疾病已成為公共健康領(lǐng)域中倍受關(guān)注的熱點(diǎn)。カロ 強(qiáng)食品中致病微生物的檢測技術(shù)研究具有重要的現(xiàn)實意義，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計，2005年世界范圍內(nèi)有150萬人死于腹瀉等疾病，其中有70%為食源性因素造成。在發(fā)展中國家情況更為嚴(yán)重，估計每年有2. 7億腹瀉及其相關(guān)病例，導(dǎo)致240萬5歲以下兒童死亡。沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、志賀氏菌、空腸彎曲桿菌、腸出血性大腸桿菌0157: H7是常見污染食品的致病菌，主要通過飲水、食品感染人類，導(dǎo)致細(xì)菌性食物中毒。這些致病菌的常規(guī)檢測需分離培養(yǎng)、生化和血清學(xué)鑒定等多個步驟，操作復(fù)雜，檢測周期長(4 7d)，因此迫切需要發(fā)展快速、靈敏和特異的檢測方法，對于預(yù)防和控制這些疾病的發(fā)生和流行至關(guān)重要。而基于多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)的檢測方法具有特異、高效、成本低、速度快等優(yōu)點(diǎn)，目前已在多種致病微生物的檢測中得到了初步的應(yīng)用，是食源性致病菌快速檢測技術(shù)的重要發(fā)展方向。但普通的多重PCR的多對引物之間存在競爭效應(yīng)，導(dǎo)致有些目標(biāo)菌檢測靈敏度降低甚至不能被檢測。GeXP多重基因分析技術(shù)是ー種全新的基因表達(dá)譜定量分析平臺，是多重PCR領(lǐng)域的突破性技術(shù)，它巧妙的將多重PCR技術(shù)和毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合，采用通用引物與特異引物相結(jié)合的方法，能夠有效地避免競爭效應(yīng)的出現(xiàn)從而實現(xiàn)一次進(jìn)行多達(dá)20個基因的檢測，并且可以同時進(jìn)行較多祥品量的檢測，通過其毛細(xì)管電泳系統(tǒng)對多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行高通量的快速分析，從而實現(xiàn)真正的高通量、自動化的檢測。GeXP技術(shù)的優(yōu)勢在于可在同一樣本中對多個基因進(jìn)行檢測，大大提高了反應(yīng)效率，節(jié)約資源和成本，毛細(xì)管電泳分析自動化操作也降低了人為操作的誤差。近年來有越來越多的研究者對GeXP多重PCR技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行研究。迄今為止，尚未有成功利用GeXP多重PCR技術(shù)鑒定沙門氏菌(Salmonella sp.)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、志賀氏菌(Shigella sp.)、腸出血性大腸桿菌0157:H7 (Escherichia coli 0157: H7)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)等六種致病菌的文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有的食源性致病菌檢測方法的不足，本發(fā)明第一個目的是提供一種食源性致病菌檢測特異性引物和通用引物，第二個目的是提供ー種利用GeXP遺傳分析技術(shù)和多重PCR技術(shù)的快速、高通量且易于觀察結(jié)果的食源性致病菌檢測方法。 為了實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
本發(fā)明將GeXP多重基因分析技術(shù)與多重PCR技術(shù)結(jié)合，在同一 PCR反應(yīng)體系中加入6對特異性引物和I對熒光標(biāo)記的通用引物，PCR擴(kuò)增的前16個循環(huán)采用較高的退火溫度進(jìn)行特異性引物的擴(kuò)增，后16個循環(huán)中，通用引物可對特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行通用性的擴(kuò)增，同時擴(kuò)增出多個長度不同的熒光標(biāo)記的核酸片段，最后采用毛細(xì)血管電泳技術(shù)讀取技術(shù)對多個目的基因進(jìn)行有效分析，從而有效地避免了普通多重PCR擴(kuò)增的引物間的競爭效應(yīng)，提高了檢測的靈敏性。6種食源性致病菌的GeXP多重快速檢測用引物，包6對特異性引物，I對陽性對照引物和I對通用引物，它們的核苷酸序列如下
空腸曲桿菌特異性引物上游SEQ ID N01，下游SEQ ID N02 ；
金黃色葡萄球菌特異性引物上游SEQ ID N03，下游SEQ ID N04 ；
腸出血性大腸桿菌0157: H7特異性引物上游SEQ ID N05，下游SEQ ID N06 ；
志賀氏菌特異性引物上游SEQ ID N07，下游SEQ ID N08 ；
沙門氏菌特異性引物上游SEQ ID N09，下游SEQ ID NOlO ；
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌特異性引物上游SEQ ID N011，下游SEQ ID N012 ；
陽性對照引物上游SEQ ID N013，下游SEQ ID N014 ；
通用引物上游SEQ ID N015，下游SEQ ID N016。進(jìn)ー步，在上述SEQ ID N015的5’端用cy5熒光標(biāo)記。上述引物用于食源性致病菌的GeXP多重快速檢測方法，包括如下步驟
I) DNA提取
選用相應(yīng)的商品化的細(xì)菌DNA提取試劑盒，提取致病菌DNA，獲得待測DNA模板。所述致病菌包括空腸曲桿菌、金黃色葡萄球菌、腸出血性大腸桿菌0157: H7、志賀氏菌、沙門氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。2) GeXP多重PCR檢測體系的構(gòu)建
GeXP多重PCR檢測體系含6對細(xì)菌特異性引物、I對陽性對照引物和I對通用性引物，能在一個反應(yīng)管中對6類食源性致病菌中任意一類進(jìn)行區(qū)分和檢測。GeXP多重PCR檢測體系中每20 μ L反應(yīng)體系包含0. ImM的SEQ ID N09 SEQID N012 各 O. 2 μ L，O. ImM 的 SEQ ID NOl SEQ ID Ν08 和 SEQ ID Ν013、SEQ ID Ν014 各
O.I μ L，I. OmM的SEQ ID Ν015和SEQ ID Ν016各 I. OyL, 10XPCR buffer 緩沖液2. OyL,25 mM 的 Mg2+ 2. O μ L，10 mM 的 dNTP l.OyL, 5U/ μ L 的 Taq DNA 聚合酶 O. 6 μ L，待測 DNA模板I. O μ L, pMD19質(zhì)粒O. 3 μ L, 9. 3 μ L滅菌去離子水。反應(yīng)程序為94°C 45s, 60°C 45s，72°C 30s，16 個循環(huán)；94°C 45s, 52°C 45s, 72°C30s，16個循環(huán)。3) PCR產(chǎn)物片段分析
首先將PCR產(chǎn)物用IOmM的Tris-HCl稀釋5倍待用，然后在每個樣品管中加入甲酰胺38. 5 μ L和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品-400 O. 5 μ L,震蕩混勻，離心除去氣泡并滴加礦物油之后加入分離緩沖液250 μ L，利用GeXP多重基因分析系統(tǒng)的片段分析程序進(jìn)行分析。
4)結(jié)果判定
若出現(xiàn)217bp的陽性對照峰和相應(yīng)PCR產(chǎn)物片段長度的產(chǎn)物峰則與該產(chǎn)物峰對應(yīng)的致病菌檢測結(jié)果為陽性，若出現(xiàn)217bp的陽性對照峰但未出現(xiàn)相應(yīng)PCR產(chǎn)物片段長度的產(chǎn)物峰則為陰性。6種目標(biāo)菌相應(yīng)的核酸片段長度為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ー 156bp、腸出血性大腸桿菌0157: H7— 242bp、志賀氏菌一256bp、金黃色葡萄球菌一269bp、空腸彎曲桿菌ー316bp、沙門氏菌ー 320bp，陽性對照ー 217bp。GeXP多重PCR檢測體系的驗證
驗證采用18株菌株樣本，將試驗菌株經(jīng)增菌培養(yǎng)后,用GeXP多重PCR檢測體系進(jìn)行檢測，以驗證所建體系的特異性。所述18株菌株樣本包括腸炎沙門氏菌(ATCC13076)、鼠傷寒沙門氏菌(50115)、烏里地沙門氏菌(實驗室分離)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(ATCC7644)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(54003)、英諾克李斯特氏菌(實驗室分離)、大腸桿菌 0157:H7 (NCTC12900)、大腸桿菌 0157:H7 (51924)、大腸桿菌(ATCC8739)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、金黃色葡萄球菌(26003)、表皮葡萄球菌(ATCC12228)、空腸彎曲桿菌(ATCC33291)、福氏志賀氏菌(ATCC12022)、鮑氏志賀氏菌(51523)、こ型溶血性鏈球菌(32210)、阪崎腸桿菌(ATCC51329)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC700603)。GeXP多重PCR檢測技術(shù)的原理是分別根據(jù)6種致病菌基因的保守區(qū)域設(shè)計了6對特異性引物，其中特異性引物一端包含可與通用性引物結(jié)合的通用序列，退火溫度為65°C左右。通用性引物是一段非生物來源的核苷酸編碼序列，上游引物5’端用cy5熒光進(jìn)行標(biāo)記，退火溫度為50°C左右。本發(fā)明以樣本DNA為模板,在同一 PCR反應(yīng)體系中加入6對特異性引物和I對熒光標(biāo)記的通用性引物(通用引物濃度為特異性引物濃度的20倍以上)，PCR擴(kuò)增的前16個循環(huán)采用較高的退火溫度進(jìn)行特異性引物的擴(kuò)增，后16個循環(huán)中，通用引物可對特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行通用性的擴(kuò)增，同時擴(kuò)增出多個長度不同的熒光標(biāo)記的核酸片段，最后采用毛細(xì)管電泳讀取技術(shù)對多個目的基因進(jìn)行有效分析，從而有效地避免了普通多重PCR引物間的競爭效應(yīng)，提高了檢測的靈敏性。相比普通凝膠電泳，毛細(xì)管電泳系統(tǒng)對多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析有著操作簡便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)﹂L度相差僅數(shù)個bp的核酸片段進(jìn)行區(qū)分，并且可以同時實現(xiàn)對較多樣品量的檢測，從而實現(xiàn)真正的高通量、自動化的檢測。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)高特異性分別根據(jù)6種致病菌基因的保守區(qū)域分別設(shè)計6對特異性引物，引物特異性高，并且通用性引物的序列設(shè)計來自于一段非生物源性的核苷酸序列，避免了非特異性產(chǎn)物的通用性擴(kuò)增；(2)靈敏度高擴(kuò)增模板僅需IOng或更少，檢測結(jié)果可靠性達(dá)98%，PCR反應(yīng)體系中加入6對特異性引物和I對熒光標(biāo)記的通用引物，通用引物可對特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行通用性的擴(kuò)增，從而有效地避免了普通多重PCR擴(kuò)增的引物間的競爭效應(yīng)，提高檢測靈敏度；(3)避免假陽性和假陰性檢測體系中加入陽性對照及陰性空白對照，能夠有效避免假陽性和假陰性現(xiàn)象的出現(xiàn)。(4)鑒定自動化、操作簡便，結(jié)果的可靠性、靈敏度高采用毛細(xì)管電泳讀取技術(shù)根據(jù)核酸片段長度的熒光信號進(jìn)行自動化讀取和分析，能夠?qū)﹂L度相差僅數(shù)個bp的核酸片段進(jìn)行區(qū)分，且可同時實現(xiàn)對較多祥品量的檢測；(5)快速、高效擴(kuò)增檢測時間3個小時左右，可同時實現(xiàn)對較多祥品量的檢測；(7)用途廣可廣泛用于食品中致病菌的安全快速檢測。


圖I為陽性對照效果示意 圖2為空白對照效果不意 圖3為6種致病菌檢測效果示意 圖中，主峰(信號值> 50000)從左到右依次為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(156bp)、pMD 19質(zhì)粒陽性對照(217bp)、腸出血性大腸桿菌0157: H7 (242bp)、志賀氏菌(256bp)、金黃色葡萄球菌(269bp )、空腸彎曲桿菌(316bp )、沙門氏菌(320bp )。
具體實施方式

采用的儀器設(shè)備參見下表I。表I
￥器名稱(規(guī)格)I生產(chǎn)廠商
GeXP多重基因表達(dá)分析系統(tǒng)美國BeckmanCoulter公司
梯度 PCR 儀(Veriti96)美國 AppliedBiosystems 公司
智能微生物培養(yǎng)氣體工作站(Mark2)荷蘭Mart公司
臺式高速冷凍離心機(jī)(SIGMA3K15)美國SIGMA公司
小型臺式高速離心機(jī)(Centrifuge5417R)德國Eppendorf公司
全自動凝膠成像系統(tǒng)(BI0-BEST200E)美國SIM公司
電泳儀美國Bio-Rad公司
紫外分光光度計(BI0MATE3)_美國Thermo公司_
甲酰胺溶液(Sample Load Solution)、分離緩沖液(Separation Buffer)、分離膠
(Separation Gel)均購自美國Beckman公司，F(xiàn)raser肉湯購自法國BI0MERIEUX公司，布氏
肉湯購自英國0XI0D公司，營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯均購自北京陸
橋技術(shù)責(zé)任有限公司。 實施例I，引物的設(shè)計
6種食源性致病菌GeXP多重PCR檢測用引物為ー套食源性致病菌的引物組，每種致病
菌引物組由兩對引物組成，一對為特異性引物，另ー對為通用引物，通用引物的序列相同且
上游引物5’端用cy5熒光進(jìn)行標(biāo)記，各特異性引物均含有能與通用引物相結(jié)合的序列。I)通用引物的設(shè)計及合成
通用性引物是一段非生物來源的核苷酸編碼序列，上游引物5’端用cy5熒光進(jìn)行標(biāo)記。通用性引物由上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司合成。2)特異性引物的設(shè)計及特異性驗證
選擇沙門氏菌的DNA解旋酶B亞基基因(gyrB)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的DNA解旋酶B亞基基因(gyrB)、金黃色葡萄球菌的血漿凝固酶前體基因(coa)、腸出血性大腸桿菌0157: H7的脂多糖基因(rfbE)、志賀氏菌的侵襲性質(zhì)粒抗原H基因(ipaH)、空腸彎曲桿菌的dnaA基因、pMD19質(zhì)粒作為目的基因，用GeXP Express引物設(shè)計分析軟件分別設(shè)計各特異性PCR引物，經(jīng)過GenBank的BLAST程序?qū)Ω鞴璉物及擴(kuò)增產(chǎn)物同源性進(jìn)行比對，引物由上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司和寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列及產(chǎn)物大小見表2表權(quán)利要求
1.一種采用6種食源性致病菌的GeXP多重快速檢測用引物，其特征在于包括6對特異性引物，I對陽性對照引物和I對通用引物，它們的核苷酸序列如下 空腸曲桿菌特異性引物上游SEQ ID N01，下游SEQ ID N02 ； 金黃色葡萄球菌特異性引物上游SEQ ID N03，下游SEQ ID N04 ； 腸出血性大腸桿菌0157: H7特異性引物上游SEQ ID N05，下游SEQ ID N06 ； 志賀氏菌特異性引物上游SEQ ID N07，下游SEQ ID N08 ； 沙門氏菌特異性引物上游SEQ ID N09，下游SEQ ID NOlO ； 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌特異性引物上游SEQ ID N011，下游SEQ ID N012 ； 陽性對照引物上游SEQ ID N013，下游SEQ ID N014 ； 通用引物上游SEQ ID N015，下游SEQ ID N016。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述6種食源性致病菌的GeXP多重快速檢測用引物，其特征在于所述SEQ ID N015的5’端用cy5熒光標(biāo)記。
3.采用權(quán)利要求I所述引物用于食源性致病菌的GeXP多重快速檢測方法，包括如下步驟 1)DNA提取 選用相應(yīng)的商品化的細(xì)菌DNA提取試劑盒，提取致病菌DNA，獲得待測DNA模板； 2)GeXP多重PCR檢測體系的構(gòu)建 GeXP多重PCR檢測體系中每20 μ L反應(yīng)體系包含0. ImM的SEQ ID N09 SEQ ID N012各 O. 2 μ L，O. ImM 的 SEQ ID NOl SEQ ID Ν08 和 SEQ ID Ν013、SEQ ID Ν014 各 O. I μ L，I.OmM 的 SEQ ID Ν015 和 SEQ ID Ν016 各 I. O μ L，10XPCR buffer 緩沖液 2. O μ L，25 mM的 Mg2+ 2. O μ L，10 mM 的 dNTP l.OyL, 5U/ μ L 的 Taq DNA 聚合酶 O. 6 μ L，待測 DNA 模板I. O μ L, pMD19質(zhì)粒O. 3 μ L, 9. 3 μ L滅菌去離子水；反應(yīng)程序為 94 で 45s, 60 0C 45s, 72 °C 30s，16 個循環(huán)；94 で 45s, 52 °C 45s, 72 °C30s，16個循環(huán)； 3)PCR產(chǎn)物片段分析 首先將PCR產(chǎn)物用IOmM的Tris-HCl稀釋5倍待用，然后在每個樣品管中加入甲酰胺38. 5 μ L和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品-400 O. 5 μ L,震蕩混勻，離心除去氣泡并滴加礦物油之后加入分離緩沖液250 μ L，利用GeXP多重基因分析系統(tǒng)的片段分析程序進(jìn)行分析； 4)結(jié)果判定 若出現(xiàn)217bp的陽性對照峰和相應(yīng)PCR產(chǎn)物片段長度的產(chǎn)物峰則與該產(chǎn)物峰對應(yīng)的致病菌檢測結(jié)果為陽性，若出現(xiàn)217bp的陽性對照峰但未出現(xiàn)相應(yīng)PCR產(chǎn)物片段長度的產(chǎn)物峰則為陰性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述食源性致病菌的GeXP多重快速檢測方法，其特征在于步驟I) 中所述致病菌包括空腸曲桿菌、金黃色葡萄球菌、腸出血性大腸桿菌0157: H7、志賀氏菌、沙門氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及常見食源性致病菌同步檢測方法，特別是涉及一種基于GenomeLabTMGeXP多重基因表達(dá)分析技術(shù)的致病菌多重PCR快速檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將特異性引物與通用性引物擴(kuò)增相結(jié)合，PCR擴(kuò)增的前16個循環(huán)采用較高的退火溫度進(jìn)行特異性引物的擴(kuò)增，后16個循環(huán)中，通用引物進(jìn)行大規(guī)模的通用性擴(kuò)增，檢測結(jié)果采用遺傳分析系統(tǒng)的片段分析功能根據(jù)核酸片段長度的熒光信號進(jìn)行自動化讀取和分析，可同時實現(xiàn)對較多樣品量的檢測，有效地避免了普通多重PCR擴(kuò)增出現(xiàn)的引物間的競爭效應(yīng)。本發(fā)明旨在建立一種快速、高通量、高可靠性、高靈敏度的食源性致病菌的檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK102618662SQ20121012586
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者劉生峰, 周慶, 周蓓莉, 李應(yīng)國, 楊俊 , 王昱, 聶福平, 肖進(jìn)文 申請人:肖進(jìn)文, 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心