專利名稱：一種用于霜霉病菌抗藥性頻率監(jiān)測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及，尤其涉及的是ー種用于霜霉病菌抗藥性頻率監(jiān)測的方法。
背景技術(shù)：
霜霉菌是植物的重要病原菌，所致病害通稱霜霉病。霜霉菌對寄主植物的破壞性強，危害性大，由霜霉菌引起的植物病害大多難以控制。尤其是果蔬及經(jīng)濟作物易受到霜霉菌侵染，其潛育期短，再侵染頻繁，在植物的一個生長季節(jié)內(nèi)病菌可迅速發(fā)展造成病害流行，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的嚴重損失。目前，化學(xué)農(nóng)藥防治仍是主要防控手段，在霜霉病的防治中發(fā)揮著重要的作用。20 世紀70年代中期以前，用于霜霉病防治的藥劑主要是ー些保護性殺菌劑如取代苯基類的百菌清、雙ニ硫代氨基甲酸酯類的代森錳鋅及一些銅制劑等廣譜型保護性殺菌劑。自70年代后期開始，甲霜靈、霜霉威、烯酰嗎啉、氟嗎啉等內(nèi)吸性殺菌劑的使用對該病害的防治取得了劃時代的進展。但由于這些內(nèi)吸性殺菌劑具有較單ー的作用位點，長期單一大面積使用后霜霉菌容易對這些殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，極大的降低了殺菌劑的防治效果，増加了生產(chǎn)成本和農(nóng)藥環(huán)境污染的風(fēng)險。近年來，人們逐漸意識到病原菌抗藥性產(chǎn)生的危害，提出了基于抗藥性監(jiān)測的殺菌劑使用策略。對于ー些能離體培養(yǎng)的病原菌通常先進行病原菌的采集、分離，然后測定病原菌群體對殺菌劑的敏感性，明確病原菌對某些殺菌劑的抗性頻率，然后指導(dǎo)殺菌劑的合理選用。而霜霉病菌是專性寄生菌，在培養(yǎng)基上不能分離培養(yǎng)，限制了這種方法在霜霉病菌抗藥性監(jiān)測中的應(yīng)用。我們也嘗試從發(fā)病葉片上挑取單個孢子囊接種到離體植株葉片上進行病原菌的分離和純化，但由于單個孢子的侵染效率極低，不能真實地反映病原菌群體對殺菌劑的抗藥性情況。因此，迫切需要發(fā)明ー種簡單易行的抗藥性監(jiān)測方法用于專性寄生霜霉病菌的抗藥性監(jiān)測，以科學(xué)合理地指導(dǎo)霜霉病的化學(xué)防治。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種用于霜霉病菌抗藥性監(jiān)測的簡單、易行的方法。本發(fā)明克服了目前常規(guī)抗藥性監(jiān)測方法不能用于專性寄生霜霉菌分離、純化的缺點，提供了ー種直接在離體葉片上測定霜霉病菌抗藥性頻率的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用植株離體葉片生物測定法監(jiān)測霜霉病菌的抗藥性頻率。該方法的步驟為(I)在待監(jiān)測區(qū)域采集霜霉病病樣，帶回室內(nèi)將病葉上的雜質(zhì)和老熟的孢子囊用無菌水洗脫，在19°C下暗培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生新的孢子嚢；(II)將所有采集病葉上的新生孢子囊洗脫并混合制成孢子囊懸浮液(I. OX IO4個孢子囊/mL)分別將混合孢子懸浮液用液滴法(20iU/滴)接種到(I)無菌水浸泡30分鐘和(2)用2X待側(cè)殺菌劑最小抑制濃度浸泡30分鐘的健康離體植物葉片制成的葉碟(直徑2cm)背面；(IV)將接種的葉蝶置于吸水紙保濕的培養(yǎng)皿(直徑15cm)中，先于19°C黑暗條件下保濕培養(yǎng)12h，再于19°C、12h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)5-7d，然后測量葉碟上的發(fā)病面積；(V)根據(jù)殺菌劑處理葉碟上霜霉病的發(fā)病面積與未用藥劑處理葉碟上霜霉病的發(fā)病面積的比率來測算抗藥性菌株的頻率。上述方法中，所述的霜霉病樣的采集在每塊田間采用5點法取樣，每點取10個發(fā)病葉片，然后將5個點采集的病葉一井裝入保鮮袋中帶回室內(nèi)進行進一歩測定。所述孢子囊懸浮液的制備方法為室內(nèi)將田間采集的病葉上的雜質(zhì)和老熟的孢子囊用無菌水洗凈后，在19°C下暗培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生新的孢子囊，再將各個葉片上新生孢子囊用4°C無菌水洗脫并混合成混合孢子懸浮液，并將孢子囊懸浮液的濃度用血球計數(shù)板調(diào)整為I. OXlO4個孢子囊/mL ；所述無菌水和殺菌劑處理葉碟的制備健康離體葉片優(yōu)選為植株中部相同葉齡的葉片；葉碟的尺寸為￠2. 5cm;將制取的葉碟混勻后分為兩份，每份50個葉碟。一份葉碟用無菌水浸泡30min，另ー份葉碟用2倍待側(cè)殺菌劑對霜霉菌最小抑制濃度藥液浸泡30min。兩份處理浸泡過程中均含有0. 02%的吐溫20和0. 1%的甲醇；浸泡過程中需經(jīng)常攪動，以確保每個葉碟都被均勻的濕潤。所述霜霉病菌混合孢子懸浮液的接種方法為取出晾干后葉背朝上整齊置于用吸水紙保濕的玻璃培養(yǎng)皿(415cm)中，在每個葉碟背面用量程50 iiL的移液器滴加20 iiL混合抱子囊懸浮液于葉蝶中央位置。所述離體葉碟的培養(yǎng)方法為裝有接種葉碟的培養(yǎng)皿在19°C黑暗條件下保濕培養(yǎng)12h，使霜霉病菌孢子完成萌發(fā)和侵染過程，再于19°C、12h光暗交替條件下培養(yǎng)，待葉碟背面產(chǎn)生黑色霉層后，測定每個葉碟上的發(fā)病面積。所述抗藥性菌株抗性頻率的計算方法為抗藥性菌株的頻率)=(藥劑處理葉碟上的發(fā)病面積/未用藥劑處理葉碟的發(fā)病面積)X100。本發(fā)明利用了霜霉病菌的敏感菌株和抗性菌株在帶藥葉碟上的生長與否來估算抗藥性菌株的頻率。通常在無藥劑處理的葉碟上敏感和抗性菌株均能侵染致病，能代表抗藥性菌株和敏感菌株群體的侵染情況；而在2X殺菌劑最低抑制濃度處理的葉碟上僅抗藥性菌株能侵染而敏感菌株不能侵染，僅代表抗性菌株群體的侵染情況。因此，抗藥性菌株的頻率可以用藥劑處理葉碟上的發(fā)病面積與未用藥劑處理葉碟上的發(fā)病面積的比值估算得至IJ。這種方法有效地解決了專性寄生霜霉菌抗藥性監(jiān)測中不能分離培養(yǎng)的難點，提供了一種簡單、易行的霜霉菌抗藥性監(jiān)測方法，為霜霉病的防治和抗藥性治理提供了極大的便利。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。實施例一、黃瓜霜霉病菌敏感菌株和抗性菌株混合培養(yǎng)多代后抗藥性頻率的變化監(jiān)測。I、材料和方法(I)供試藥劑96*%氟嗎啉(fIumorph)原藥。(2)供試植株將感病黃瓜品種長春密刺栽培于4 15cm，高12cm的育苗缽內(nèi)，置于溫室中培養(yǎng)，植株長到5葉期后采集第3葉位的葉片，用于葉碟的制作。(3)供試菌株黃瓜霜霉病菌菌株K-I (可以采用其他常見菌株替代)為實驗室從 田間采集的對氟嗎啉敏感的菌株，氟嗎啉對該菌株的最小抑制濃度為0. 70 u g/mL ；RK-1為利用紫外線誘導(dǎo)法從親本菌株K-I中誘導(dǎo)獲得的對氟嗎啉產(chǎn)生抗藥性的突變體，該突變體在I. O g/mL氟嗎啉處理過的葉碟上能正常生長。(4)抗藥性頻率測定方法(I)菌株產(chǎn)孢分別將親本菌株K-I及抗藥性菌株RK-I在健康離體黃瓜葉片上培
養(yǎng)產(chǎn)孢；(II)混合孢子懸浮液配制分別配制各供試菌株的孢子囊懸浮液(濃度為I. OX IO4個孢子囊/mL)，然后將抗藥性菌株和親本敏感菌株(R : S)按0 : 10 ;2 8 ；5 5；8 2；10 0的比例混合形成抗感菌株孢子懸浮液混合液；
(III)離體葉碟制作選擇溫室培養(yǎng)至5葉齡的黃瓜植株上第四葉位上的健康葉片，用打孔器制備直徑15mm的黃瓜葉碟。隨機混勻，分成2組，每組50個葉碟，分別于(I)無菌水浸泡30分鐘和⑵用2X氟嗎啉最小抑制濃度(I. 5 u g/mL)浸泡30分鐘,然后將葉碟取出，用吸水紙洗干葉碟上的藥液，葉背朝上置于培樣皿內(nèi)用相同藥劑濃度潤濕的吸水紙上。(IV)孢子混合液的接種將敏感菌株和抗性菌株制作的混合孢子懸浮液用40 U I移液槍取接種到分別采用無菌水浸泡30分鐘和用2X氟嗎啉最小抑制濃度(I. 5 u g/mL)浸泡30分鐘的健康離體植物葉片制成的葉碟(直徑2cm)背面，每個葉碟接種20 yl。(V)將接種的葉蝶置于吸水紙保濕的培養(yǎng)皿(直徑15cm)中，先于19°C黑暗條件下保濕培養(yǎng)12h，再于19°C、12h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)5-7d，然后測量葉碟上的發(fā)病面積；(VI)根據(jù)殺菌劑處理葉碟上霜霉病的發(fā)病面積與未用藥劑處理葉碟上霜霉病的發(fā)病面積的比率來測算抗藥性菌株的頻率?？顾幮跃甑念l率(％)=(藥劑處理葉碟上的發(fā)病面積/未用藥劑處理葉碟的發(fā)病面積)X100。(5)試驗結(jié)果結(jié)果表明(表I)，親本菌株K-I和抗藥性菌株RK-I孢子囊懸浮液按照不同比例混合培養(yǎng)第I代后，抗藥性菌株的抗藥性頻率和接菌前抗藥性菌株與敏感菌株的混合比例基本一致，表明這種方法能正確反映霜霉病菌群體中抗性菌株的頻率；混合培養(yǎng)第3代后抗藥性菌株的頻率略有降低。表I氟嗎啉抗藥性菌株k_l和敏感菌株混合培養(yǎng)后的抗性頻率變化
權(quán)利要求
1.ー種用于霜霉病菌抗藥性頻率監(jiān)測的方法，其特征是，包括以下步驟 Al、在待監(jiān)測區(qū)域用五點法采集霜霉病病樣，帶回室內(nèi)將病葉上的雜質(zhì)和老熟的孢子囊用無菌水洗脫，在19°C下黑暗培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生新的孢子囊； A2、將所有采集病葉上的新生孢子囊洗脫并混合制成孢子囊懸浮液，濃度為l.OX IO4-L 0X IO5 個孢子囊 /mL ； A3、分別將孢子囊懸浮液用液滴法接種健康離體植物葉片制成的葉碟背面，葉碟事先用無菌水浸泡30分鐘和2 X (待側(cè)殺菌劑最小抑制濃度)藥液浸泡30分鐘； A4、將接種葉蝶置于吸水紙保濕的培養(yǎng)皿中，先于19°C黑暗條件下保濕培養(yǎng)12h，再于19°C、12h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)5-7d，然后測量葉碟上的發(fā)病面積； A5、根據(jù)殺菌劑處理葉碟上霜霉病的發(fā)病面積與未用藥劑處理葉碟上霜霉病的發(fā)病面積的比率來測算抗藥性菌株的頻率。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是田間采用五點法采集霜霉病病樣，室內(nèi)將老熟孢子囊和雜質(zhì)洗脫后在19°C下黑暗培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生新的孢子囊，再將所有采集的病樣孢子囊洗脫混合形成混合孢子囊懸浮液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是將混合孢子囊懸浮液接種葉蝶背面，每個葉蝶背面接種20 Ul孢子懸浮液，葉碟浸泡過程中無菌水和藥液均含有0. 02%的吐溫20和·0.1%的甲醇；浸泡過程中需經(jīng)常攪動，以確保每個葉碟都被均勻的濕潤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于植物霜霉病菌抗藥性頻率監(jiān)測的方法，步驟為A1、在待監(jiān)測區(qū)域采集霜霉病病樣，帶回室，在19℃下黑暗培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生新的孢子囊；A2、將所有采集病葉上的新生孢子囊洗脫并混合制成孢子囊懸浮液；A3、分別將孢子囊懸浮液用液滴法接種健康離體植物葉片制成的葉碟背面，葉碟事先用無菌水浸泡30分鐘和2×(待側(cè)殺菌劑最小抑制濃度)藥液浸泡30分鐘；A4、將接種葉蝶置于吸水紙保濕的培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)；A5、測算抗藥性菌株的頻率。該方法簡單易學(xué)，容易操作，對實驗儀器要求不高，且能較準確地反映田間霜霉病菌群體的抗藥性情況，具有較高的實際應(yīng)用價值。
文檔編號C12Q1/18GK102643892SQ201210078708
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者何霞紅, 朱書生, 朱有勇, 李成云, 杜飛, 楊敏, 梅馨月, 王海寧, 鄧維萍 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)