不解糖假蒼白桿菌wzz003及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新菌株一不解糖假蒼白桿菌WZZ003及其在立體拆分 (R，S)-2-(2,6-二甲基苯基氨基）丙酸甲酯反應(yīng)生成光學(xué)純（R)-2-(2,6-二甲基苯基氨 基）丙酸中的應(yīng)用，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（S)-2-(2, 6-二甲基苯基氨基）丙酸甲酯通過(guò)化學(xué)消旋法重 新生成R，S-2-(2, 6-二甲基苯基氨基）丙酸甲酯作為反應(yīng)底物回收利用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 酰胺類農(nóng)藥如甲霜靈是一種高效、低毒、廣譜的內(nèi)吸性殺菌劑，對(duì)由霜霉病菌、疫 霉病菌、腐霉病菌等引起的植物病害具有較強(qiáng)的治療效果，并且有較長(zhǎng)的藥效，是當(dāng)今廣泛 使用的殺菌劑品種之一。甲霜靈（Metalaxyl)是由一對(duì)光學(xué)異構(gòu)體組成的外消旋化合物， 其中R-異構(gòu)體（精甲霜靈）的殺菌活性比S-異構(gòu)體高20-30倍，某些方面甚至高100倍 以上，而且S-異構(gòu)體對(duì)R-異構(gòu)體的活性還有一定的抑制作用。在獲得同等效果的情況下， 精甲霜靈的用量?jī)H為甲霜靈的一半或幾分之一。另外，R-異構(gòu)體在環(huán)境中的降解速度要比 外消旋化合物快得多，具有更好的環(huán)境相容性。因此，精甲霜靈的工業(yè)化生產(chǎn)具有良好的經(jīng) 濟(jì)效益和社會(huì)效益。
[0003] (R)-DMPM是合成酰胺類農(nóng)藥的關(guān)鍵中間體，可用于生產(chǎn)N-?；犷悮⒕鷦?目前，文獻(xiàn)報(bào)道的合成（R) -DMPM主要是用具有旋光性的起始原料，控制適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件獲 得。
[0004] 根據(jù)反應(yīng)原料（l)-x-ch(ch3)cooch3的不同，分為以下幾種不同的制備方法。
[0005] (1)右旋的a-(三氟甲基磺酸酯基）丙酸甲酯和與之對(duì)應(yīng)的胺類反應(yīng)生成 (R)-DMPM。反應(yīng)式如下：
【主權(quán)項(xiàng)】
1?不解糖假蒼白桿菌（Pseudochrobactrum asaccharolyticum)WZZ003,保藏于中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO :M 2014209,保藏日期2014年5月18日，地址為中 國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072。
2. -種權(quán)利要求1所述不解糖假蒼白桿菌WZZ003在拆分外消旋（R，S)-2-(2, 6-二甲 基苯基氨基）丙酸甲酯中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：以不解糖假蒼白桿菌 WZZ003經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體經(jīng)冷凍干燥后的干菌體為催化劑，以外消旋 (R，S)-2-(2, 6-二甲基苯基氨基）丙酸甲酯為底物，以pH值5. 0~7. 2的磷酸緩沖液為反 應(yīng)介質(zhì)，在20~50°C、200rpm條件下進(jìn)行拆分反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液分離純化，獲得 (R) _2-(2,6_二甲基苯基氨基）丙酸。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述底物終濃度為5~100g/L緩沖液，濕菌 體加入量為10~50g/L緩沖液，干菌體加入量為2~10g/L緩沖液。
5. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備： (1) 斜面培養(yǎng)：將不解糖假蒼白桿菌WZZ003接種至斜面培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)2天，獲得 斜面菌體；斜面培養(yǎng)基組成：蛋白胨1(^/1，酵母膏5 §/1，似(：11(^/1，質(zhì)量濃度2%瓊脂，溶 劑為去離子水，pH 7. 0 ; (2) 種子培養(yǎng)：取斜面菌體接種于種子培養(yǎng)基，在30°C、150r/min條件下培養(yǎng)24h，獲 得種子液；種子培養(yǎng)基組成：蛋白胨l〇g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶劑為去離子水，pH 7. 0 ； (3) 發(fā)酵培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，取種子液以體積濃度2%的接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng) 基中，在30°C、150r/min條件下培養(yǎng)24h，獲得發(fā)酵液，取發(fā)酵液在9000rpm離心10min， 棄上清液，收集濕菌體；產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為：酵母膏l(xiāng)lg/L，葡萄糖5g/L，NaCl 0. 5g/L， MgS04lmmol/L，pH 7. 0,溶劑為去離子水； (4) 干菌體的制備：取濕菌體在-40°C條件下凍干2天，得到干菌體。
6. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述分離純化的方法為：轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，將 反應(yīng)液的pH值用鹽酸調(diào)節(jié)至2. 0后，加入乙酸乙醋進(jìn)行萃取，9000rpm離心10min，取上層 有機(jī)相減壓蒸餾至無(wú)液體流出，取濃縮物用甲苯溶解，再加入無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，獲得 濾液和濾餅；取濾液蒸干溶劑后得到產(chǎn)品（R)-2_(2, 6-二甲基苯基氨基）丙酸；取濾餅通 過(guò)消旋化回收利用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種不解糖假蒼白桿菌WZZ003及應(yīng)用，所述的應(yīng)用為：以不解糖假蒼白桿菌WZZ003經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體經(jīng)冷凍干燥后的干菌體為催化劑，以外消旋(R,S)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸甲酯為底物，以pH值5.0～7.2的磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，在20～50℃、200rpm條件下進(jìn)行拆分制備(R)-2-(2,6-二甲基苯基氨基)丙酸；本發(fā)明提供的產(chǎn)酶微生物菌株--不解糖假蒼白桿菌WZZ003的區(qū)域選擇性強(qiáng)，制備的產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值≧99.5％，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，通過(guò)副產(chǎn)物回收利用轉(zhuǎn)化率達(dá)到99％以上，下游分離簡(jiǎn)單，能耗低，環(huán)境污染小，適合工業(yè)化生產(chǎn)。CCTCC NO: M 201420920140518
【IPC分類】C12N1-20, C12P41-00, C12R1-01, C12P13-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104745509
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510134861
【發(fā)明人】章銀軍, 汪釗, 鄭建永, 王敬紅, 吳克崇, 吳貫中
【申請(qǐng)人】浙江工業(yè)大學(xué), 一帆生物科技集團(tuán)有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年3月25日