一株具有降解苯并[ghi]苝功能的羽扇豆蒼白桿菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一株具有降解苯并[ghi]花功能的羽扇?蒼白桿菌。
【背景技術(shù)】
[0002]多環(huán)芳徑(PolycyclicAromatic Hydrocarbons，PAHs)是一類(lèi)含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)，以線(xiàn)狀、角狀或簇狀排列的稠環(huán)型化合物，具有疏水性、低溶解度、低蒸汽壓、高熔點(diǎn)和沸點(diǎn)、辛醇-水分配系數(shù)高等特性。多環(huán)芳烴類(lèi)化合物具有強(qiáng)烈的致癌作用、致畸作用和致突變作用，一般來(lái)說(shuō)，2?3環(huán)的低分子量PAHs具有顯著的急性毒性，而某些高分子量的PAHs具有潛在的致癌性。由于PAHs分子中存在共軛大鍵電子體系，因此具有較高的穩(wěn)定性，其光解作用和生物降解作用緩慢，能夠通過(guò)各種環(huán)境介質(zhì)長(zhǎng)距離迀移并長(zhǎng)期存在于環(huán)境中，通過(guò)環(huán)境蓄積、生物蓄積、生物轉(zhuǎn)化或化學(xué)反應(yīng)等方式損害健康和環(huán)境，已引起各國(guó)環(huán)境科學(xué)家的高度重視。美國(guó)環(huán)保局早在80年代就已把16種未帶分支的PAHs確定為環(huán)境中的優(yōu)先污染物，我國(guó)也把PAHs列入環(huán)境污染的黑名單中。生物降解是實(shí)現(xiàn)恢復(fù)PAHs污染環(huán)境的最有效手段之一，常見(jiàn)的具有降解PAHs功能微生物有假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、拜葉林克氏菌屬(Bei jernckia)、棒狀桿菌屬(Corynebaeterium)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、微球菌屬(Micrococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)和弧菌屬(Vibr1)等。
[0003]然而由于缺少高效的多環(huán)芳烴降解菌，制約了多環(huán)芳烴污染土壤生物修復(fù)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。因此，需要從污染的環(huán)境中馴化篩選出對(duì)多環(huán)芳烴降解速率較快的微生物菌種，然后再把它們應(yīng)用于實(shí)際PAHs污染環(huán)境的生物治理，這對(duì)于治理和修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一株具有降解苯并[ghi]茈功能的羽扇豆蒼白桿菌。所用菌株經(jīng)鑒定為羽扇豆蒼白桿菌Ochrobactrum anthropi DW3，2013年12月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，該中心位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，菌種保藏號(hào)為CGMCC N0.8623。將該菌株制成含菌量為1.25 X 18CFU/ml的菌懸液，可用于環(huán)境中苯并[ghi]茈的降解。
[0005]從污染土壤中分離純化所述苯并[ghi]茈降解菌的步驟如下:
[0006](I)選取受石油污染的土壤，將其通過(guò)直徑為2mm的網(wǎng)篩后立即放置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0007](2)向體積為100mL的開(kāi)口玻璃瓶中加入25?30mL濃度為lg/L的苯并[ghi]茈的丙酮混合溶液，為除去丙酮將玻璃瓶開(kāi)口放置2天。
[0008](3)向步驟(2)中開(kāi)口玻璃瓶中加入500?600mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下攪拌40?50min后加入步驟(I)中的土壤250g ;然后置于溫度為25?30°C的環(huán)境中在轉(zhuǎn)速為100r/min的條件下攪拌富集馴化培養(yǎng)30d，在培養(yǎng)期間定期向玻璃瓶中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基以維持玻璃瓶中泥漿系統(tǒng)的水土比例保持不變；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為:NH4Cl:1.5g.ΙΛ KH2PO4:1.5g.L Λ MgCl2:0.25g.L Λ CaCl2.2H20:0.1Og.L'
[0009](4)向體積為100?200mL的錐形瓶中加入1mL濃度為lg/L的苯并[ghi]茈的丙酮混合溶液，為除去丙酮將錐形瓶開(kāi)口放置2天。
[0010](5)向步驟(4)中的錐形瓶中入50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0.5mL微量金屬液和0.1mL維生素 c 溶液;其中微量金屬液的組成為 -CoCl2.6H20:35mg.L-1，CuCl2:0.20mg.L-1，H3BO3:6.0mg.ΙΛ MnCl2.4H20:25mg.?Λ Na2MoO4.2H20:3.0mg.?Λ NiCl2.2H20:2.0mg.?ΛZnCl2:2.5mg ?L1。
[0011](6)向步驟(5)中的錐形瓶?jī)?nèi)接入步驟(3)馴化的土壤0.25g，然后置于溫度為25?30°C轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)5?7天，每天打開(kāi)瓶口一次以恢復(fù)錐形瓶?jī)?nèi)的溶解氧；按接種體積比為200?250:1的比例轉(zhuǎn)入另一按步驟(4)至(5)處理后的錐形瓶?jī)?nèi)，當(dāng)轉(zhuǎn)接次數(shù)大于8之后即可獲得高效去除苯并[ghi]茈的好氧降解菌群。
[0012](7)向體積為500mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入400mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1.0mL微量金屬液、0.1mL維生素c溶液，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用。
[0013](8)向體積為150mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入50mL按步驟(7)配制的液體培養(yǎng)基和0.60g瓊脂，然后在溫度為121°C的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至65?70°C時(shí)，在超凈工作臺(tái)中將其倒入體積為160mL的培養(yǎng)皿中，為除去培養(yǎng)基表面多余的水分將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)中放置2天。
[0014](9)在超凈工作臺(tái)中向步驟⑶中的培養(yǎng)皿中加入0.5mL濃度為lg/L的苯并[ghi]茈丙酮溶液，來(lái)回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使苯并[ghi]茈的丙酮溶液均勻分布，為除去培養(yǎng)基表面的丙酮將該培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)中放置2天。
[0015](10)向體積為25mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入1mL按步驟(7)配制的液體培養(yǎng)基和0.25g瓊脂，在溫度為121 °C的高壓鍋中滅菌20分鐘，在超凈工作臺(tái)中冷卻至38?40°C。
[0016](11)在超凈工作臺(tái)中向步驟(10)的錐形瓶中加入ImL步驟(6)得到的苯并[ghi]茈好氧降解菌群溶液，搖勻后吸取ImL慢慢加入步驟(9)中的培養(yǎng)皿中，來(lái)回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使接種有混合菌群的培養(yǎng)基溶液均勻分布。將培養(yǎng)皿放入溫度為25°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀(guān)察，10?15天后便可發(fā)現(xiàn)有明顯的菌落出現(xiàn)。
[0017](12)在超凈工作臺(tái)中挑取步驟(11)培養(yǎng)皿中的菌落，進(jìn)行重復(fù)分離，分離純化8個(gè)周期以上即可得到能夠高效降解苯并[ghi]茈的純菌種。
[0018]運(yùn)用上述方法能夠分離純化到對(duì)苯并[ghi]茈降解性能好的微生物菌種。
【具體實(shí)施方式】
[0019]向加入苯并[ghi]茈和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的開(kāi)口玻璃瓶?jī)?nèi)加入受石油污染的土壤進(jìn)行苯并[ghi]茈降解微生物的富集與馴化，30d后向加入苯并[ghi]茈、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑的錐形瓶?jī)?nèi)接入富集馴化的土壤。在溫度為25?30°C、轉(zhuǎn)速為lOOr/min的振蕩器中培養(yǎng)5?7天后，進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于8次后即可得到高效去除苯并[ghi]茈的降解菌群。在超凈工作臺(tái)中制作以苯并[ghi]茈為唯一碳源和能源的瓊脂固體培養(yǎng)基底層平板，在底層平板上制作含有苯并[ghi]茈降解菌群的瓊脂固體培養(yǎng)基頂層平板，將制作好的培養(yǎng)基平板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10?15天。在超凈工作臺(tái)中向加入苯并[ghi]茈、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液及吸附劑的錐形瓶?jī)?nèi)接入培養(yǎng)基平板中的菌落，在溫度為25?30°C、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)5?7天。然后進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于8次后即可得到能夠降解苯并[ghi]茈的純菌種。
[0020]運(yùn)用分離純化得到的降解苯并[ghi]花的菌種羽扇豆蒼白桿菌Ochrobactrumanthropi DW3制成菌懸液，含菌量為1.25X 108CFU/ml，進(jìn)行降解苯并[ghi]茈的降解試驗(yàn)。結(jié)果表明菌株羽扇豆蒼白桿菌Ochrobactrum anthropi DW3能夠?qū)Ρ讲ghi]花進(jìn)行有效的降解，當(dāng)苯并[ghi]茈的初始濃度為0.llmg/L時(shí)，7天后的降解去除率為48.7%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一株對(duì)苯并[ghi]茈具有降解功能的菌株，其特征在于，所述菌株經(jīng)鑒定為羽扇豆蒼白桿菌 Ochrobactrum Lupini DW3，其菌種保藏號(hào)為 CGMCC N0.8623。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了屬于生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域的一株對(duì)苯并[ghi]苝具有降解功能的菌株。苯并[ghi]苝降解菌經(jīng)鑒定為羽扇豆蒼白桿菌Ochrobactrum anthropi DW3，菌種保藏號(hào)為CGMCC No.8623。將該菌株制成含菌量為1.25×108CFU/ml的菌懸液，對(duì)初始濃度為0.11mg/L的苯并[ghi]苝在7天后的降解去除率為48.7％。CGMCC No.862320131220
【IPC分類(lèi)】B09C1-10, C02F101-32, C02F3-34, C12N1-20, C12R1-01
【公開(kāi)號(hào)】CN104630120
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510097225
【發(fā)明人】謝恩, 鄭蕾, 朱宜, 丁愛(ài)中, 豆俊峰
【申請(qǐng)人】北京師范大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年3月5日