專利名稱：耐輻射異常球菌R1 ytxH基因培育耐鹽植物的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及耐福射異常球菌Rl (Deinococcus radiodurans Rl) ytxH基因 (DR0105GeneID =1799501)的新功能，具體涉及該基因在改良植物對鹽脅迫抗性方面的應用。
背景技術：
土壤鹽潰化是一個世界性的資源問題和生態(tài)問題，越來越引起人們的重視。隨著分子生物學的技術進步，使基因的定位、分離、轉(zhuǎn)移成為現(xiàn)實，在提高農(nóng)作物耐鹽能力方面起著重要的作用。耐福射異常球菌Rl (D. radiodurans Rl)因具有對電離福射、UV福射、DNA損傷試劑及滲透脅迫等極強抗性，而成為研究微生物非生物脅迫適應機制的理想菌株，也可作為一個研究高等植物耐鹽的模式物種(Battista et al. , 2001) 來源于D. radiodurans Rl 基因組中一個大質(zhì)粒，其編碼的蛋白與滲透脅迫抗性相關。ytxH基因(DR0105)編碼的蛋白 YtxH (含有40_50aa的保守區(qū)段)屬于Lea76家族，與滲透脅迫相關。但目前未見耐福射異球菌Deinococcus radiodurans Rl中的ytxH基因 (DR0105GeneID :1799501)在提高植物耐鹽性方面的功能的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從D. radiodurans Rl基因組中發(fā)現(xiàn)能夠提高植物對鹽抗性的基因。并將該基因轉(zhuǎn)入植物，使轉(zhuǎn)入該基因的植物獲得耐鹽的性狀。本發(fā)明通過如下研究發(fā)現(xiàn)，Deinococcus radiodurans Rl的ytxH基因 (DR0105GeneID :1799501)具有耐高滲和鹽脅迫的功能，可用于培育耐鹽性狀的植物I、獲得含有H radiodurans RlytxH基因(DR0105)的重組工程菌株I)通過 PCR 從 D. radiodurans Rl (DSM 20539)菌株基因組擴增出 D. radioduransRlytxH 基因(DR0105)，基因序列號為=GeneID 1799501 其大小為 492bp， 該基因編碼163個氨基酸，將其克隆于載體pGEMT-easy上，構(gòu)建了含有完整ytxH基因 (DR0105)的重組質(zhì)粒 pGEMT-ytxH ;2)將ytxH基因(DR0105)連接于pRADZ3穿梭質(zhì)粒上，該質(zhì)粒含有能在大腸桿菌和耐輻射異球菌中都起作用的groEL啟動子，構(gòu)建含有groEL啟動子的完整ytxH基因重組質(zhì)粒 pRADZ3-ytxH G ；3)將導入ytxH基因(DR0105)的重組質(zhì)粒pRADZ3_ytxH G轉(zhuǎn)入受體大腸桿菌 JM109中，獲得工程菌株JM-ytxH (見實施例I)；2、含有D. radiodurans RlytxH基因工程菌株的耐鹽實驗實驗證實，經(jīng)4M NaCl鹽溶液沖擊后，含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105) 的JM-ytxH重組菌株生長狀況良好，菌落數(shù)高于只含空質(zhì)粒的JM-Z3菌株(見實施例2及圖4)。該工程菌株具有耐受4M NaCl沖擊的能力；
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此實驗表明D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)具有提高原核生物耐鹽的能力。3、ytxH基因(DR0105)在油菜中表達及轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性鑒定I)將D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)連接到植物表達載體pBI 121中，構(gòu)建具有ytxH基因(DR0105)的重組質(zhì)粒pBI121_ytxH ;2)將pBI121-ytxH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化油菜中，獲得了能夠耐受鹽脅迫的轉(zhuǎn)基因油菜植株;此實驗表明D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)具有培育耐鹽植物的用途(見實施例3及圖5)。


圖I是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)序列的PCR產(chǎn)物的驗證電泳2是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)及groEL啟動子的原核表達載體的構(gòu)建驗證電泳圖譜；圖3是在鹽沖擊試驗前的含有空載體和含有D. radiodurans RlytxH基因 (DR0105)序列的原核表達載體的大腸桿菌的生長狀況的菌落照片，其中a是含有空表達載體的大腸桿菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)表達載體的大腸桿菌重組菌株；圖4是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)的原核表達載體及空載體的大腸桿菌(E. coli)在含4M NaCl培養(yǎng)基中的生長情況的菌落照片，圖中的菌株如下a是含有空表達載體的大腸桿菌JM109菌株；b是含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)表達載體的大腸桿菌重組菌株。圖5 是在 300mmol. L4 的 NaCl 培養(yǎng)基上轉(zhuǎn) D. radiodurans RlytxH 基因(DR0105) 油菜與非轉(zhuǎn)基因油菜的耐鹽試驗結(jié)果比較。圖中，從左至右，左起第I盆是非轉(zhuǎn)基因油菜， 第2-3盆是轉(zhuǎn)入D. radiodurans RlytxH基因的油菜。
具體實施例方式以下實施例中所舉的質(zhì)粒、菌株只是用于對本發(fā)明作進一步詳細說明，并不對本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容加以限制。凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所舉的質(zhì)粒、菌株來源如下克隆載體pGEMT-easy :為Promrga公司市售產(chǎn)品；穿梭質(zhì)粒pRADZ3 :為本實驗室保存；植物表達載體pBI121 :為Clontech公司市售產(chǎn)品；大腸桿菌JM 109 :為北京全式金公司市售產(chǎn)品。農(nóng)桿菌EHA 105由本實驗室保存實施例ID. radiodurans RlytxH基因(DR0105)在大腸桿菌中的表達根據(jù)已公布的D. radiodurans Rl基因組中的DR_0105基因序列設計I對PCR特異性引物，從D. radiodurans Rl基因組DNA中擴增完整的核苷酸序列Up 5' ATTA JCWGT TCGCACGTGGGTGATGAGGC 3'；Down 5' ACGC C4Γν4rGAGGCGATCAGTCCTGGTTTT 。其中黑斜體部分是酶切位點。通過PCR方法從D. radiodurans Rl的基因組中擴增出目的基因序列，反應條件為94°C IOmin, [94°C 60sec,55°C 30sec,72°C 60sec]30 個循環(huán)，72°C lOmin，PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，克隆于載體pGEMT-easy上，命名為pGEMT-ytxH，并測序驗證克隆基因正確；然后通過Spel/Ndel雙酶切獲得含有粘性末端的ytxH基因及含有啟動子groEL的pRADZ3載體， 將ytxH基因連接于pRADZ3載體上，構(gòu)建大腸桿菌表達載體pRADZ3-ytxH G，將該表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)PCR、酶切，測序驗證插入序列正確(見圖1，2)，將該菌株命名為 JM-ytxHο將含有pRADZ3空質(zhì)粒的E. coli JMl09命名為JM-Z3。實施例2含D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)重組菌株的耐鹽實驗一、實驗方法I、將實施例I中獲得的2個重組的大腸桿菌分別接種于20mL LB液體培養(yǎng)基(含 Amp抗生素)中，搖瓶過夜培養(yǎng)后(37°C )，再轉(zhuǎn)接于IOOmL的LB液體培養(yǎng)基中，盡量保持接種量的一致，培養(yǎng)至0D_約為0. 5。2、取IOmL的菌液離心后，在等體積的4M NaCl鹽溶液里沖擊2h，每個樣品立即用無菌去離子水倍比稀釋至10_4，取10 μ L點在LB固體培養(yǎng)基表面，經(jīng)37°C培養(yǎng)16h，觀察菌落形成情況并照相。二、實驗結(jié)果圖3顯示，4M NaCl鹽溶液沖擊前前含有D. radiodurans RlytxH基因(DR0105) 的JM-ytxH菌株與含空質(zhì)粒的JM-Z3菌株生長狀態(tài)基本一致；4M NaCl鹽溶液沖擊后，含有 D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)的JM-ytxH菌株生長狀況良好，菌落數(shù)明顯高于只含空質(zhì)粒的JM-Z3菌株(見圖4)。三、結(jié)論D. radiodurans RlytxH基因(DR0105)提高了原核生物耐鹽的能力。實施例3ytxH基因(DR0105)在油菜中表達及轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性鑒定(一 )農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化油菜實驗I.根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)的制備I)挑取單菌落，接種于5mL YEB液體培養(yǎng)基(含利福平Rif 50mg/L), 28°C, 250rpm 振蕩培養(yǎng)過夜；2)取 2mL 菌液，加入 50mL YEB 液體培養(yǎng)基(含 Rif 50mg/L)中，28°C，250rpm 振蕩培養(yǎng)至OD600 O. 6 ;3)將菌液轉(zhuǎn)至50mL無菌離心管中，冰浴30min,5000Xg離心5min ；4)棄上清，用2mL 20mM CaCl2重懸沉淀，每份100 μ L分裝到I. 5mL離心管中，液
氣中保存?zhèn)溆谩?.重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌I)將約I μ g的pBI-ytxH質(zhì)粒DNA分別加入到100 μ LEHA105感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴5min ；2)將離心管置液氮中冷凍8min，迅速轉(zhuǎn)至37°C水浴中溫浴5min ；3)加入ImL YEB液體培養(yǎng)基，在28°C搖床上250rpm復蘇4 5h ;4)取適量菌液涂布到含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上，置28 °C培養(yǎng)24 48h。3.農(nóng)桿菌的質(zhì)粒的提取I)挑取菌落于含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB液體培養(yǎng)基中(YEB :胰蛋白胨5g/L，酵母提取物lg/L，蔗糖5g/L，硫酸鎂O. 5g/L)，28°C，250rpm振蕩培養(yǎng)20h ；2)取 I. 5mL 菌液離心后，棄上清，用 STE 溶液(Tris-HCI IOmM pH8. O, NaCl IOmM, EDTA IOmM pH 8. O)洗滌2次，棄上清，加入預冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mM Tris-HClpH8. O, IOmM EDTA pH 8. O, RNase A 100 μ g/mL) 300 μ L，用移液器反復抽吸混勻， 室溫靜置IOmin ；3)加入新鮮配置的溶液II (O. 2M NaOH, I % SDS) 600 μ L，上下顛倒幾次混勻；4)加入預冷的溶液III (5Μ乙酸鉀pH 5. 2，冰醋酸11. 5mL，加水至IOOmL) 450 μ L， 充分混勻，冰浴5min，4°C 12000 Xg離心5min，取上清用O. 6倍體積的異丙醇沉淀；5)沉淀用適量 TE (Tris-HCI IOmmoI/L，ImmoI/LEDTA，pH 8. O)溶解后，經(jīng) PCR、Bam HI、Sac I雙酶切驗證。4.油菜無菌苗的準備及農(nóng)桿菌介導的ytxH基因(DR0105)遺傳轉(zhuǎn)化I)油菜無菌苗的培養(yǎng)甘藍型油菜(Brassicanapus L. ) (84100-18)種子在超凈工作臺上用滅菌水浸泡 IOmin, 10 %的NaClO滅菌12min，再用O. I %的升汞溶液消毒7_8min，用滅菌水洗3_5遍，并把滅菌的油菜種子均勻地擺放在無激素的預培養(yǎng)基上(7.5%瓊脂)。光照培養(yǎng)，4-5d齡油菜幼苗最適于遺傳轉(zhuǎn)化。2)預培養(yǎng)用75%的酒精和高溫消毒滅菌的剪刀剪掉子葉和生長點，剪取油菜無菌苗緊鄰生長點下約O. 5cm長的下胚軸，置于預培養(yǎng)基(MS+6-BA 2mg/L+2,4_D lmg/L+AgN032. 5mg/ L+AS 19. 62mg/L)上，光照預培養(yǎng)2d。3)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)在50mL LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素100mg/L、利福平50mg/L)中加入 O. ImLytxH-EHA 105 菌液，28°C下 220rpm 振蕩培養(yǎng) 16h 左右，室溫下 4000 Xg 離心 lOmin， 棄上清液，菌體用滅菌的MS液體培養(yǎng)基(含AS 100 μ mol/L)懸浮，稀釋到原體積的5_20 倍，在28°C下220rpm振蕩培養(yǎng)lh，使菌液的OD6tltl達0. 5左右。4)共培養(yǎng)把預培養(yǎng)2d的下胚軸放入菌液中浸染lmin，用藥勺撈出下胚軸，放在滅菌的吸水紙上，吸干下胚軸上的多余菌液，再放到覆蓋有滅菌濾紙的預培養(yǎng)基上，用封口膜封好培養(yǎng)皿，25 °C左右，于暗處共培養(yǎng)約2d(暗培養(yǎng))。5)誘導培養(yǎng)把共培養(yǎng)2d的下胚軸放到誘導培養(yǎng)基(MS+6-BA 2mg/L+AgN032. 5mg/L)上，用封口膜封好培養(yǎng)皿，25°C左右光照培養(yǎng)，每2周繼代I次，直至長出膨大的愈傷組織。6)選擇培養(yǎng)把膨大的愈傷組織轉(zhuǎn)移到到篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA 2mg/L+AgN032. 5mg/L+Kan 100mg/L)上，用封口膜封好培養(yǎng)皿，25°C左右光照培養(yǎng)，每2周繼代I次，直至長出苗。7)生根培養(yǎng)當幼芽長到l-2cm高時，把它們從愈傷組織上分離，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上 (1/2MS+NAA O. 5mg/L+Kan 25mg/L)進行生根培養(yǎng)。在抗生素篩選條件下，約87%的芽在2 周后形成根。8)煉苗和移栽生根后的幼苗長到5-6cm高時，半敞開培養(yǎng)瓶蓋子，進行煉苗；待幼苗適應外界環(huán)境以后，轉(zhuǎn)移到室內(nèi)滅菌的蛭石中栽種培養(yǎng)，并用1/2MS培養(yǎng)液澆灌。當幼苗生長至7-9cm 時，將幼苗移植到泥土中生長，然后再進行下一步實驗。(二)含ytxH基因(DR0105)序列轉(zhuǎn)基因油菜的耐鹽性鑒定實驗I、實驗目的鑒于該核苷酸序列已被證明在大腸桿菌中對鹽脅迫具有抗性，進一步對轉(zhuǎn)基因植株進行耐鹽性鑒定。2、實驗方法采用不同的NaCl 濃度(0、50、100、150、200、250 和 300mmol. L-1NaCl)分別對轉(zhuǎn)基因油菜植株和非轉(zhuǎn)基因油菜植株進行生長情況的觀察。3、實驗結(jié)果在沒有NaCl處理的情況下，轉(zhuǎn)基因油菜和非轉(zhuǎn)基因油菜的生長狀況沒有明顯的
差異;在添加50mmol. T1NaCl的情況下，非轉(zhuǎn)基因油菜仍然能保持生長，但生長的速率比轉(zhuǎn)基因油菜要緩慢一些。表明低鹽條件下，野生型植株生長已明顯受到抑制；當NaCl的濃度增加到100和150mmol. L—1時，非轉(zhuǎn)基因的油菜葉片最初變黃、接著葉片逐漸萎蔫，20d后全部死亡；當NaCl濃度為200mmol. Γ1時，非轉(zhuǎn)基因的油菜葉片迅速發(fā)黃、葉片萎焉，幼葉幾乎停止生長，并向葉背面翻卷，由原來的綠色變淺綠，大約在15d后死亡；當NaCl濃度增加到250和300mmol. L—1，非轉(zhuǎn)基因油菜苗均在2d內(nèi)開始發(fā)黃，7_8d 后幾乎全部死亡，而轉(zhuǎn)基因油菜均能夠存活5周以上。從圖5可知轉(zhuǎn)基因油菜可在300mmol. Γ1的NaCl培養(yǎng)基上正常生長，非轉(zhuǎn)基因油菜在300mmol. Γ1的NaCl培養(yǎng)基上干枯死亡。結(jié)果證明，該基因?qū)}的脅迫確有抗性。而在上述各種NaCl濃度下，轉(zhuǎn)入ytxH基因(DR0105)的油菜均能正常生長。上述實驗結(jié)果見表I :表I轉(zhuǎn)基因油菜和非轉(zhuǎn)基因油菜對鹽脅迫的比較
權利要求
1.Deinococcus radiodurans RlytxH 基因(DRO105, GeneID :1799501)培育耐鹽植物的用途。
2.含Deinococcus radiodurans RlytxH 基因的重組質(zhì)粒。
3.含有D.radiodurans RlytxH基因的重組工程菌株。
4.含Deinococcusradiodurans RlytxH基因的重組質(zhì)粒培育耐鹽植物的用途。
5.權利要求4所述的用途，所述重組質(zhì)粒是能在大腸桿菌表達的質(zhì)粒。
6.權利要求4所述的用途，所述重組質(zhì)粒是能在植物中表達的質(zhì)粒。
7.權利要求4所述的用途，所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細胞培育耐鹽植物的用途。
8.權利要求7所述的用途，所述宿主細胞包括原核細胞和真核細胞。
9.權利要求I或4所述的用途，所述植物是油菜。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)耐輻射異球菌Deinococcus radiodurans R1中的ytxH基因(DR0105)具有提高原核生物及植物的抗逆能力。本發(fā)明構(gòu)建了包含上述基因的重組載體，把它們分別導入原核及真核宿主細胞。實驗證實，ytxH基因(DR0105)能夠提高原核生物耐鹽的能力；將該基因轉(zhuǎn)入植物后獲得的轉(zhuǎn)基因植物也具有耐鹽的能力。
文檔編號C12N15/31GK102586283SQ201210046539
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權日2012年2月24日
發(fā)明者張維, 林敏 , 江世杰, 王勁, 趙鵬, 陳明 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所