能源作物荻抗鹽基因MsVP2及其植物表達(dá)載體和構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及荻耐鹽基因MsVP2及其表達(dá)載體和構(gòu)建方法。MsVP2基因的序列為SEQ?ID?NO.1，所構(gòu)建的表達(dá)載體pEarleyGate103-MsVP2是由MsVP2基因插入到克隆載體pMD19-T?simple?vector，經(jīng)Sal?I和Not?I雙酶切后連接到gateway入門載體pENTR1A的Sal?I和Not?I位點，pENTR1A-MsVP2質(zhì)粒經(jīng)線性化后與pEarleyGate103載體質(zhì)粒進(jìn)行LR重組反應(yīng)得到的。本發(fā)明提供的荻MsVP2是一個新的抗鹽基因，該基因可提高植物抗鹽性，可在創(chuàng)造抗鹽新種質(zhì)、植物品種改良中應(yīng)用。
【專利說明】能源作物荻抗鹽基因MsVP2及其植物表達(dá)載體和構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及荻耐鹽基因MsVP2及其植物表達(dá)載體和構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002]鹽脅迫是影響植物生長發(fā)育的重要脅迫因子，是限制我國鹽堿地高效利用的關(guān)鍵因子。因此開展抗鹽性的研究成為熱點領(lǐng)域。荻(Miscanthus saccharif1ra)為禾本科(Gramineae)芒屬(Miscanthus Anderss.)植物,作為原產(chǎn)我國的重要能源植物,具有很高的開發(fā)利用價值，然而由于目前生產(chǎn)上常用的奇崗(Miscanthus x giganteus)等材料的耐鹽性相對有限，極大影響了其在鹽堿地的栽培應(yīng)用。鑒于抗鹽性是是一個多基因控制的數(shù)量性狀，雜交育種等常規(guī)育種方法效率低。已有研究表明，轉(zhuǎn)高效抗鹽基因的分子育種對提高植物抗鹽性有積極作用。
[0003]氫離子焦磷酸酶(H+-PPase, VP)是位于液泡膜上的一種質(zhì)子泵，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的氫離子轉(zhuǎn)運，改變其酸堿度，為其他物質(zhì)運輸提供動力，從而影響植物的生長發(fā)育。目前從植物中鑒定到兩個類型:鉀離子敏感性VPl和鉀離子不敏感型VP2，大量的研究集中在VPl基因上，其通過建立的氫離子梯度，誘導(dǎo)鈉氫反向轉(zhuǎn)運蛋白將鈉離子導(dǎo)入液泡，緩解鈉毒害，提高抗鹽性。而鉀離子不敏感型VP2的功能尚不明確，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥VP2定位于高爾基體，可能參與高爾基體上質(zhì)子轉(zhuǎn)運，進(jìn)而可以起到緩解植物在鹽脅迫下的受害程度的作用。
[0004]在植物的遺傳轉(zhuǎn)化途徑中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是應(yīng)用最為廣泛的方法之一，其中有效的植物表達(dá)載體至關(guān)重要。將抗鹽基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，可獲得具有抗鹽特性的新種質(zhì)。對于優(yōu)良作物新品種的培育及在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對【背景技術(shù)】提出的解決提高荻耐鹽性的問題，本發(fā)明的目的在于提供一個新的荻抗鹽基因MsVP2，該基因的序列為SEQ ID N0.1。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于該抗鹽基因MsVP2的植物表達(dá)載體。
[0007]本發(fā)明所構(gòu)建的植物表達(dá)載體可確定MsVP2的抗鹽功能，為植物品種改良提供優(yōu)異的抗鹽基因。
[0008]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0009]獲抗鹽基因MsVP2，該基因的序列為SEQ ID N0.1。
[0010]荻抗鹽基因MsVP2的植物表達(dá)載體，由本發(fā)明所述的荻抗鹽基因MsVP2(序列為SEQ ID N0.1)與中間表達(dá)載體pEarleyGatel03構(gòu)成。
[0011]上述的荻抗鹽基因MsVP2的植物表達(dá)載體，是由Sal I和Not I雙酶切MsVP2后插入到gateway入門載體pENTRlA,經(jīng)NsiI單酶切線性化與pEarleyGatel03表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行重組反應(yīng)得到。
[0012]荻抗鹽基因pEarleyGatel03植物表達(dá)載體，其構(gòu)建方法如下:
[0013]I)荻抗鹽基因MsVP2的克隆
[0014]以提取的荻幼嫩葉片為材料，提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計引物擴(kuò)增MsVP2基因，
[0015]上游弓丨物MSVP2-F: 5' -ATGATGGAAGAAGACGTGGA-3'
[0016]下游引物MsVP2-R: 5' -CAAGAATATTGGTGCCATGACC-3'
[0017]以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，產(chǎn)物連接到pMD19-TSimple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，測定的序列為SEQ ID N0.1 ；
[0018]2)植物表達(dá)載體 pEarleyGatel03_MsVP2 的構(gòu)建
[0019]設(shè)計引物以荻cDNA為模板，用高保真酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，在MsVP2基因的上游和下游分別引入Sal I和Not I酶切位點，
[0020]上游引物MsVP2-gateway-F:5' -GCGTCGACATGATGGAAGAAGACGT-3'
[0021]下游引物MsV P2-gateway-R:5/ -TTGCGGCCGCGACAAGAATATTGGTGCCAT-3'
[0022]PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，SalI和Not I雙酶切的MsVP2片段與Sal I和Not I雙酶切的pENTRlA連接，轉(zhuǎn)化，提取的陽性質(zhì)粒經(jīng)NsiI單酶切線性化,與pEarleyGatel03載體質(zhì)粒進(jìn)行LR重組反應(yīng),轉(zhuǎn)化,提取陽性質(zhì)粒，電泳檢測并測序驗證為SEQ ID N0.1，植物表達(dá)載體PEarleyGatel03-MsVP2構(gòu)建成功。
[0023]3)ZmVPl的植物表達(dá)載體用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，提高植物抗鹽性，方法如下:
[0024]農(nóng)桿菌菌株GV3101感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化
[0025]擬南芥花序浸染及種子篩選
[0026]抗鹽評價
[0027]本發(fā)明的有益效果:
[0028]1.本發(fā)明提供的獲MsVP2是Iv新的抗鹽基因，該基因可提聞植物抗鹽性。
[0029]2.本發(fā)明構(gòu)建的荻MsVP2植物表達(dá)載體為首次報道，可直接用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化，提高植物的抗鹽性，可進(jìn)行植物品種改良。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1:MsVP2瓊脂糖凝膠電泳分析，從左至右依次為M:DNA Marker ；MsVP2全長PCR電泳圖；pMD19-T Simple-MsVP2 質(zhì)粒 Sal I 和 Not I 雙酶切；pEarleyGatel03-MsVP2 表達(dá)載體電泳檢測圖
[0031]圖2:植物表達(dá)載體 pEarleyGatel03_MsVP2 圖譜
[0032]圖3:轉(zhuǎn)基因擬南芥抗鹽鑒定
[0033]圖4:植物表達(dá)載體pEarleyGatel03_MsVP2構(gòu)建方法示意圖

【具體實施方式】
[0034]實施例1植物表達(dá)載體pEarleyGatel03_MsVP2的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
[0035]1.MsVP2 的克隆:
[0036]選用荻(Miscanthus sacchariflora)作為材料,選取健康的插條,扦插成活的幼苗(20天)于鹽(200mM NaCl)連續(xù)脅迫處理3天，取0.05g幼嫩葉片，參照Trizol RNA提取試劑盒(TaKaRa)說明書方法，提取葉片總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)取IygS RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物，參照擬南芥VP2序列信息(NCBI登錄號:AT1G16780)，經(jīng)01igo6.0軟件分析設(shè)計引物擴(kuò)增MsVP2 ；
[0037]上游引物MsVP2-F: 5' -ATGATGGAAGAAGACGTGGA-3'
[0038]下游引物MsVP2-R: 5' -CAAGAATATTGGTGCCATGACC-3'
[0039]以提取的葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，
[0040]50yL 反應(yīng)體系:10 X RCR Buffer 5.0 μ L，MsVP2_F、MsVP2_R 引物各l.0yL (20 μ mo 1-L1), dNTP mix 4.0 μ L (2.5mmo 1-L1), Taq DNA Polymerase 0.2 μ L,cDNA 模板 I μ L，d dH20 37.8 μ L ;反應(yīng)程序:95°C 預(yù)變性 4min，然后 94°C 解鏈 30sec，55°C 退火30sec，72°C延伸Imin 30sec，反應(yīng)33個循環(huán)，72°C延伸1min ;PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收純化，用 T4DNA 連接酶(TaKaRa)連接到 pMD19_T Simple 載體(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，序列測定為SEQ ID N0.1 ；
[0041]2.植物表達(dá)載體 pEarleyGatel03_MsVP2 的構(gòu)建
[0042]設(shè)計引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在目的基因MsVP2的上游和下游分別引入酶切位點SalI和Not 1沖0?產(chǎn)物連接到？1?191 Simple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，Sal I和Not I雙酶切的MsVP2片段與Sal I和Not I雙酶切的pENTRlA連接，轉(zhuǎn)化，提取的陽性質(zhì)粒經(jīng)線性化后，與pEarleyGatel03載體質(zhì)粒進(jìn)行LR重組反應(yīng)(Invitrogen,USA),轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒，電泳檢測并測序驗證為SEQ ID N0.1。
[0043]上游引物MsVP2-gateway-F:5' -GCGTCGACATGATGGAAGAAGACGT-3'
[0044]下游引物MsVPhgateway-R:5/ -TTGCGGCCGCGACAAGAATATTGGTGCCAT-3'
[0045]①以荻葉片cDNA作為模板，用高保真酶(PrimeSTAR? HS DNA Polymerase,TaKaRa)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，50 μ L 反應(yīng)體系:10 X HS RCR Buffer 5.0 μ L, MsVP2_gateway_F、MsVP2-gateway-R 引物各 1.0μL(20μηιο1.L-1)，dNTP mix4.0 μ L(2.5mmol.L-1)，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase0.4 μ L，cDNA 模板 I μ L, ddH2037.6 μ L ;反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性4min，然后94°C解鏈30sec，55°C退火30sec，72°C延伸Imin 30sec,反應(yīng)30個循環(huán)，72°C延伸1min ;PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN，USA)回收，連接到pMD19_T Simple載體，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒pMD19-T Simple-MsVP2 ；
[0046]②取gateway 入門載體 pENTRlA (Invitrogen, USA)和 pMD19-TSimple_MsVP2 用Sal I 和 Not I 雙酶切，雙酶切體系(50 μ L):10 X H Buffer 5 μ L, BSA 5 μ L，質(zhì)粒 pENTRlA或 PMD19-T Simple-MsVP2 15 μ L，Sal I 2 μ L, Not I 2 μ L, ddH20 21 μ L ;37°C 反應(yīng) 3h ;雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收質(zhì)粒pENTRlA大片段和pMD19-TSimple-MsVP2小片段。用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接兩個回收的產(chǎn)物，連接反應(yīng)體系(1yL): 10 X T4Iigase Buffer I μ L，pENTRlA 大片段 2 μ L，pMD19-TSimple_MsVP2小片段6 μ L，T4DNA連接酶I μ L ; 16°C過夜連接反應(yīng)，取5 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)胞。37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pENTRlA-MsVP2。
[0047]③取質(zhì)粒pENTRlA-MsVP2 用 Pvu I 單酶切，酶切體系(40 μ L): 10 X K Buffer4 μ L,0.1 % BSA 4μ L，質(zhì)粒 pENTRlA-MsVP2 15 μ L，Pvu I 2 μ L, ddH20 15 μ L ;37°C 反應(yīng) 2h，用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收質(zhì)粒pENTRlA-Pvu I片段。將回收的片段與pEarleyGatel03載體質(zhì)粒進(jìn)行LR重組反應(yīng)，反應(yīng)體系(6 μ L):pENTRlA-ZmVPl大片段4 μ L，pEarleyGatel03質(zhì)粒 I μ L, LR Clonase? IIenzyme mix I μ L ;25 °C 反應(yīng) lh,力卩入 I μ L Proteinase K,37°C反應(yīng)1min ;重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，37 °C過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pEarleyGatel03-MsVP2，電泳和測序驗證為SEQ ID N0.1。植物表達(dá)載體pEarleyGatel03-MsVP2 的構(gòu)建成功。
[0048]3.植物表達(dá)載體pEarleyGatel03-MsVP2的遺傳轉(zhuǎn)化及其抗鹽性鑒定
[0049]①農(nóng)桿菌菌株GV3101感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化
[0050]從YEB (50ug/mL利福平)平板上挑取GV3101單菌落，接種于50mL含50ug/mL利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，220rpm，28°C培養(yǎng)至OD值0.6，而后冰浴菌液30min，離心收集菌體，懸浮于2mL預(yù)冷的的10mM CaCl2 (20%甘油)溶液中，200uL/管分裝，待用。
[0051]取5uL pEarIeyGate 103-MsVP2載體質(zhì)粒,加入10uL感受態(tài)細(xì)胞,冰浴30min,液氮冷凍5min，37°C 5min,加入800uLYEB液體培養(yǎng)基，28°C 200rpm預(yù)培養(yǎng)3h，菌液涂板于YEB(50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)固體培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)2天，挑取單克隆檢測，選取陽性克隆搖菌，用于擬南芥花序轉(zhuǎn)化。
[0052]②擬南芥花序浸染及種子篩選
[0053]將陽性單克隆接到50mL的YEB (50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)36小時，5000rpm離心20分鐘，然后用轉(zhuǎn)化液(5 %蔗糖+500uL/L的Si Iwet L-77)劇烈懸浮沉淀至完全懸起。將擬南芥地上部分直接浸泡于上述懸浮液中I分鐘，然后用保鮮膜完全包裹植株以保濕，放回培養(yǎng)室培養(yǎng)24小時，打開保鮮膜，待種子成熟時采收。
[0054]種子消毒與播種:將種子放入5mL的離心管中，加入50 %巴斯消毒液，添加0.1 %的Triton X-100搖晃15分鐘，然后在超凈臺中用無菌水洗5次，而后直接把種子倒在滅菌過的濾紙上，吹干種子(放置I小時)，輕輕敲擊濾紙將干種子均勻撒播到篩選培養(yǎng)基(l/2MS+20mg/L草胺磷+25mg/L氨芐青霉素)篩選培養(yǎng)10天，然后將抗性苗移栽到土中，用透明的蓋子覆蓋幼苗I周以保濕。
[0055]③抗鹽評價
[0056]經(jīng)PCR鑒定的T1代轉(zhuǎn)基因苗繼續(xù)生長，采收T2代種子。對野生型和T2代抗性轉(zhuǎn)基因擬南芥種子分別播于MS(0mM，120mM NaCl)的固體培養(yǎng)基上生長20天后，觀察其生長情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥抗鹽性顯著高于高于野生型擬南芥(圖4)。
[0057] 綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建了含有抗鹽基因的植物表達(dá)載體PEarleyGatel03-MsVP2，其中MsVP2首次報道。所構(gòu)建的載體可導(dǎo)入植物中，提高植物的抗鹽特性。
【權(quán)利要求】
1.荻耐鹽基因MsVP2，其特征在于該基因的序列為SEQID N0.1。
2.荻耐鹽基因MsVP2的植物表達(dá)載體，其特征在于由權(quán)利要求1所述的荻耐鹽基因MsVP2與植物表達(dá)載體構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的荻耐鹽基因MsVP2的植物表達(dá)載體，其特征在于所述的植物表達(dá)載體為Sal I和Not I雙酶切MsVP2后插入到gateway入門載體pENTRlA，經(jīng)線性化后與pEarleyGatel03表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行重組反應(yīng)得到。
4.權(quán)利要求2或3所述的荻耐鹽基因MsVP2植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟: 1)荻耐鹽基因MsVP2的克隆 以荻幼嫩葉片為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為eDNA，設(shè)計引物擴(kuò)增MsVP2基因，上游引物MsVP2-F: 5' -ATGATGGAAGAAGACGTGGA-3'
下游引物 MsVP2-R: 5' -CAAGAATATTGGTGCCATGACC-3' 以反轉(zhuǎn)錄的eDNA為模板，以MsVP2-F和MsVP2_R為引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，測定的序列為SEQ ID N0.1 ； 2)植物表達(dá)載體PEarleyGatel03-MsVP2的構(gòu)建 設(shè)計引物以荻eDNA為 模板，用高保真酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，在MsVP2基因的上游和下游分別引入Sal I和Not I酶切位點，
上游弓 I 物 MsVP2-gateway-F: 5' -GCGTCGACATGATGGAAGAAGACGT-3'
下游引物 MsVP2-gateway-R:5/ -TTGCGGCCGCGACAAGAATATTGGTGCCAT-3' PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，Sal I和Not I雙酶切的MsVP2片段與Sal I和Not I雙酶切的pENTRlA連接，轉(zhuǎn)化，提取的陽性質(zhì)粒經(jīng)NsiI單酶切線性化后與pEarleyGatel03載體質(zhì)粒進(jìn)行LR重組反應(yīng),轉(zhuǎn)化,提取陽性質(zhì)粒，電泳檢測并測序驗證為SEQ ID N0.1，植物表達(dá)載體PEarleyGatel03-MsVP2構(gòu)建成功。
5.權(quán)利要求1所述的荻耐鹽基因MsVP2在創(chuàng)建耐鹽新種質(zhì)中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的植物表達(dá)載體在創(chuàng)建耐鹽新種質(zhì)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/55GK104178503SQ201410311794
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】宗俊勤, 劉建秀, 陳煜 , 陳靜波, 李蘭蘭, 郭愛桂 申請人:江蘇省中國科學(xué)院植物研究所