專利名稱：一種植物乳桿菌ccfm8724及其用途的制作方法
一種植物乳桿菌CCFM8724及其用途
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)CCFM8724，還涉及所述植物乳桿菌 CCFM8724 的用途。
背景技術(shù)：
空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)是彎曲桿菌屬成員之一，屬革蘭氏陰性菌，是全球范圍內(nèi)感染性腹瀉常見的病原菌，世界衛(wèi)生組織(WHO)在1980年將空腸彎曲桿菌病列為常見的食源性疾病。C. jejuni是一種人獸共同感染的病原菌，廣泛存在于環(huán)境中， C. jejuni能定植在各種野生禽類和家禽、家畜的腸道內(nèi)，如雞、鴨、鵝等家禽，貓、狗等寵物， 牛、豬等家畜，鴿子、麻雀等鳥類以及野生動(dòng)物等為常見的動(dòng)物宿主。人類通過與這些動(dòng)物的接觸而可能受到感染，此外，生的、欠火候的或受污染的雞肉、牛肉，未徹底殺菌的牛奶以及污染的水都可以引起人類感染空腸彎曲桿菌。20世紀(jì)90年代以來，C. jejuni感染率呈逐年上升的趨勢(shì)。在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家， C. jejuni是造成腹瀉的主要病原體，有時(shí)甚至超過沙門氏菌和志賀氏菌而居首位。最近數(shù)十年，在發(fā)達(dá)國(guó)家中空腸彎曲桿菌病的發(fā)病數(shù)逐年增長(zhǎng)，僅在美國(guó)每年的發(fā)病例數(shù)就高達(dá) 250萬(wàn)人次，我國(guó)和其它發(fā)展中國(guó)家的患者多集中在兒童。急性自限性胃腸炎是C. jejuni 感染的典型癥狀，免疫力極低下者還會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、腦炎、敗血癥等全身性疾病，最嚴(yán)重的并發(fā)癥是某些血清型C. jejuni感染引起的周圍神經(jīng)自身免疫性疾病-格林-巴利綜合癥(Guillain-Barre syndrome, GBS)。C. jejuni的致病機(jī)理是復(fù)雜的，主要是通過粘附、定植、侵入、產(chǎn)毒素等機(jī)制感染機(jī)體而導(dǎo)致疾病。鞭毛、外膜蛋白、脂多糖或脂寡糖、莢膜多糖等在C. jejuni附著和定植于宿主腸道上皮細(xì)胞的過程中起重要作用。所有C. jejuni都能產(chǎn)生細(xì)胞致死性膨脹毒素 (Cytolethal distending toxin，CDT)，CDT有多方面致病性，能直接破壞宿主細(xì)胞DNA ；能通過阻止細(xì)胞分裂關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子CDC2蛋白的去磷酸化等作用，使宿主細(xì)胞周期不可逆地阻斷在G2期而不再進(jìn)入M期，細(xì)胞不能增殖分化，致宿主腸道細(xì)胞失去調(diào)節(jié)形態(tài)和容量的能力，使細(xì)胞進(jìn)行性擴(kuò)張，最終破裂死亡；能激發(fā)宿主產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-8，導(dǎo)致局部炎癥的發(fā)生。C. jejuni的廣泛分布、較高發(fā)病率以及相關(guān)疾病的危害已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。近年來抗菌藥物的使用已經(jīng)使細(xì)菌耐藥性日趨嚴(yán)重，反而推動(dòng)了這類食源性病原菌的流行。加強(qiáng)對(duì)C. jejuni的預(yù)防是控制彎曲桿菌病的重要手段之一，而且在公共衛(wèi)生、食品安全、畜牧獸醫(yī)中都有重要的意義。益生菌被定義為活的微生物，適量攝入益生菌對(duì)人體具有有益的功效，通過益生菌來預(yù)防和治療腸道細(xì)菌性感染已經(jīng)成為相關(guān)領(lǐng)域研究的一個(gè)重要課題。乳酸菌具有抑制各種革蘭氏陽(yáng)性和陰性病原菌的功能，其抑制機(jī)制可能是由于產(chǎn)生有機(jī)酸，如乳酸和乙酸、 過氧化氫、細(xì)菌素及類似細(xì)菌素的物質(zhì)，還包括競(jìng)爭(zhēng)排斥作用、促進(jìn)腸道微生態(tài)平衡以及增強(qiáng)宿主的防御能力。此外，某些益生菌能在胃腸道環(huán)境中存活并定植于腸道，這些微生物治療可以作為治療腸道菌群失調(diào)的一種方法。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)乳酸菌干預(yù)病原菌感染進(jìn)行了很多研究。CN1796540公開了一種具有抗腸道致病菌和抗氧化特性的雙歧桿菌；CN1982437公開了一種抗腸道致病菌和抗氧化能力的鼠李糖乳桿菌，用于制備抑制幽門螺桿菌、大腸桿菌或其他致病菌的食品或藥品。但鮮有針對(duì)空腸彎曲桿菌的乳酸菌和益生菌的報(bào)道。目前針對(duì)空腸彎曲桿菌的專利中多集中于空腸彎曲桿菌的培養(yǎng)、檢測(cè)等方面，例如CN1011825688公開一種空腸彎曲桿菌的檢測(cè)方法；CN1013922^涉及空腸彎曲桿菌的微需氧分離培養(yǎng)方法。因此，篩選出一種具有抑制空腸彎曲桿菌功能的乳酸菌，并且證明在體外具有良好的抗空腸彎曲桿菌的效果，同時(shí)研制這些乳酸菌的實(shí)際用途就顯得十分必要。為此，本發(fā)明人在總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究，終于完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的是提供一種植物乳桿菌(LactcAacillus plantarum) CCFM8724。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述植物乳桿菌CCFM8724的用途。[技術(shù)方案]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8724，該菌株已于 2011年11月四日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCC No. M92。所述的植物乳桿菌CCFM87M具有下述性質(zhì)(1)體外抑制空腸彎曲桿菌生長(zhǎng)；(2)具有耐酸性，在pH2. 0時(shí)存活良好；(3)具有耐膽鹽能力，能耐受的膽鹽水平達(dá)0. 3% ；(4)對(duì)腸道上皮細(xì)胞具有較好的粘附能力；(5)體外抑制空腸彎曲桿菌粘附腸道上皮細(xì)胞；(6)抑制空腸彎曲桿菌在雞肉中的生長(zhǎng)。本發(fā)明涉及所述的植物乳桿菌CCFM87M在制備抑制空腸彎曲桿菌的藥物組合物或發(fā)酵食品中的用途。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的藥物組合物是由植物乳桿菌CCFM8724 菌劑與在藥學(xué)上可接受的載體組成的。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的植物乳桿菌CCFM87M菌劑是將含有所述植物乳桿菌CCFM8724的菌液通過常規(guī)冷凍干燥工藝或其它類似工藝制備所得到的粉齊U，它含有106CFU/g以上的活性植物乳桿菌CCFM8724。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的藥物組合物是顆粒劑、膠囊劑、片劑、 丸劑或口服液劑型。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的發(fā)酵食品是使用含有植物乳桿菌 CCFM8724的發(fā)酵劑生產(chǎn)的乳制品、豆制品與果蔬制品。
根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的發(fā)酵劑是采用下述方法制備得到的制備具有下述組成的培養(yǎng)基以該培養(yǎng)基總重量計(jì)10%酶水解脫脂乳、0. 5%葡萄糖、1. 5%胰蛋白胨、0. 3%酵母浸膏和余量水，所制備培養(yǎng)基的pH是6. 8。制備具有下述組成的保護(hù)劑100g/L脫脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麥芽糊精、 150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸鈉和余量水。植物乳桿菌CCFM87M菌種按照以所述培養(yǎng)基的重量計(jì)2_4%接種量接種到在溫度110-120°C下滅菌8-12min的所述的培養(yǎng)基中，然后在溫度37°C下培養(yǎng)18h，用pH 7. 2磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用所述的保護(hù)劑重懸使植物乳桿菌CCFM87M濃度達(dá)到109CFU/ml ； 接著，讓該懸浮液在溫度37°C下預(yù)培養(yǎng)60min，再采用冷凍干燥方法制成所述的發(fā)酵劑。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的發(fā)酵劑含有109CFU/g以上活性植物乳桿菌 CCFM87M。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的發(fā)酵乳制品是酸牛奶、酸奶油或干酪； 所述的發(fā)酵豆制品是酸豆乳、豆豉、豆醬或醬油；所述的發(fā)酵果蔬制品是發(fā)酵的黃瓜、胡蘿
卜、甜菜、芹菜或圓白菜制品。下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8724，該菌株已于 2011年11月四日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCC No. M92。下面將詳細(xì)地描述所述植物乳桿菌CCFM8724的篩選方法與它具有的性質(zhì)。首先，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選乳酸菌。原始樣品取自于內(nèi)蒙、新疆等地牧民自制的發(fā)酵奶酒。將5ml發(fā)酵奶酒注入帶玻璃珠的45ml滅菌生理鹽水中，振蕩30min，然后用滅菌生理鹽水將其奶酒稀釋至不同的濃度。采用本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的涂布平板法，將這些稀釋菌液涂布在添加了酸堿指示劑溴甲酚紫的MRS培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)平板上，分別在溫度37°C 下進(jìn)行普通培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)48h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，挑取能使培養(yǎng)基中溴甲酚紫變黃的典型單菌落，并對(duì)單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，挑取革蘭氏陽(yáng)性菌作為初步目的菌株，然后轉(zhuǎn)接至 MRS平板劃線分離純化，直至得到純?nèi)樗峋?，作為?shí)驗(yàn)菌株并在溫度4°C下保存。用接種環(huán)在平板上刮一環(huán)新鮮培養(yǎng)的菌苔，均勻涂抹在載玻片上，往其上滴加一滴3% H2O2溶液， 觀察是否有氣泡產(chǎn)生。若無(wú)氣泡產(chǎn)生則表明該菌株不產(chǎn)過氧化氫酶，為接觸酶陰性菌。然后，采用牛津杯法篩選具有抑制空腸彎曲桿菌生長(zhǎng)功能的乳酸菌。將上述步驟獲得的純?nèi)樗峋凑找訫RS液體培養(yǎng)基體積計(jì)2%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于溫度37°C下培養(yǎng)18-20h，按照同樣的方式連續(xù)培養(yǎng)三代，然后將乳酸菌菌懸液在8000r/min與溫度4°C的條件下離心20min，吸取上清液，使用0. 22 μ m濾膜進(jìn)行過濾去除菌體，得到一種乳酸菌發(fā)酵上清液?？漳c彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)NCTCl 1168菌株(購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC)在哥倫比亞血瓊脂平板(Oxoid公司培養(yǎng)基)上在溫度37°C與以體積計(jì)5% 02、10%0)2和85(%隊(duì)的環(huán)境下培養(yǎng)4811，按照同樣的方式傳代培養(yǎng)三代后，往其平板中加入腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(Oxoid公司培養(yǎng)基)，用無(wú)菌涂布棒刮下表面的細(xì)菌，在5000r/min條件下離心20min，使用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH = 7. 2)洗滌后，調(diào)整該菌濃度至108CFU/mL。然后，吸取250μ 1空腸彎曲桿菌菌液，均勻涂布于CCDA平板培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)上，待菌液自然干后，在平板上放置牛津杯，然后向牛津杯中加入100μ 1 上述的乳酸菌發(fā)酵上清液，以PH = 3. 8MRS作為對(duì)照，在溫度4°C下擴(kuò)散2小時(shí)，再放入培養(yǎng)箱中在溫度37°C與以體積計(jì)5% 02U0% CO2和85% N2的環(huán)境下培養(yǎng)48h，接著采用常規(guī)方法測(cè)量抑菌圈的直徑，從中篩選得到一株能有效抑制空腸彎曲桿菌生長(zhǎng)的乳酸菌，即乳酸菌CCFM8724，其測(cè)量結(jié)果列于下表1中。表1 抑菌圈直徑的測(cè)量結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8724，該菌株已于 2011 年 11 月 29日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCC No. M92。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌CCFM8724，其特征在于它具有下述性質(zhì)(1)體外抑制空腸彎曲桿菌的生長(zhǎng)；(2)具有耐酸性，在pH2.0時(shí)存活良好；(3)具有耐膽鹽能力，能耐受的膽鹽水平達(dá)0.3%；(4)對(duì)腸道上皮細(xì)胞具有較好的粘附能力；(5)體外抑制空腸彎曲桿菌粘附腸道上皮細(xì)胞；(6)抑制空腸彎曲桿菌在雞肉中的生長(zhǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌CCFM87M在制備抑制空腸彎曲桿菌的藥物組合物或發(fā)酵食品中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的藥物組合物是由植物乳桿菌 CCFM8724菌劑與在藥學(xué)上可接受的載體組成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述的植物乳桿菌CCFM87M菌劑是將含有所述植物乳桿菌CCFM8724的菌液通過常規(guī)冷凍干燥工藝或其它類似工藝制備所得到的粉齊U，它含有106CFU/g以上的活性植物乳桿菌CCFM8724。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的用途，其特征在于所述的藥物組合物是顆粒劑、膠囊劑、 片劑、丸劑或口服液劑型。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的發(fā)酵食品是使用含有植物乳桿菌 CCFM8724的發(fā)酵劑生產(chǎn)的乳制品、豆制品與果蔬制品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的發(fā)酵劑是采用下述方法制備得到的制備具有下述組成的培養(yǎng)基以該培養(yǎng)基總重量計(jì)10%酶水解脫脂乳、0.5%葡萄糖、1. 5%胰蛋白胨、0. 3%酵母浸膏和余量水，所制備培養(yǎng)基的pH是6. 8 ；制備具有下述組成的保護(hù)劑100g/L脫脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麥芽糊精、150g/L 海藻糖、10g/L L-谷氨酸鈉和余量水。將植物乳桿菌CCFM87M菌種按照以所述培養(yǎng)基重量計(jì)2-4%接種量接種于在溫度 110-120°C下滅菌8-12min的所述的培養(yǎng)基中，然后在溫度37°C下培養(yǎng)18h，用pH 7. 2磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用所述的保護(hù)劑重懸使植物乳桿菌CCFM87M濃度達(dá)到109CFU/ml ；接著，讓該懸浮液在溫度37°C下預(yù)培養(yǎng)60min，再采用冷凍干燥方法制成所述的發(fā)酵劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的用途，其特征在于所述的發(fā)酵劑含有109CFU/g以上活性植物乳桿菌CCFM8724。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的發(fā)酵乳制品是酸牛奶、酸奶油或干酪；所述的發(fā)酵豆制品是酸豆乳、豆豉、豆醬或醬油；所述的發(fā)酵果蔬制品是發(fā)酵的黃瓜、 胡蘿卜、甜菜、芹菜或圓白菜制品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8724及其用途。該植物乳桿菌CCFM8724具有體外抑制空腸彎曲桿菌生長(zhǎng)的能力，耐酸性與耐膽鹽性能良好，對(duì)腸道上皮細(xì)胞具有良好的粘附能力，能抑制空腸彎曲桿菌粘附于腸道上皮細(xì)胞，抑制空腸彎曲桿菌在雞肉中生長(zhǎng)。所述植物乳桿菌CCFM8724可以用于制備抑制空腸彎曲桿菌的藥物組合物，可以使用含有植物乳桿菌CCFM8724菌種的發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵乳制品、發(fā)酵豆制品、發(fā)酵果蔬制品以及青貯飼料，該發(fā)酵劑賦予這些產(chǎn)品具有一定的酸度和特定的香味，同時(shí)延長(zhǎng)了產(chǎn)品保藏時(shí)間，改善了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和消化性以及產(chǎn)品的安全性。
文檔編號(hào)A23L1/20GK102533618SQ201210046430
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者宋元達(dá), 張灝, 張秋香, 王剛, 田豐偉, 趙建新, 趙煜, 郭敏, 陳衛(wèi) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)