一株植物乳桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領域，具體涉及一株植物乳桿菌及其在紫薯發(fā)酵品制備以及胞 外多糖提取中的應用。
【背景技術】
[0002] 隨著健康食品行業(yè)的迅速發(fā)展，消費者對食品的品質(zhì)以及保健功效的逐漸重視， 紫薯、黑米等原料在食品中的應用也越來越多。紫薯不僅富含具有較強生理活性的花青素 類化合物及酚類化合物，還含有可溶性糖、蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸等物質(zhì)，營養(yǎng)價值很高。
[0003] 紫薯發(fā)酵酸奶是以紫薯為原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而制得一種具有營養(yǎng)保健功能的食 品。由于使用紫薯為主要原料，紫薯發(fā)酵酸奶中的脂肪、膽固醇相對于同類產(chǎn)品含量明顯下 降，而低級脂肪酸和必需脂肪酸含量增加，更易于人體消化吸收。同時，紫薯發(fā)酵酸奶中富 含植物多酚，可有效促進人體腸道中有益菌的增殖，抑制有害菌的生長，通過調(diào)節(jié)腸道微生 態(tài)平衡維護人體健康。此外，紫薯發(fā)酵酸奶中的生物活性成分經(jīng)乳酸菌發(fā)酵之后，具有更強 的生理功能，生物利用率得以提升，營養(yǎng)效果更趨完善。
[0004] 在乳制品的制備過程中，乳脂肪對于形成乳制品特有的質(zhì)構、風味和口感有重要 作用。采用紫薯等天然物質(zhì)發(fā)酵制備的低脂酸奶由于脂肪含量較低，常常出現(xiàn)粘稠度低、組 織狀態(tài)粗糙、乳清析出、口感差等不良現(xiàn)象。同時，在一般的乳制品的制備過程中，為了降低 脂肪含量，往往采用單純減少配料中的乳脂含量的方法，這樣反而會降低產(chǎn)品的可接受性。
[0005] 乳酸菌胞外多糖（EPS)是指乳酸菌在其生長、代謝過程中分泌到胞外的莢膜多糖 或粘液，其成分和結構復雜，可以作為增稠劑、穩(wěn)定劑、持水劑等應用于食品、制藥等諸多領 域。在乳制品中，胞外多糖生產(chǎn)菌及其所產(chǎn)生的胞外多糖具有粘性和穩(wěn)定性，可以有效地改 善發(fā)酵乳的流變學特性和質(zhì)構特性，避免乳清析出，也可以改善潤滑感和風味。同時，高產(chǎn) 胞外多糖乳酸菌也能夠有效地結合酸奶中多余的水分，提高酸奶的粘度，并且降低機械加 工過程對酸奶產(chǎn)品的質(zhì)構損傷，減少產(chǎn)品的脫水收縮缺陷。
[0006] 此外，高產(chǎn)胞外多糖菌株所產(chǎn)的胞外多糖還具有良好的生理功能，乳增強腸黏膜 吸附能力，調(diào)節(jié)免疫力、降低膽固醇和血壓等。因此，開展高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選工作， 對于改善乳制品的生產(chǎn)加工、開發(fā)特色的酸奶制品，具有非常重要的經(jīng)濟效益和社會效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中缺之尚廣胞外多糖的乳酸菌的不足，提供一株能夠尚廣胞 外多糖的植物乳桿菌及其應用。本發(fā)明的植物乳桿菌的第一應用是將其在適宜條件下制備 紫薯發(fā)酵產(chǎn)品，發(fā)酵后得到的產(chǎn)品酸度柔和，風味飽滿，質(zhì)構良好；本發(fā)明的第二個應用是 將其作為提取胞外多糖的原料，從植物乳桿菌的發(fā)酵液中提取胞外多糖。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：
[0009] 本發(fā)明提供了一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)AR_307菌株，已保藏 于中國普通微生物保藏中心，保藏編號為CGMCC NO. 10773。
[0010] 進一步的，本發(fā)明提供了植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)AR_307菌株 的篩選方法，具有這樣的特征，包括以下步驟：步驟1，將腌制泡菜碾碎，加入一定量的無菌 水，劇烈震蕩一段時間，采用濃度梯度稀釋法稀釋泡菜液，取稀釋液IOOuL涂布于MRS培養(yǎng) 基平板上，32~37°C厭氧培養(yǎng)48h，而后進行劃線分離純化，得到分離菌株；步驟2,將步驟 1中的挑絲粘度大的分離菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基中，32~37°C靜置培養(yǎng)16~24h，制 備成種子液；步驟3,將步驟2中的種子液按照一定的接種量接入滅好菌的MRS液體培養(yǎng)基 中，32~37°C靜置培養(yǎng)24~48h，測定發(fā)酵液中胞外多糖含量，篩選出含量最高的菌株，得 到AR-307菌株。
[0011] 進一步的，本發(fā)明還提供了一種植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)AR_307 菌株作為紫薯牛乳發(fā)酵產(chǎn)品發(fā)酵劑的用途。
[0012] 采用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)AR_307菌株作為發(fā)酵劑進行紫薯 發(fā)酵產(chǎn)品的制備的方法，包括以下步驟：步驟1，將植物乳桿菌AR-307菌株進行活化，得到 活化菌種；步驟2,將活化菌種以質(zhì)量體積比為3-5%的接種量接種于含紫薯粉和低脂牛乳 或無菌水混合液的容器中，32~37°C靜置發(fā)酵至凝乳，冷卻后放入3~6°C冰箱進行后熟 15-20h，得到紫薯發(fā)酵產(chǎn)品。
[0013] 其中，紫薯發(fā)酵產(chǎn)品為紫薯酸奶或紫薯醬。步驟1中所述的活化的方法是：將保藏 于MRS培養(yǎng)基中的植物乳桿菌AR-307按質(zhì)量比為3~5%的接種量接入滅菌MRS培養(yǎng)基 中，32 °C靜置培養(yǎng)16~24h進行培養(yǎng)。
[0014] 進一步的，本發(fā)明還提供了一種植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)AR-307 菌株作為提取胞外多糖的原料的用途。采用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum) AR-307菌株作為原料，從中提取胞外多糖的方法包括以下步驟：步驟1，制備植物乳桿菌 AR-307菌株發(fā)酵液；步驟2,將發(fā)酵液煮沸后離心去除菌體以及凝結蛋白，得到上清液；步 驟3,分別采用三氯乙酸法除去上清液中沉淀蛋白以及醇沉淀法沉淀上清液，得到上清液沉 淀；步驟4,將上清液沉淀溶解于水后再用水透析，得到所述胞外多糖。
[0015] 其中，在步驟1中，制備植物乳桿菌AR-307菌株發(fā)酵液的方法包括以下子步驟；子 步驟1-1，菌種活化：將植物乳桿菌AR-307菌種接種于MRS固體培養(yǎng)基中，在32~37°C條 件下培養(yǎng)16~24h進行活化，連續(xù)活化兩代，得到活化菌種；子步驟1-2,將子步驟1-1中的 活化菌種以質(zhì)量體積比為3~5%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在32~37°C條件下 培養(yǎng)14~18h，用作母發(fā)酵液；子步驟1-3,將子步驟1-2中的母發(fā)酵液以體積比為5 %的接 種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在32~37°C條件下培養(yǎng)16~24h，得到植物乳桿菌AR-307 菌株發(fā)酵液。在步驟3中，三氯乙酸法是在上清液中添加三氯乙酸至質(zhì)量濃度為4%，靜置 12~24h，而后4°C、9000g、離心15~30min除去沉淀蛋白；所述醇沉淀法是向三氯乙酸法 得到的上清液中加乙醇至乙醇體積百分比為75%，4°C靜置20~28h，而后4°C、9000g、離心 15~30min取沉淀。
[0016] 發(fā)明作用與效果
[0017] 本發(fā)明篩選出的植物乳桿菌AR-307在發(fā)酵低脂酸奶過程中產(chǎn)酸較為緩慢。一方 面，使得酸奶產(chǎn)品酸度柔和，風味飽滿；另一方面，使得發(fā)酵所得的低脂酸奶粘稠，避免了人 工乳脂的添加。
[0018] 另外，本發(fā)明所提供植物乳桿菌AR-307菌株產(chǎn)生胞外多糖的能力顯著，不僅能夠 顯著改善酸奶的組織狀態(tài)等質(zhì)構特性，減少乳清析出，而且使的產(chǎn)品無需添加穩(wěn)定劑就能 夠滿足消費者對無添加低脂酸奶的需求。
[0019] 第三，本發(fā)明提供的高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌株及其低脂酸奶發(fā)酵過程簡單，有利于 大規(guī)模工業(yè)化應用的實現(xiàn)。
【附圖說明】
[0020] 圖1是本發(fā)明的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)AR_307菌株的菌體拉絲 圖；
[0021] 圖2是本發(fā)明的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)AR_307菌株的生長曲線 圖。
【具體實施方式】
[0022] 以下結合附圖來說明本發(fā)明的【具體實施方式】。對于實施例中所用到的具體方法或 材料，本領域技術人員可以在本發(fā)明技術思路的基礎上，根據(jù)已有的技術進行常規(guī)的替換 選擇，而不僅限于本發(fā)明實施例的具體記載。
[0023] 實施實例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑 等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0024] 實施例中所用到的培養(yǎng)基的制備方法如下：
[0025] MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物5g/L，K2HP042g/L，檸檬 酸二銨 2g/L，乙酸鈉 5g/L，葡萄糖 20g/L，吐溫 801mL，MgSO4 · 7H20 0· 58g/L，MnSO4 · 4H20 0· 25g/L，瓊脂 20g/L，調(diào)節(jié) pH 至 6· 4。
[0026] 脫脂牛乳培養(yǎng)基：脫脂乳粉100g/L，115°C滅菌15min。
[0027] 實施例一、植物乳桿菌AR-307菌株的篩選與鑒定
[0028] 1.樣品稀釋液制備及菌株分離
[0029] 從腌制泡菜中分離提取植物乳桿菌AR-307菌株。首先將腌制泡菜碾碎，加入15mL 無菌水，劇烈震蕩20min ;然后采用濃度梯度稀釋法，取稀釋液IOOuL涂布于MRS瓊脂培養(yǎng) 基平板上，32~37°C厭氧培養(yǎng)48h，挑選菌落大、生長快、挑絲粘度大的菌株，進一步劃線分 離純化。
[0030] 2菌株篩選
[0031] 將I. 1中挑絲粘度大的菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基中，32~37°C靜置培養(yǎng)16~ 24h，制備成種子液；然后按照體積分數(shù)為3~5%的接種量接入滅好菌的MRS液體培養(yǎng)基 中，32~37°C靜置培養(yǎng)24~48h，測定發(fā)酵液中胞外多糖含量，實驗結果如表1所示。
[0032]
[0033] 如表1所示，AR-307菌株產(chǎn)胞外多糖的能力最強。
[0034] 3菌株鑒定
[0035] AR-307菌株的菌落形狀如圖1所示：呈橢圓形或類圓形，邊緣整齊，菌落大小一般 為2~3_，乳白色。
[0036] 通過16SrDNA序列對比分析，結果顯示該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中植物乳桿菌的同源 性達99%，可以鑒定該菌為植物乳桿菌。該植物乳桿菌AR-307菌株已于2015年4月29 日保藏于中國普通微生物保藏中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），其編號為 CGMCC10773。
[0037] 4菌株生長特性
[0038] 將活化好的植物乳桿菌AR