專利名稱：一種空腸彎曲菌的高靈敏快速檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種空腸彎曲菌的高靈敏快速檢測試劑盒，特別是涉及了一種應(yīng)用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)在DNA分子水平上高靈敏特異性檢測食源性病原菌空腸彎曲菌的方法。
背景技術(shù)：
空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)是能夠引起人類急性腹瀉和腸胃炎的主要食源性病原菌，具有很強的致病性，人類飲用受污染的水、鮮奶、畜禽肉等都有可能感染該菌致病。加強對空腸彎曲菌的篩查和檢測，是有效防控空腸彎曲菌污染、傳播及致病的根本措施，而監(jiān)測和防控食品和環(huán)境中空腸彎曲菌的關(guān)鍵是建立高靈敏、快速、簡便易行的檢測體系。目前，包括我國在內(nèi)的許多國家對食源性致病菌檢測和鑒定仍主要沿用傳統(tǒng)的檢測方法(分離培養(yǎng)、生化鑒定等)，而傳統(tǒng)的檢測方法很難有效地對空腸彎曲菌這類難培養(yǎng)、易形成不可培養(yǎng)的休眠狀態(tài)的致病菌進行靈敏檢測，而且傳統(tǒng)的檢測方法特異性不高、 靈敏度低、操作繁瑣耗時，不能實現(xiàn)及時準確的監(jiān)測。將現(xiàn)代分子生物學技術(shù)應(yīng)用于食源性致病菌檢測，是發(fā)展新的快速、準確、低成本檢測和鑒定食源性致病菌方法的最有效途徑。以核酸為基礎(chǔ)的分子檢測方法以其特異性高、檢測結(jié)果穩(wěn)定以及省時省力的特點，在食源性致病菌檢測中具有比傳統(tǒng)方法更多的優(yōu)越性，因而也得到了更廣泛的研究。目前就分子水平檢測空腸彎曲菌，國內(nèi)外報道最多的是應(yīng)用PCR技術(shù)的檢測，已經(jīng)研究出多重PCR、巢式PCR、熒光定量PCR等多種檢測方法。但 PCR采用加熱變性雙鏈DNA來促使下輪DNA的合成，其基本原理和對于溫度循環(huán)的高要求使得PCR的應(yīng)用受到了限制，不僅需要精密的儀器設(shè)備，而且會有非目標DNA序列的擴增，出現(xiàn)假陽性。如何克服PCR技術(shù)的不足，在DNA分子水平上快速、準確、靈敏地對空腸彎曲菌進行檢測，是食品衛(wèi)生檢測的需要和發(fā)展趨勢。此外，如何在疫病現(xiàn)場利用匱乏的檢測條件進行快速檢測也是一個刻不容緩的問題。本發(fā)明通過環(huán)介導等溫擴增檢測食源性病原菌空腸彎曲菌，由此建立一種空腸彎曲菌的高靈敏快速檢測試劑盒及其檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一套空腸彎曲菌高靈敏快速檢測試劑盒，包括(1)針對特異性靶基因flhA(GeneBank基因登錄號905174)設(shè)計并篩選出用于環(huán)介導等溫擴增的四條高特異性引物，其序列分別為flhA-FIP 5' -ACCCTTGTACTACCTTTTGTTACAA-GTGGAAATATGGTCA-3'flhA-BIP 5' -ACAAGCAAGATTTACACTTGATGC-GTCCTGCATTTAAATCCG-3'flhA-F35' -GCATTTGGAGAATTTGTTGTTG-3‘flhA-B35' -TTGACGTCTTGCTCTAGC-3'。
(2)有效的環(huán)介導等溫擴增反應(yīng)體系，其中內(nèi)引物和外引物的濃度比是關(guān)鍵。本發(fā)明建立的25ulLAMP反應(yīng)體系中，內(nèi)引物(flhA-FIP，flhA-BIP)與外引物(flhA_F3， flhA-B3)濃度比為8:1。LAMP反應(yīng)體系(總體積25uL)2. 5uL IOXThermopol reaction buffer (含Mg2+)，IuL Target DNA, 2uL IOumol/ L flhA-FIP,2uL10umol/L flhA-BIP,0. 5uL 5umol/L flhA_F3，0. 5uL 5umol/L flhA-B3, 4uL 10mmol/l dNTPs,IuL 8UBstDNA polymerase large fragment,11. 5uL ddH20o本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用所述試劑盒檢測空腸彎曲菌的方法，其中反應(yīng)溫度是影響環(huán)介導等溫擴增效果的重要反應(yīng)條件，通過比較6個溫度梯度 (60，61，62，63，64，65°C )水浴中環(huán)介導等溫擴增結(jié)果，最終以63°C水浴為最佳溫度條件。 應(yīng)用所述試劑盒檢測空腸彎曲菌步驟如下(1)提取細菌基因組DNA。(2)混合LAMP反應(yīng)體系在無菌的微量離心管中加入2. 5uL IOXbuffer、 2uL10 umol/LflhA-FIP、2uL 10 umol/L flhA-BIP,0. 5uL5umol/L flhA_F3、0. 5uL5umol/ L flhA-B3、4uL10mmol/LdNTPs、IuLDNA 模板、11.5uL 的 ddH20，該步暫不加 BstDNA polymerase large fragment。(3)加熱變性將上述混合體系置95°C水浴5分鐘，迅速插入冰中30秒。⑷在混合體系中力口入 luL8 U BstDNA polymerase large fragment (New England Biolabs)，完全混合。5) LAMP擴增將反應(yīng)混合物置63°C水浴中60分鐘，然后80°C水浴放置20分鐘終止LAMP反應(yīng)。6)電泳分析LAMP擴增結(jié)果取4uL擴增反應(yīng)混合物，用2. 0%瓊脂糖凝膠電泳 (GoldView染色)分析，紫外光下觀察擴增結(jié)果。本發(fā)明提供了一種可用于食源性病原菌空腸彎曲菌的高靈敏快速分子檢測試劑盒，其中包括針對特異性檢測靶基因flhA的、可用于環(huán)介導等溫擴增靶序列的4條高特異性引物O條內(nèi)引物和2條外引物)，以及可進行高效環(huán)介導等溫擴增靶基因的反應(yīng)體系。 同時，本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用所述試劑盒檢測空腸彎曲菌的方法步驟。


圖1高特異性引物的篩選1、3道為陰性對照，2道為ID-8號引物LAMP擴增結(jié)果，4道為ID-90號引物LAMP 擴增結(jié)果，M道為DNA Marker。圖2靈敏度分析(A) PCR檢測空腸彎曲菌靈敏度1-9道空腸彎曲桿菌ATCC33291模板DNA量分別是83ng/uL、8. 3ng/uL、 8. 3xlO_1ng/uL>8. 3xl(T2ng/uL、8. 3xl(T3ng/uL、8. 3xl(T4ng/uL、8. 3xl(T5ng/uL、8. 3xl(T6ng/ uL、8. 3xl(T7ng/uL，10 道為陰性對照，M 道為 DNAMarker。(B) LAMP檢測空腸彎曲菌靈敏度1-9道空腸彎曲桿菌ATCC33291模板DNA量分別是83ng/uL、8. 3ng/uL、8. 3xlO_1ng/uL>8. 3xl(T2ng/uL、8. 3xl(T3ng/uL、8. 3xl(T4ng/uL、8. 3xl(T5ng/uL、8. 3xl(T6ng/ uL、8. 3xl(T7ng/uL，10 道為陰性對照，M 道為 DNAMarker。圖3LAMP法檢測空腸彎曲菌的特異性分析1道為空腸彎曲菌ATCC33^1，2道為大腸桿菌，3道為阪崎桿菌ATCCBAA-894，4道為單增李斯特菌，5道為金黃色葡萄球菌ATCC25923，6道為陰性對照，M道為DNA Marker。具體實施方法實施例1 用于檢測空腸彎曲菌的環(huán)介導等溫擴增高特異性引物的設(shè)計和篩選(1)從NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心)上獲取空腸彎曲菌NCTC11168鞭毛合成相關(guān)基因flhA的核苷酸序列(GeneBank基因登錄號為905174)；(2)針對flhA的核苷酸序列，應(yīng)用I^rimerExploerVA軟件設(shè)計LAMP擴增內(nèi)引物和外引物，通過生物信息學分析，初步篩選到2套引物，編號ID-8和ID-90 ID-8 號引物
權(quán)利要求
1.一種空腸彎曲菌的高靈敏快速檢測試劑盒，其特征在于包括檢測靶點為空腸彎曲菌高度保守的鞭毛合成相關(guān)基因flhA，其核苷酸序列GeneBank基因登錄號為905174 ；四條可環(huán)介導等溫擴增靶序列的特異性引物、2條內(nèi)引物flhA-FIP、flhA-BIP和2條外引物 flhA-F3、flhA-B3，引物序列如下flhA-FIP 5‘ -ACCCTTGTACTACCTTTTGTTACAA-GTGGAAATATGGTCA-3‘flhA-BIP 5' -ACAAGCAAGATTTACACTTGATGC-GTCCTGCATTTAAATCCG-3'flhA-F35‘ -GCATTTGGAGAATTTGTTGTTG-3‘flhA-B35‘ -TTGACGTCTTGCTCTAGC-3‘。
2.應(yīng)用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測空腸彎曲菌的方法為(1)提取細菌基因組DNA;(2)混合環(huán)介導等溫擴增反應(yīng)體系在無菌的微量離心管中加入2.5uL 10Xbuffer, 2uL 10umol/L flhA-FIP,2uL lOumol/L flhA-BIP,0. 5uL5umol/L flhA_F3、0. 5uL5umol/L flhA-B3、4uL10mmol/LdNTPs、IuLDNA 模板、11. 5uL 的 ddH20 ；(3)加熱變性將上述混合體系置95°C水浴5min，迅速插入冰中30秒；(4)在混合體系中加入luL8UBstDNA polymerase large fragment，完全混合。(5)環(huán)介導等溫擴增將反應(yīng)混合物置63°C水浴中60分鐘，然后80°C水浴放置20分鐘終止環(huán)介導等溫擴增反應(yīng)。(6)電泳分析環(huán)介導等溫擴增結(jié)果取4uL擴增反應(yīng)混合物，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外光下觀察電泳結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述環(huán)介導等溫擴增反應(yīng)體系為 10X buffer(含 Mg2+ )2.5 uLTarget DNA1 uL10umol/L /M-FIP2uLlOumol/L /M-BIP2uL5umol/L /M-F30.5uL5umol/L flhA-m0.5uLlOmmol/L dNTPs4uL8UBstDNA polymerase large fragment IuL ddH2011.5uL。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可用于食源性病原菌空腸彎曲菌的高靈敏快速分子檢測試劑盒，其中包括針對特異性檢測靶基因flhA的、可用于環(huán)介導等溫擴增靶序列的4條高特異性引物(2條內(nèi)引物flhA-FIP/flhA-BIP和2條外引物flhA-F3/flhA-B3)，以及可進行環(huán)介導等溫擴增靶序列的高效反應(yīng)體系。同時，本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用所述試劑盒檢測空腸彎曲菌的方法。運用本發(fā)明試劑盒和方法檢測空腸彎曲菌，比PCR檢測靈敏度高100倍以上，且對空腸彎曲菌檢測具有高度的特異性。本發(fā)明提供的試劑盒和檢測方法，不僅靈敏度高特異性強，而且操作簡便、耗時短、成本低，為食品中空腸彎曲桿菌的檢測提供了一種高效可靠、便捷實用的手段。
文檔編號C12Q1/68GK102534038SQ20121004596
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者史鋒, 徐洋, 李燁, 王小元 申請人:江南大學