專利名稱：Fgf8/shh組合法提高表皮干細(xì)胞牙向分化效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞牙向分化的方法，具體涉及采用FGF8/ SHH (fibroblast growth factor 8/ Sonic hedgehog)雙生長因子組合法提高動物上皮組織來源的表皮干細(xì)胞向成牙釉質(zhì)細(xì)胞分化的效率的方法。
背景技術(shù)：
牙齒不僅能夠咀嚼食物、幫助發(fā)音，而且對面容有很大影響。然而人類遺傳性的牙齒缺陷卻是一種比較普遍的現(xiàn)象，同時，隨著年齡的增長，幾乎所有人都有不同程度的牙齒缺陷甚至缺失。牙齒特別是釉質(zhì)部分，一旦缺失自身將無法完成修復(fù)和再生。因此，人類牙齒的再生是一項極具應(yīng)用前景、社會效益和市場價值的研究工作。根據(jù)牙齒發(fā)育的特性，利用成體干細(xì)胞進行牙齒器官再生同樣需要上皮源性的干細(xì)胞和間充質(zhì)源性的干細(xì)胞的同時參與。已有研究工作表明，具有誘導(dǎo)成牙潛能的小鼠 Ell. 5 (E12之前)的牙胚上皮與間充質(zhì)來源的成體干細(xì)胞，如骨髓干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞等重組構(gòu)建嵌合體，嵌合體能夠發(fā)育為具有類似牙齒的結(jié)構(gòu)，證明利用間充質(zhì)來源的成體干細(xì)胞誘導(dǎo)成牙已經(jīng)在理論上得到解決。但是，由于上皮來源的牙釉質(zhì)細(xì)胞在牙齒萌發(fā)過程中已經(jīng)凋亡，已經(jīng)不可能從成體牙齒獲得相應(yīng)的上皮源性干細(xì)胞，所以必須從其它器官中尋找成體上皮源性干細(xì)胞。然而迄今為止，仍未找到一種合適的成體干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，誘導(dǎo)其向牙上皮分化并且形成牙釉質(zhì)細(xì)胞。因此，獲得上皮源性的成體干細(xì)胞并誘導(dǎo)其向成牙釉質(zhì)細(xì)胞分化是目前人類牙齒再生工程的瓶頸工作之一。表皮干細(xì)胞(keratinocyte stem cells, KSC)來源于皮膚表皮的基底層，屬于上皮源性的干細(xì)胞。目前已經(jīng)證實表皮干細(xì)胞具有多向分化的潛能，而且已經(jīng)在嚴(yán)重皮膚灼傷、慢性皮膚創(chuàng)傷和基因治療等臨床治療上得到有效地應(yīng)用。因此可以嘗試?yán)闷涑墒斓呐囵B(yǎng)和再生技術(shù)，為牙齒再生研究提供一種替代牙上皮的成體干細(xì)胞。本發(fā)明人前期以人表皮干細(xì)胞為材料，與具有誘導(dǎo)成牙潛能的小鼠E13. 5牙胚間充質(zhì)(E12之后)重組，在嵌合體中添加FGF8生長因子能夠誘導(dǎo)人表皮干細(xì)胞向成牙釉質(zhì)細(xì)胞分化，相關(guān)數(shù)據(jù)發(fā)表在Developmental Biology期刊(SCI收錄，影響因子4. 7。 Induction of human keratinocytes into enamel- secreting ameloblasts. Developmental Biology. 2010, 344:795-799.)，但是嵌合體形成牙齒結(jié)構(gòu)的效率(成牙率)約為觀％，其中表皮干細(xì)胞分化形成成釉質(zhì)細(xì)胞的效率(成釉率)約為31%，效率不高。。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種采用FGF8/SHH的雙生長因子組合法提高誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞牙向分化的成牙效率的方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案是 1、表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
①將皮膚組織放入含4%青霉素/鏈霉素的PBS中清洗兩次，然后在解剖鏡下剪去皮下脂肪結(jié)締組織；
②將剪去皮下脂肪結(jié)締組織的其余皮膚組織放入PBS清洗三次；
③將清洗好的皮膚組織放入培養(yǎng)皿中，用棉球沾取碘酒進行上下涂拭進行消毒處理， 然后立即放入70%乙醇去碘，再用PBS去乙醇；
④將消毒處理后的皮膚組織剪成2cmX0.5 cm條狀，表皮面朝上于4°C 2 U/mL Dispase II 消化 12 14 hr;
⑤在解剖鏡下用尖鑷分離經(jīng)消化的皮膚組織的表皮和真皮，取下表皮并放入PBS清
洗；
⑥將表皮放入0.25% Trypsin/0. 05% EDTA中，用彎剪將表皮剪碎，放置于37°C消化 10 15 min ；
⑦用37°C預(yù)熱的含20%FBS的DMEM中止消化，輕緩吹散表皮碎片；100目細(xì)胞篩過濾表皮碎片，余下細(xì)胞懸液放置于15 mL離心管；
⑧常溫下IOOg離心5min ；
⑨棄上清液，用KSFM輕緩重新懸浮沉淀的細(xì)胞，接種于6cm培養(yǎng)皿中，置于37°C 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為18 Mhr。⑩吸棄上清液，加入新鮮KFSM ；之后隔天半量換液，當(dāng)表皮干細(xì)胞密度為50%以上時每天換液，至80%時傳代。2、牙胚間充質(zhì)的分離
①取E13.5的小鼠胚胎，在解剖鏡下利用尖鑷取下胚胎頭部并分離下頌；
②將下頌放入2U/mL的Dispase液體中，37 °C消化8 min ；
③解剖鏡下，利用尖鑷分離磨牙區(qū)的牙胚上皮和間充質(zhì)組織；
④將6 8個牙間充質(zhì)組織放入裝有含10%FBS的DMEM的離心管中，2000rpm離心 5 min，放置于37 V 5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 hr，形成牙胚間充質(zhì)團。3、組合生長因子吸附體的制備
取10 μ L瓊脂糖微球清洗晾干后，放入含有120 150 Pg/mL FGF8和200 250 μδ/ mL SHH的20 μ L混合液中靜置30 min進行充分吸附，制成瓊脂糖微球生長因子吸附體。4、嵌合體重組
①將Trowell器官培養(yǎng)皿外層裝PBS緩沖液，里層裝含10%胎牛血清(FBS)的DMEM液體培養(yǎng)基；同時在里層依次放入支架網(wǎng)和0. 45 μ m的濾膜，里層的液體培養(yǎng)基剛好沒過濾膜；
②利用耳勺將上述步驟2分離的牙胚間充質(zhì)團挑出，放在準(zhǔn)備好的Trowell器官培養(yǎng)皿的濾膜上；
③將7 9個吸附生長因子的瓊脂糖微球放到牙胚間充質(zhì)團上；
④將密度為80% 90%的表皮干細(xì)胞刮下，覆蓋在濾膜上的附有瓊脂糖微球牙胚間充質(zhì)團上，即嵌合體構(gòu)建好，于37 V 5%C02培養(yǎng)箱孵育過夜。5、移植裸鼠腎囊膜
①將裸鼠麻醉后，剪開腎部位上方的皮膚和肌肉；
②用彎鑷取出腎，在解剖鏡下用尖鑷將腎囊膜剪開一個小口；
③將上述構(gòu)建好的嵌合體移植入腎囊膜內(nèi)；④將移植后的腎放回腹腔，縫合肌肉和皮膚；
⑤裸鼠繼續(xù)喂養(yǎng)20天。6、嵌合體的鑒定 (1)固定與切片
①固定將移植20天的嵌合體組織取下，放置于4°C的4%多聚甲醛固定12 Mhr ；
②脫鈣采用10%EDTA脫鈣到嵌合體組織軟化；
③脫水依次利用30%、50%、70%、90%和100%乙醇進行逐道進行脫水，每道1hr，然后 100%乙醇再重復(fù)一次；
④透明按無水乙醇二甲苯為1:1的比例配制透明液，透明處理30 min，然后放入二甲苯至組織透明為止；
⑤透蠟按二甲苯石蠟為1:1的比例配制透蠟液，透蠟處理30 min，然后放入3道石蠟中，每道1 hr。⑥包埋在解剖鏡下將組織放入裝滿石蠟的紙盒中，注意組織的前后左右方向。⑦切片在切片機進行連續(xù)切片，貼在載玻片上，在展片機上展片15 20min， 60°C烘干后放置_20°C備用。(2) HE 染色
①脫蠟將上述組織切片依次放入2道二甲苯，每道15min ；
②復(fù)水依次放入100%、90%、70%、50%、30%乙醇和雙蒸水，每道5min ；
③放入蘇木精染液進行染色8 15min,自來水沖洗2 min ；
④放入伊紅染液進行染色30s ；
⑤脫水依次放入70%、90%和100%乙醇，每道5min，然后100%乙醇重復(fù)一次；
⑥二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察嵌合體是否具有牙本質(zhì)、成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙釉質(zhì)或成牙釉質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)僅有牙本質(zhì)和成牙本質(zhì)細(xì)胞兩種結(jié)構(gòu)計為成牙；具有牙本質(zhì)、成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙釉質(zhì)和成牙釉質(zhì)細(xì)胞四種結(jié)構(gòu)計為成釉。最后統(tǒng)計成牙率與成釉率。本發(fā)明所述的器械均為滅菌過的器械，滅菌條件為121°C滅菌20min。本發(fā)明所述的細(xì)胞培養(yǎng)皿和器官培養(yǎng)皿均購自Corning公司。本發(fā)明所述的TE溶液成分為0. 25%胰蛋白酶和0. 05%EDTA。本發(fā)明所述的Dispase酶、生長因子TOF8和SHH均購于R & D公司。本發(fā)明所述的DMEM 和 KSFM ( Keratinocyte serum-free medium)培養(yǎng)基均購自 GIBCO公司。本發(fā)明所述的皮膚組織為小鼠或大鼠出生1天后的背部皮膚，或幼兒包皮環(huán)切后遺棄的包皮，幼兒年齡在5 12歲，無其它疾病感染，標(biāo)本得到患者家屬知情同意。所有標(biāo)本按照福建師范大學(xué)動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。本發(fā)明所述的小鼠、大鼠和裸鼠均購自上海斯萊克實驗動物有限公司，按照SPF 級條件飼養(yǎng)。采用本發(fā)明所述的FGF8/SHH雙生長因子組合法誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞的方法，成牙率和成釉率分別至少提高至48%和67%。這與僅添加FGF8單個生長因子誘導(dǎo)的對照組的成牙率和成釉率分別至少提高了 20%和35%。同時，F(xiàn)GF8/SHH雙生長因子組合法操作簡便，簡易普及。


圖1是本發(fā)明所述的FGF8/SHH雙生長因子組合法提高表皮干細(xì)胞牙向分化效率的方法流程示意圖。圖2是本發(fā)明所述的表皮干細(xì)胞不同培養(yǎng)階段生長形態(tài)圖。圖3是本發(fā)明所述的FGF8/SHH雙生長因子組合法誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞向成牙釉質(zhì)細(xì)胞分化嵌合體結(jié)構(gòu)圖。
具體實施例方式為了對本發(fā)明有進一步的理解，現(xiàn)結(jié)合附圖一實施例的方式對本發(fā)明進行闡述。圖2中，㈧為培養(yǎng)1天的細(xì)胞形態(tài)；⑶為培養(yǎng)3天的細(xì)胞形態(tài)；(C)為培養(yǎng)6 天的細(xì)胞形態(tài)；(D)為培養(yǎng)8天的細(xì)胞形態(tài)；(E)為培養(yǎng)11天的細(xì)胞形態(tài)；(F)為培養(yǎng)13 天的細(xì)胞形態(tài)。圖中標(biāo)尺均為100 μπι。圖3中，(Α，C)為添加FGF8/SHH組合生長因子的嵌合體形態(tài)觀察；(B)⑶ 分別為圖A和圖C的局部放大圖，示成牙且成牙釉質(zhì)細(xì)胞拉長，產(chǎn)生釉質(zhì)。成牙釉質(zhì)細(xì)胞(ameloblast，AM)、釉質(zhì)(enamel, EN)、牙本質(zhì)(dentin，DE)、成牙本質(zhì)細(xì)胞 (odontoblasts, 0d)、牙乳頭(dental pulp, DP)。圖 A，C 的標(biāo)尺為 50 μ m，圖 B，D 的標(biāo)尺為 20 μπι。箭頭指示成牙釉質(zhì)細(xì)胞拉長。實施例1
1、表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
①將出生1天的小鼠處死后，取背部皮膚組織放入含4%青霉素/鏈霉素的PBS中清洗兩次，然后在解剖鏡下剪去皮下脂肪組織；
②將其余皮膚組織放入PBS清洗三次；
③將清洗好的皮膚組織放入培養(yǎng)皿中，用棉球沾取碘酒進行上下涂拭，然后立即放入 70%乙醇去碘，再用PBS去乙醇；
④將消毒的皮膚組織剪成2cmXO. 5 cm條狀，表皮面朝上于4°C 2 U/mL Dispase II 消化12 hr ；
⑤在解剖鏡下用尖鑷分離經(jīng)消化的皮膚組織的表皮和真皮，取下表皮并放入PBS清
洗；
⑥將表皮放入0.25% Trypsin/0. 05% EDTA中，用彎剪將表皮剪碎，放置于37°C消化10
min ；
⑦用37°C預(yù)熱的含20%FBS的DMEM中止消化，輕緩吹散表皮碎片；100目細(xì)胞篩過濾表皮碎片，余下細(xì)胞懸液放置于15 mL離心管；
⑧常溫下IOOg離心5min ；
⑨棄上清，用KSFM輕緩重新懸浮沉淀的細(xì)胞，接種于6cm培養(yǎng)皿中，置于37°C 5%C02 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為18hr ；
⑩吸棄上清，加入新鮮KFSM；之后隔天半量換液，當(dāng)表皮干細(xì)胞密度為50%以上時每天換液，至80%時傳代。
6
2、牙胚間充質(zhì)的分離
①取E13.5的小鼠胚胎，在解剖鏡下利用尖鑷取下胚胎頭部并分離下頌；
②將下頌放入2U/mL的Dispase液體中，37 °C消化8 min ；
③解剖鏡下，利用尖鑷分離磨牙區(qū)的牙胚上皮和間充質(zhì)；
④將8個牙間充質(zhì)放入裝有含10%FBS的DMEM的離心管中，2000rpm離心5 min，放置于37 V 5% C02培養(yǎng)箱孵育1 hr，形成牙胚間充質(zhì)團。3、組合生長因子的添加
取10 μ L瓊脂糖微球清洗晾干后，放入生長因子FGF8 (120 Pg/mL)和SHH (200 μδ/ mL)的混合液中靜置30 min。4、嵌合體重組
①將Trowell器官培養(yǎng)皿外層裝PBS，里層裝含10%FBS的DMEM；同時在里層依次放入支架網(wǎng)和0. 45 μ m的濾膜，里層的液體剛好沒過濾膜；
②利用耳勺將上述步驟2分離的牙胚間充質(zhì)團挑出，放在準(zhǔn)備好的Trowell器官培養(yǎng)皿的濾膜上；
③將7個吸附生長因子的瓊脂糖微球放到牙胚間充質(zhì)團上；
④將密度為80% 90%的表皮干細(xì)胞刮下，覆蓋在濾膜上的附有瓊脂糖微球牙胚間充質(zhì)團上，即嵌合體構(gòu)建好，于37 V 5%C02培養(yǎng)箱孵育過夜。5、移植裸鼠腎囊膜
①將裸鼠麻醉后，剪開腎部位上方的皮膚和肌肉；
②用彎鑷取出腎，在解剖鏡下用尖鑷將腎囊膜剪開一個小口；
③將上述構(gòu)建好的嵌合體移植入腎囊膜內(nèi)；
④將移植后的腎放回腹腔，縫合肌肉和皮膚；
⑤裸鼠繼續(xù)喂養(yǎng)20天。6、嵌合體的鑒定 (1)固定與切片
①固定將移植20天的嵌合體組織取下，放置于4°C的4%多聚甲醛固定12hr ；
②脫鈣采用10%EDTA脫鈣到嵌合體組織軟化；
③脫水依次利用30%、50%、70%、90%和100%乙醇進行逐道進行脫水，每道1hr，然后 100%乙醇再重復(fù)一次；
④透明按無水乙醇二甲苯為1:1的比例配制透明液，透明處理30 min，然后放入二甲苯至組織透明為止；
⑤透蠟按二甲苯石蠟為1:1的比例配制透蠟液，透蠟處理30 min，然后放入3道石蠟中，每道1 hr ；
⑥包埋在解剖鏡下將組織放入裝滿石蠟的紙盒中，注意組織的前后左右方向；
⑦切片在切片機進行連續(xù)切片，貼在載玻片上，在展片機上展片15min，6(TC烘干后放置_20°C備用。(2) HE 染色
①脫蠟將上述組織切片依次放入2道二甲苯，每道15min ；
②復(fù)水依次放入100%、90%、70%、50%、30%乙醇和雙蒸水，每道5min ；③放入蘇木精染液進行染色8min,自來水沖洗2 min ；
④放入伊紅染液進行染色30s ；
⑤脫水依次放入70%、90%和100%乙醇，每道5min，然后100%乙醇重復(fù)一次；
⑥二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察嵌合體是否具有牙本質(zhì)、成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙釉質(zhì)或成牙釉質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)僅有牙本質(zhì)和成牙本質(zhì)細(xì)胞兩種結(jié)構(gòu)計為成牙；具有牙本質(zhì)、成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙釉質(zhì)和成牙釉質(zhì)細(xì)胞四種結(jié)構(gòu)計為成釉。最后統(tǒng)計成牙率與成釉率分別提高至5 和72%。與采用單一 FGF8生長因子能夠誘導(dǎo)人表皮干細(xì)胞向成牙釉質(zhì)細(xì)胞分化的方法所得數(shù)據(jù)(成牙率約為觀％，成釉率約為31%)相比，分別提高了 24%和41%。實施例2
1、表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
①將出生1天的大鼠處死后，取背部皮膚組織放入含4%青霉素/鏈霉素的PBS中清洗兩次，然后在解剖鏡下剪去皮下脂肪組織；
②將其余皮膚組織放入PBS清洗三次；
③將清洗好的皮膚組織放入培養(yǎng)皿中，用棉球沾取碘酒進行上下涂拭，然后立即放入 70%乙醇去碘，再用PBS去乙醇；
④將消毒的皮膚組織剪成2cmXO. 5 cm條狀，表皮面朝上于4°C 2 U/mL Dispase II 消化13 hr ；
⑤在解剖鏡下用尖鑷分離經(jīng)消化的皮膚組織的表皮和真皮，取下表皮并放入PBS清
洗；
⑥將表皮放入0.25% Trypsin/0. 05% EDTA中，用彎剪將表皮剪碎，放置于37°C消化12
min ；
⑦用37°C預(yù)熱的含20%FBS的DMEM中止消化，輕緩吹散表皮碎片；100目細(xì)胞篩過濾表皮碎片，余下細(xì)胞懸液放置于15 mL離心管；
⑧常溫下IOOg離心5min ；
⑨棄上清，用KSFM輕緩重新懸浮沉淀的細(xì)胞，接種于6cm培養(yǎng)皿中，置于37°C 5%C02 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為18 Mhr ；
⑩吸棄上清，加入新鮮KFSM；之后隔天半量換液，當(dāng)表皮干細(xì)胞密度為50%以上時每天換液，至80%時傳代。2、牙胚間充質(zhì)的分離
①取E13.5的小鼠胚胎，在解剖鏡下利用尖鑷取下胚胎頭部并分離下頌；
②將下頌放入2U/mL的Dispase液體中，37 °C消化8 min ；
③解剖鏡下，利用尖鑷分離磨牙區(qū)的牙胚上皮和間充質(zhì)；
④將7個牙間充質(zhì)放入裝有含10%FBS的DMEM的離心管中，2000rpm離心5 min，放置于37 V 5% C02培養(yǎng)箱孵育1 hr，形成牙胚間充質(zhì)團。3、組合生長因子的添加
取10 μ L瓊脂糖微球清洗晾干后，放入生長因子FGF8 (130 Pg/mL)和SHH (240 μδ/ mL)的混合液中靜置30 min。4、嵌合體重組①將Trowell器官培養(yǎng)皿外層裝PBS，里層裝含10%FBS的DMEM；同時在里層依次放入支架網(wǎng)和0. 45 μ m的濾膜，里層的液體剛好沒過濾膜；
②利用耳勺將上述步驟2分離的牙胚間充質(zhì)團挑出，放在準(zhǔn)備好的Trowell器官培養(yǎng)皿的濾膜上；
③將8個吸附生長因子的瓊脂糖微球放到牙胚間充質(zhì)團上；
④將密度為80% 90%的表皮干細(xì)胞刮下，覆蓋在濾膜上的附有瓊脂糖微球牙胚間充質(zhì)團上，即嵌合體構(gòu)建好，于37 V 5%C02培養(yǎng)箱孵育過夜。5、移植裸鼠腎囊膜
①將裸鼠麻醉后，剪開腎部位上方的皮膚和肌肉；
②用彎鑷取出腎，在解剖鏡下用尖鑷將腎囊膜剪開一個小口；
③將上述構(gòu)建好的嵌合體移植入腎囊膜內(nèi)；
④將移植后的腎放回腹腔，縫合肌肉和皮膚；
⑤裸鼠繼續(xù)喂養(yǎng)20天。6、嵌合體的鑒定 (1)固定與切片
①固定將移植20天的嵌合體組織取下，放置于4°C的4%多聚甲醛固定14hr ；
②脫鈣采用10%EDTA脫鈣到嵌合體組織軟化；
③脫水依次利用30%、50%、70%、90%和100%乙醇進行逐道進行脫水，每道1hr，然后 100%乙醇再重復(fù)一次；
④透明按無水乙醇二甲苯為1:1的比例配制透明液，透明處理30 min，然后放入二甲苯至組織透明為止；
⑤透蠟按二甲苯石蠟為1:1的比例配制透蠟液，透蠟處理30 min，然后放入3道石蠟中，每道1 hr ；
⑥包埋在解剖鏡下將組織放入裝滿石蠟的紙盒中，注意組織的前后左右方向；
⑦切片在切片機進行連續(xù)切片，貼在載玻片上，在展片機上展片17min，6(TC烘干后放置_20°C備用。(2) HE 染色
①脫蠟將上述組織切片依次放入2道二甲苯，每道15min ；
②復(fù)水依次放入100%、90%、70%、50%、30%乙醇和雙蒸水，每道5min ；
③放入蘇木精染液進行染色10min,自來水沖洗2 min ；
④放入伊紅染液進行染色30s ；
⑤脫水依次放入70%、90%和100%乙醇，每道5min，然后100%乙醇重復(fù)一次；
⑥二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察嵌合體是否具有牙本質(zhì)、成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙釉質(zhì)或成牙釉質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)僅有牙本質(zhì)和成牙本質(zhì)細(xì)胞兩種結(jié)構(gòu)計為成牙；具有牙本質(zhì)、成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙釉質(zhì)和成牙釉質(zhì)細(xì)胞四種結(jié)構(gòu)計為成釉。最后統(tǒng)計成牙率與成釉率分別提高至50%和71%。與采用單一 FGF8生長因子能夠誘導(dǎo)人表皮干細(xì)胞向成牙釉質(zhì)細(xì)胞分化的方法所得數(shù)據(jù)(成牙率約為觀％，成釉率約為31%)相比，分別提高了 2 和40%。實施例31、表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
①將取自福州兒童醫(yī)院年齡6歲的幼兒包皮環(huán)切手術(shù)后遺棄的離體!Bhr內(nèi)的包皮組織，放入含4%青霉素/鏈霉素的PBS中清洗兩次，然后在解剖鏡下剪去皮下脂肪組織；
②將其余皮膚組織放入PBS清洗三次；
③將清洗好的皮膚組織放入培養(yǎng)皿中，用棉球沾取碘酒進行上下涂拭，然后立即放入 70%乙醇去碘，再用PBS去乙醇；
④將消毒的皮膚組織剪成2cmXO. 5 cm條狀，表皮面朝上于4°C 2 U/mL Dispase II 消化14 hr ；
⑤在解剖鏡下用尖鑷分離經(jīng)消化的皮膚組織的表皮和真皮，取下表皮并放入PBS清
洗；
⑥將表皮放入0.25% Trypsin/0. 05% EDTA中，用彎剪將表皮剪碎，放置于37°C消化15
min ；
⑦用37°C預(yù)熱的含20%FBS的DMEM中止消化，輕緩吹散表皮碎片；100目細(xì)胞篩過濾表皮碎片，余下細(xì)胞懸液放置于15 mL離心管；
⑧常溫下IOOg離心5min ；
⑨棄上清，用KSFM輕緩重新懸浮沉淀的細(xì)胞，接種于6cm培養(yǎng)皿中，置于37°C 5%C02 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為18 Mhr ；
⑩吸棄上清，加入新鮮KFSM；之后隔天半量換液，當(dāng)表皮干細(xì)胞密度為50%以上時每天換液，至80%時傳代。2、牙胚間充質(zhì)的分離
①取E13.5的小鼠胚胎，在解剖鏡下利用尖鑷取下胚胎頭部并分離下頌；
②將下頌放入2U/mL的Dispase液體中，37 °C消化8 min ；
③解剖鏡下，利用尖鑷分離磨牙區(qū)的牙胚上皮和間充質(zhì)；
④將8個牙間充質(zhì)放入裝有含10%FBS的DMEM的離心管中，2000rpm離心5 min，放置于37 V 5% C02培養(yǎng)箱孵育1 hr，形成牙胚間充質(zhì)團。3、組合生長因子的添加
取10 μ L瓊脂糖微球清洗晾干后，放入生長因子FGF8 (140 Pg/mL)和SHH (220 μδ/ mL)的混合液中靜置30 min。4、嵌合體重組
①將Trowell器官培養(yǎng)皿外層裝PBS，里層裝含10%FBS的DMEM；同時在里層依次放入支架網(wǎng)和0. 45 μ m的濾膜，里層的液體剛好沒過濾膜；
②利用耳勺將上述步驟2分離的牙胚間充質(zhì)團挑出，放在準(zhǔn)備好的Trowell器官培養(yǎng)皿的濾膜上；
③將9個吸附生長因子的瓊脂糖微球放到牙胚間充質(zhì)團上；
④將密度為80% 90%的表皮干細(xì)胞刮下，覆蓋在濾膜上的附有瓊脂糖微球牙胚間充質(zhì)團上，即嵌合體構(gòu)建好，于37 V 5%C02培養(yǎng)箱孵育過夜。5、移植裸鼠腎囊膜
①將裸鼠麻醉后，剪開腎部位上方的皮膚和肌肉；
②用彎鑷取出腎，在解剖鏡下用尖鑷將腎囊膜剪開一個小口；③將上述構(gòu)建好的嵌合體移植入腎囊膜內(nèi)；
④將移植后的腎放回腹腔，縫合肌肉和皮膚；
⑤裸鼠繼續(xù)喂養(yǎng)20天。6、嵌合體的鑒定 (1)固定與切片
①固定將移植20天的嵌合體組織取下，放置于4°C的4%多聚甲醛固定18hr；
②脫鈣采用10%EDTA脫鈣到嵌合體組織軟化；
③脫水依次利用30%、50%、70%、90%和100%乙醇進行逐道進行脫水，每道1hr，然后 100%乙醇再重復(fù)一次；
④透明按無水乙醇二甲苯為1:1的比例配制透明液，透明處理30 min，然后放入二甲苯至組織透明為止；
⑤透蠟按二甲苯石蠟為1:1的比例配制透蠟液，透蠟處理30 min，然后放入3道石蠟中，每道1 hr ；
⑥包埋在解剖鏡下將組織放入裝滿石蠟的紙盒中，注意組織的前后左右方向；
⑦切片在切片機進行連續(xù)切片，貼在載玻片上，在展片機上展片20min，6(TC烘干后放置_20°C備用。(2) HE 染色
①脫蠟將上述組織切片依次放入2道二甲苯，每道15min ；
②復(fù)水依次放入100%、90%、70%、50%、30%乙醇和雙蒸水，每道5min ；
③放入蘇木精染液進行染色15min,自來水沖洗2 min ；
④放入伊紅染液進行染色30s ；
⑤脫水依次放入70%、90%和100%乙醇，每道5min，然后100%乙醇重復(fù)一次；
⑥二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察嵌合體是否具有牙本質(zhì)、成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙釉質(zhì)或成牙釉質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)僅有牙本質(zhì)和成牙本質(zhì)細(xì)胞兩種結(jié)構(gòu)計為成牙；具有牙本質(zhì)、成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙釉質(zhì)和成牙釉質(zhì)細(xì)胞四種結(jié)構(gòu)計為成釉。最后統(tǒng)計成牙率與成釉率分別提高至48%和67%。與采用單一 FGF8生長因子能夠誘導(dǎo)人表皮干細(xì)胞向成牙釉質(zhì)細(xì)胞分化的方法所得數(shù)據(jù)(成牙率約為觀％，成釉率約為31%，具體見附件的已發(fā)表論文)相比，分別提高了 20%和36%。
1權(quán)利要求
1.一種FGF8/SHH組合法提高表皮干細(xì)胞牙向分化效率的方法，首先將表皮干細(xì)胞進行分離和培養(yǎng)，得到傳代的表皮干細(xì)胞；同時將由小鼠胚胎磨牙區(qū)分離得到的牙胚間充質(zhì)組織團粒與傳代的表皮干細(xì)胞進行重組成嵌合體，最后將嵌合體移植裸鼠腎囊膜中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，其特征在于小鼠胚胎磨牙區(qū)分離得到的牙胚間充質(zhì)組織團粒與傳代的表皮干細(xì)胞進行重組前，牙胚間充質(zhì)組織預(yù)先附著上含有雙組合生長因子吸附體瓊脂糖微球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種FGF8/SHH組合法提高表皮干細(xì)胞牙向分化效率的方法，其特征在于所述的吸附體瓊脂糖微球，首先將瓊脂糖微球清洗晾干后，放入含有FGF8和SHH生長因子的混合液中靜置30 min進行充分吸附，制成瓊脂糖微球生長因子吸附體，其中20 μ L的混合液可放入10 μ L晾干后的瓊脂糖微球。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種FGF8/SHH組合法提高表皮干細(xì)胞牙向分化效率的方法，其特征在于所述的FGF8，在混合液中的濃度為120 150 Pg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種FGF8/SHH組合法提高表皮干細(xì)胞牙向分化效率的方法，其特征在于所述的SHH生長因子，在混合液中的濃度為200 250 Pg/mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用FGF8/SHH雙生長因子組合法提高動物上皮組織來源的表皮干細(xì)胞向成牙釉質(zhì)細(xì)胞分化效率的方法。首先將表皮干細(xì)胞進行分離和培養(yǎng)，得到傳代的表皮干細(xì)胞；同時將附著有雙生長因子的蛋白A瓊脂糖珠子的由小鼠胚胎磨牙區(qū)分離得到的牙胚上皮和間充質(zhì)組織團粒與表皮干細(xì)胞進行重組成嵌合體，最后將嵌合體移植裸鼠腎囊膜中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。FGF8在混合液中的濃度為120～150μg/mL，SHH在混合液中的濃度為200～250 μg/mL。采用本發(fā)明所述的方法，成牙率和成釉率分別至少提高至48%和67%，同時，F(xiàn)GF8/SHH雙生長因子組合法操作簡便，簡易普及。
文檔編號C12N5/071GK102559582SQ20121002473
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月6日
發(fā)明者張彥定, 王冰梅, 陳一平, 黃義德 申請人:福建師范大學(xué)