基因修飾的組織工程化骨及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了基因修飾的組織工程化骨及其制備方法和應用，其中，制備基因修飾的組織工程化骨的方法包括：(1)構(gòu)建pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP重組慢病毒載體；(2)將步驟(1)得到的重組載體包裝成重組慢病毒；(3)將步驟(2)得到的重組慢病毒感染牙周膜干細胞，獲得轉(zhuǎn)染重組慢病毒的牙周膜干細胞；(4)將步驟(3)獲得的所述轉(zhuǎn)染重組慢病毒的牙周膜干細胞同β-磷酸三鈣支架材料體外復合，獲得所述基因修飾的組織工程化骨。該組織工程化骨可用于治療牙周骨缺損疾病。
【專利說明】基因修飾的組織工程化骨及其制備方法和應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種基因修飾的組織工程化骨及其制備方法。更具體地，具體涉及一種人類骨保護素基因修飾的組織工程化骨及其制備方法，以及該組織工程化骨在制備治療牙周骨缺損疾病材料中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002]牙周病是發(fā)生在牙齒支持組織的炎癥性、破壞性疾病，以牙槽骨的吸收破壞為主要特征。在臨床治療中通過牙周病的基礎(chǔ)治療、牙周手術(shù)(根面處理技術(shù)、引導性牙周組織再生術(shù)、骨移植)和藥物治療，對消除致病因素、促使炎癥減輕有一定療效，但難以恢復正常的牙槽嵴高度、形成新附著。
[0003]組織工程技術(shù)為牙周組織再生提供了新方法。生長因子是組織工程的重要因素，它們能調(diào)控包括牙周來源在內(nèi)的多種細胞的增殖、遷移、分化和外基質(zhì)的合成，在牙周組織再生的修復中發(fā)揮重要作用。但是傳統(tǒng)的組織工程方法應用生長因子時，多將生長因子局部注射或復合細胞和支架材料后植入體內(nèi)，由于生長因子多為蛋白質(zhì)或多肽，在體內(nèi)極易降解，生物半衰期短，容易被體液沖走或稀釋，因此難以保持局部有效治療濃度。
[0004]基因治療為生長因子持續(xù)、穩(wěn)定表達提供了新方法。借助基因治療的手段(如轉(zhuǎn)基因技術(shù))，將生長因子的基因轉(zhuǎn)移到牙周組織相關(guān)靶細胞內(nèi)，當基因?qū)氚屑毎螅@些細胞便可以充當微型“生物工廠”，持續(xù)釋放細胞因子，促使靶細胞的表型向再生方向分化；并通過自分泌或旁分泌作用對細胞自身以及周圍未轉(zhuǎn)染的細胞產(chǎn)生作用，促使整個缺損區(qū)的所有細胞活化，從而提高牙周組織再生的成功率。
[0005]目前利用組織工程和基因治療技術(shù)以及兩者相結(jié)合促進牙周組織修復再生已成為牙周領(lǐng)域的研究熱點。有部分學者利用該技術(shù)在牙周病治療、促進牙槽骨新生方面進行了研究，通過牙周膜細胞(Per1dontal ligament cells,牙周膜細胞)體外培養(yǎng),并將骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein, BMPs)或血小板生長因子(Platelet-derivedgrowth factor, PDGF)等促進骨形成基因轉(zhuǎn)染至牙周膜細胞，回植到牙周組織缺損處,發(fā)現(xiàn)有促進牙槽骨形成的作用。然而，牙周組織是由牙骨質(zhì)、牙周膜、牙槽骨與牙齦共同構(gòu)成的三維結(jié)構(gòu)，牙周病是細菌等各種病原因素對這四者的共同破壞，雖然通過牙周手術(shù)，包括使用牙周組織工程方法在提供修復用細胞、促進組織形成等方面有一定作用，但是，在病變牙周組織中主要是各種刺激因素導致的大量破骨細胞活化，抑制了牙周組織的成骨能力，使組織修復無法達到理想效果。因此，單一依靠促進骨形成來治療牙周病效果未盡人意。
[0006]骨保護素(osteoprotegerin, 0PG)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種能阻止破骨細胞分化、成熟，抑制骨吸收的關(guān)鍵因子。骨保護素是核因子K B受體活化因子配體(receptoractivator of nuclear factor κ B ligand, RANKL)的天然誘傅受體，能競爭性地與核因子κ B受體活化因子配體結(jié)合，阻斷核因子κ B受體活化因子(Receptor activator ofnuclear factor-κ B, RANK)與核因子κ B受體活化因子配體間的相互作用，從而抑制破骨細胞的形成和活化，抑制骨吸收。研究發(fā)現(xiàn)，核因子κ B受體活化因子配體水平升高可以導致牙周組織的破壞；檢測牙周病患者齦溝液顯示，RANKL/OPG比率比健康人群明顯升高；細菌產(chǎn)生的毒素或是組織表達的炎癥介質(zhì)也是通過影響RANKL/OPG比率而影響組織修復的。這些研究結(jié)果表明，OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)在牙周骨代謝中是重要的分子調(diào)節(jié)機制之一。
[0007]牙周組織中最重要的一種細胞是牙周膜細胞，有學者研究發(fā)現(xiàn)牙周膜細胞可以表達骨保護素和核因子κ B受體活化因子配體，在沒有受到外界刺激時骨保護素表達較核因子κ B受體活化因子配體強，不利于破骨生成，以維持牙周內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。揭示了牙周膜細胞是通過0PG/RANKL系統(tǒng)來調(diào)節(jié)牙槽骨代謝的。由于牙周膜細胞位于牙槽骨和牙骨質(zhì)之間，其分泌的骨保護素可能在抵御炎癥組織中核因子κ B受體活化因子配體介導的骨吸收中發(fā)揮一定的防御功能。
[0008]近年來，國內(nèi)外學者利用骨保護素防治因破骨細胞過度活化而引起的骨吸收疾病做了大量研究，發(fā)現(xiàn)骨保護素可有效抑制骨質(zhì)疏松性骨吸收、惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移破壞等骨質(zhì)吸收疾病。但使用骨保護素治療牙周骨缺損還未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:
[0010]發(fā)明人將組織工程化骨植入兔牙周骨缺損處，以磷酸三鈣作為生長空間，植入的牙周膜干細胞在局部分化成成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞和成纖維細胞，直接參與牙周骨組織的再生；同時植入的牙周膜干細胞在體內(nèi)存活、發(fā)生遷移、吞噬及分泌細胞外基質(zhì)，并吸引體內(nèi)細胞至缺損區(qū)域，從而促進了牙周骨組織再生；另外植入的牙周膜干細胞不斷分泌骨保護素蛋白，通過抑制核因子κ B受體活化因子配體與破骨細胞表面的核因子κ B受體活化因子結(jié)合，抑制破骨細胞活化，抑制牙槽骨吸收，從而提高牙周骨愈合過程。
[0011]本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的目的在于提供了一種制備基因修飾的組織工程化骨的方法。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種制備基因修飾的組織工程化骨的方法。根據(jù)本發(fā)明實施例。所述復合材料由含有hOPG基因的慢病毒修飾的牙周膜干細胞和β-磷酸三鈣制備而成。根據(jù)本發(fā)明具體示例，本發(fā)明的方法包括:
[0013](I)構(gòu)建 pLenti6.3_h0PG-1RES_EGFP 重組慢病毒載體；
[0014](2)將步驟(I)得到的重組載體包裝成重組慢病毒；
[0015](3)將步驟(2)得到的重組慢病毒感染牙周膜干細胞，獲得轉(zhuǎn)染重組慢病毒的牙周膜干細胞；
[0016](4)將步驟(3)獲得的所述轉(zhuǎn)染重組慢病毒的牙周膜干細胞同β -磷酸三鈣支架材料體外復合，獲得所述基因修飾的組織工程化骨。
[0017]發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的重組載體能轉(zhuǎn)染極難轉(zhuǎn)染的牙周膜干細胞并且不影響轉(zhuǎn)染后的牙周膜干細胞與支架材料的黏附及其正常的生長。利用該方法制備獲得的基因修飾的組織工程化骨，能夠促進牙周骨組織的再生。
[0018]根據(jù)本發(fā)明實施例，步驟(I)進一步包括:全基因合成人骨保護素(GenbankN0.ΝΜ_002546)的編碼序列區(qū)域；hOPG基因的編碼序列區(qū)域克隆連接到T載體上；使用合適的引物擴增含有兩端酶切位點的hOPG基因編碼序列片段；將基因片段連接到pIRES-EGFP載體上；轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測序鑒定篩選出連接到載體的克隆；使用合適的引物擴增出hOPG-1RES-EGFP序列，亞克隆到載體pcDNA6.2w上；經(jīng)BP重組到入門載體上，再經(jīng)LR重組到pLENT6.3/V5載體上。由此，利用該方法可以獲得重組慢病毒載體，該慢病毒載體能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)染基因在體內(nèi)持續(xù)、穩(wěn)定的表達；并能用于極難轉(zhuǎn)染的干細胞和原代細胞。
[0019]根據(jù)本發(fā)明實施例，本發(fā)明制備方法中選用的酶切位點是BglI和BamHI。
[0020]根據(jù)本發(fā)明實施例，擴增含有酶切位點的hOPG基因編碼序列片段使用的第一引物序列為:SEQ NO 1(命名為SF-F1)、:SEQ NO 2 (命名為SF-R1)，第一引物的具體序列如下:
[0021]SF-Fl:5，-AAATAGATCTGCCACCATGAACAACTTGCT-3’ (SEQ NO I)；
[0022]SF-Rl:5’ -ATACGTCGACAGCTGGGTCTTATAAGCAGC-3’ (SEQ NO 2)；
[0023]由此，擴增的精確率好、效率高。
[0024]根據(jù)本發(fā)明實施例，擴增hOPG-1RES-EGFP序列使用的第二引物序列為::
[0025]SEQ NO 3 (命名為SF-F)、:SEQ NO 4 (命名為SF-R2)，，第二引物的具體序列如下:
[0026]SF-F:5’ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCGCCACCATGAACAACTTGCTGTGCTGCG-3’ (SEQ NO 3)；
[0027]SF-R2:5’ - GG GG A C C A C T T T G T A C A A G A A A G C T GG G T C T C A C T T G T A C AGCTCATCCATGCCG-3’ (SEQ NO 4)。
[0028]由此，擴增的特異性好、效率高。
[0029]根據(jù)本發(fā)明實施例，本發(fā)明前述的步驟(4)進一步包括:(I)磷酸三鈣支架材料的制備；(2)將pLenti6.3-hOPG-1RES-EGFP轉(zhuǎn)染后的牙周膜干細胞與磷酸三鈣支架材料的體外復合。由此，該制備方法不影響轉(zhuǎn)染后的牙周膜干細胞與支架材料的黏附及其正常的生長，轉(zhuǎn)染后的牙周膜干細胞與支架材料的復合效果好。
[0030]根據(jù)本發(fā)明實施例，磷酸三鈣支架材料的制備的具體操作如下:將顆粒型磷酸三鈣支架材料無水乙醇浸泡24h后，用質(zhì)量濃度75%酒精沖洗浸泡15min，用雙蒸水漂洗3遍，經(jīng)高溫高壓滅菌后置入24孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液預濕備用。
[0031]根據(jù)本發(fā)明實施例，將pLenti6.3-h0PG_IRES_EGFP轉(zhuǎn)染后的牙周膜干細胞與磷酸三鈣支架材料的體外復合的具體操作如下:將pLenti6.3-hOPG-1RES-EGFP轉(zhuǎn)染牙周膜干細胞，細胞消化后制備成5 X 106/ml的細胞懸液，分別滴加于24孔培養(yǎng)板中備用的β -磷酸三鈣材料上，使細胞自然沉降在材料表面，2h后在培養(yǎng)皿中緩慢注入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液2ml，充分浸沒材料，再加入適量的培養(yǎng)基，在體積分數(shù)為5%的C02、37°C孵箱中培養(yǎng)。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的組織工程化骨。根據(jù)本發(fā)明實施例，該產(chǎn)品是利用本發(fā)明前述的實施例的方法制備而成的。
[0033]發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該產(chǎn)品利用組織工程聯(lián)合基因治療技術(shù)治療牙周骨缺損，能夠顯著促進牙周骨組織再生。
[0034]根據(jù)本發(fā)明再一方面，本發(fā)明還提供了上述組織工程化骨在制備治療牙周骨缺損疾病的材料中的用途。
[0035]發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，將基因修飾的組織工程化骨做為牙周骨缺損材料，利用組織工程聯(lián)合基因治療技術(shù)治療牙周骨缺損，能顯著促進牙周骨組織再生。
[0036]本發(fā)明所述的Gateway技術(shù)是克隆和亞克隆DNA序列的一項新穎的通用系統(tǒng)，便于功能基因的分析和蛋白質(zhì)的表達。一旦進入這個多功能的操作系統(tǒng)，DNA片段可以通過位點特異的重組在載體之間轉(zhuǎn)移。Gateway技術(shù)是基于已研究的非常清楚的λ噬菌體位點特異重組系統(tǒng)(attB XattP — attLXattR)。BP和LR兩個反應就構(gòu)成了 Gateway技術(shù)。BP重組反應是利用一個attB DNA片段或表達克隆和一個attP供體載體之間的重組反應，創(chuàng)建一個入門克隆，產(chǎn)物是attLl-基因_attL2。LR重組反應是一個attL入門克隆和一個attR目的載體之間的重組反應，產(chǎn)物是attBl-基因_attB2。LR反應用來在平行的反應中轉(zhuǎn)移目的序列到一個或更多個目的載體。
[0037]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果:利用pLenti6.3-h0PG_IRES_EGFP轉(zhuǎn)染牙周膜干細胞/β -磷酸三鈣修復牙周骨缺損，本發(fā)明的重組慢病毒載體能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)染基因在體內(nèi)持續(xù)、穩(wěn)定的表達；能夠用于極難轉(zhuǎn)染的干細胞和原代細胞；以慢病毒為載體的基因轉(zhuǎn)染不影響種子細胞與支架材料的黏附及其正常的生長，pLenti6.3-hOPG-1RES-EGFP轉(zhuǎn)染牙周膜干細胞/ β -磷酸三鈣能顯著促進牙周骨組織再生，為組織工程聯(lián)合基因治療技術(shù)治療牙周骨缺損提供可能性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1顯示了經(jīng)過有限稀釋法克隆化培養(yǎng)的牙周膜干細胞的細胞形態(tài)顯微圖片，，其中
[0039]A顯示了未染色細胞的形態(tài)的顯微圖片，
[0040]B顯示了 HE染色的細胞的形態(tài)的顯微圖片；
[0041]圖2顯示了 MTT法檢測純化的牙周膜干細胞與未純化的牙周膜細胞的生長曲線示意圖；
[0042]圖3顯示了牙周膜干細胞來源及表面標志鑒定的顯微圖片，其中
[0043]A顯示了波形絲蛋白的顯微圖片，
[0044]B顯示了角蛋白的顯微圖片，
[0045]C顯示了 STR0-1的顯微圖片；
[0046]圖4顯示了牙周膜干細胞成骨誘導后ALP活性測定結(jié)果示意圖；
[0047]圖5顯示了牙周膜干細胞成骨誘導后各分子指標的檢測結(jié)果的顯微圖片，其中
[0048]A顯示了堿性磷酸酶的顯微圖片，
[0049]B顯示了礦化結(jié)節(jié)的顯微圖片，
[0050]C顯示了骨鈣素的顯微圖片，
[0051]D顯示了 I型膠原的顯微圖片；
[0052]圖6顯示成脂誘導后的牙周膜干細胞，其中
[0053]A顯示了脂滴的形成的顯微圖片，
[0054]B顯示了油性O染色陽性的顯微圖片；
[0055]圖7顯示了慢病毒重組質(zhì)粒的圖譜示意圖；
[0056]圖8顯示了 pLenti6.3-h0PG_IRES_EGFP轉(zhuǎn)染牙周膜干細胞后的細胞形態(tài)的顯微圖片，其中
[0057]A顯示了光鏡下圖像的圖片，
[0058]B顯示了熒光顯微鏡下的圖像的圖片；
[0059]圖9顯示了 QPCR檢測hOPG基因的表達結(jié)果的示意圖，其中
[0060]A顯示了內(nèi)參基因的擴增曲線和熔解曲線的示意圖，
[0061]B顯示了 hOPG基因的擴增曲線和熔解曲線的示意圖；
[0062]圖10顯示了利用Western Blot檢測hOPG蛋白表達結(jié)果的圖片；
[0063]圖11顯示了細胞與材料復合掃描電鏡圖像的圖片；
[0064]圖12顯示術(shù)后12周組織學觀察圖像的圖片；
[0065]圖13顯示了新生牙槽骨的激光共聚焦顯微圖像的圖片；
[0066]圖14顯示了新生牙槽骨面積百分比示意圖。

【具體實施方式】
[0067]慢病毒載體是近年來基因治療載體研究的熱點。慢病毒可以非常高效地將基因轉(zhuǎn)染到活體模式生物和幾乎所有的哺乳動物細胞中，包括不分化的細胞。對于干細胞，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導效率，轉(zhuǎn)染率達90%以上。牙周組織工程體內(nèi)動物實驗的觀察時間較長，通常為2-3個月，甚至更長時間。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。更重要的是，慢病毒轉(zhuǎn)染體系不會產(chǎn)生化學轉(zhuǎn)染或腺病毒轉(zhuǎn)染等引起的非特異性的細胞反應。本發(fā)明利用慢病毒的這一特性，嘗試使用基因治療的方法使人牙周膜干細胞在牙周骨缺損局部持續(xù)分泌表達，抑制局部大量破骨細胞的活化，抑制骨吸收，從而加快牙周骨愈合過程的能力。
[0068]目前多數(shù)學者認為基因強化組織工程牙周組織的靶細胞首選為牙周膜干細胞，它是一組具有多向分化潛能的未分化間充質(zhì)細胞，直接取自牙周組織，具有很強的增殖能力，一定條件下可分化為成纖維細胞、成骨細胞和成牙骨質(zhì)細胞，進一步形成新的牙周組織，而且自體細胞植入還可避免免疫排斥反應。
[0069]本發(fā)明利用攜帶人牙周膜干細胞基因的慢病毒轉(zhuǎn)染牙周膜干細胞，然后將基因修飾的細胞與β -磷酸三鈣復合，構(gòu)建組織工程化骨，修復兔牙周骨缺損。
[0070]下面將結(jié)合實施例進一步詳細地描述本發(fā)明，然而應當理解，列舉這些實施例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明。
[0071]實施例1牙周膜干細胞體外培養(yǎng)及分化研究
[0072]1.牙周膜細胞原代培養(yǎng)和生理指標的檢測
[0073]1.1牙周膜細胞原代培養(yǎng)
[0074]分別采用組織塊法和酶解組織塊法進行細胞原代培養(yǎng)?？諝馑ㄈㄌ幩缹嶒瀯游?。立即摘取兔上下頜骨，并置于75%酒精中浸泡15min。在超凈工作臺內(nèi)，用咬骨鉗去除牙齒周圍的牙槽骨，完整分離出兔牙齒。拔髓針完整拔除牙髓，用含有雙抗的PBS自根尖至牙冠反復沖洗，并用咬骨鉗剪去牙冠及根尖部，只留根中1/3段，加入3mg/ml的I型膠原酶，在水浴震蕩器37°C下消化lh，將上清接種于6孔板內(nèi)，沉淀中加入膠原酶，繼續(xù)消化lh，將組織塊和消化下來的細胞接種到前述6孔板中，37°C、5% CO2、飽和濕度條件下于恒溫孵箱中靜置培養(yǎng)。3d后更換培養(yǎng)液棄去未貼壁的細胞，2-3d換液I次，收集對數(shù)生長期的牙周膜細胞的培養(yǎng)上清備用。細胞生長達80%匯合時，用2.5g/L的胰酶消化傳代。有限稀釋法克隆化培養(yǎng)純化牙周膜細胞
[0075]將收集的對數(shù)生長期牙周膜細胞的培養(yǎng)上清1500r/min離心lOmin，經(jīng)0.22 μ m直徑的小濾器過濾后，與培養(yǎng)基以1:1比例混合作為適應性培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的第一代細胞用適應性培養(yǎng)基倍比稀釋，調(diào)整細胞密度至10-15個/ml，吹打混勻，接種于96孔培養(yǎng)板中，100 μ I/孔，培養(yǎng)12h后標記單個細胞孔，并補液至200 μ I/孔，待克隆長至孔底1/3-1/2時，用胰酶消化分別移至24孔板和6孔板中擴大培養(yǎng)。
[0076]1.2牙周膜細胞的生理指標的檢測
[0077]1.2.1MTT法檢測細胞生長周期
[0078]分別取第4代克隆化培養(yǎng)的兔牙周膜細胞和未純化的兔牙周膜細胞的單細胞懸液，各以2 X 13/孔接種于96孔板中，每孔培養(yǎng)液200 μ 1，共9組，每組10個復孔。連續(xù)培養(yǎng)9d，每3d換液。每天各取10孔，每孔分別加入MTT溶液(5g/L) 20 μ 1，37°C繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，吸去上清液。每孔加入150 μ I DMS0，吹打混勻。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，求均值。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸，繪制細胞生長曲線。
[0079]1.2.2細胞來源及間充質(zhì)干細胞表面標志鑒定
[0080]取生長狀態(tài)良好的克隆化培養(yǎng)的細胞制作細胞爬片。采用免疫熒光方法鑒定波形絲蛋白、角蛋白和間充質(zhì)干細胞標志STR0-1的表達。
[0081]2.牙周膜干細胞的成骨誘導
[0082]2.1堿性磷酸酶活性檢測分別將利用礦化液(含lOmmol/1 β -甘油磷酸鈉、50 μ g/ml維生素C、I X 10_8mol/L地塞米松和10%小牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液)誘導和未誘導的克隆化培養(yǎng)的細胞以5 X 104/ml的細胞濃度，加入96孔板，每孔100 μ 1，各接種24孔，每3天換液一次。于接種后3d和7d，按照堿性磷酸酶組化試劑盒說明操作，選擇510nm波長，酶聯(lián)免疫檢測儀分別測定12孔誘導組和未誘導組細胞的光吸收值，檢測細胞的堿性磷酸酶活性。
[0083]2.2骨鈣素、I型膠原免疫細胞化學染色取生長狀態(tài)良好的克隆化培養(yǎng)的細胞制備細胞爬片，以2X 104/ml的密度接種于置有蓋玻片的6孔板中，用10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)24h，待細胞伸展至60%匯合后，換礦化誘導液(含lOmmol/Ιβ-甘油磷酸鈉、SOyg/ml維生素C、lXl(T8mol/L地塞米松、10%小牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液)連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)21d時取部分細胞爬片，行骨鈣素、I型膠原免疫細胞化學染色。
[0084]2.3礦化結(jié)節(jié)染色取生長狀態(tài)良好的克隆化培養(yǎng)的細胞接種后，用礦化液連續(xù)培養(yǎng)至28d，經(jīng)4%多聚甲醛固定30min，行茜素紅染色，觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。
[0085]3.牙周膜干細胞的成脂誘導
[0086]取生長狀態(tài)良好的克隆化培養(yǎng)的細胞制備細胞爬片，以2X 104/ml的密度接種于置有蓋玻片的6孔板中，用10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，待細胞伸展至60%匯合后，換成脂誘導液(含IX 10_6mol/L地塞米松，10mg/L胰島素,0.5mmol/L異丁基黃嘌呤，0.2mmol/L吲哚美辛，10%小牛血清L-DMEM的培養(yǎng)液)，觀察細胞形態(tài)變化，油紅O染色。
[0087]4.實驗結(jié)果
[0088]本實驗采用組織塊法和酶解組織塊法進行兔牙周膜細胞的原代培養(yǎng)，并采用有限稀釋法進行兔牙周膜細胞克隆篩選，獲得單細胞克隆來源的細胞(圖1)，克隆形成率為0.52% ;細胞生長曲線結(jié)果顯示，克隆化培養(yǎng)的牙周膜細胞和未克隆化培養(yǎng)的牙周膜細胞生長曲線(圖2)，均呈倒“S”形，在培養(yǎng)的第2天細胞生長速度加快，第7天各自的生長速度減慢，總體來說克隆化培養(yǎng)的牙周膜細胞生長慢于未克隆化培養(yǎng)的牙周膜細胞；細胞免疫熒光鑒定波形絲蛋白表達陽性，角蛋白表達陰性，間充質(zhì)干細胞表面標志STRO-1表達陽性(圖3);并向成骨、脂肪細胞誘導分化，初步研究了牙周膜細胞的分化潛能，成骨誘導后，ALP活性增高(圖4) ,ALP染色陽性，體外可形成礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色陽性，免疫細胞化學染色結(jié)果顯示OC和COL I均呈陽性表達(圖5);成脂誘導后，油紅O染色陽性(圖6)。本實驗結(jié)果表明牙周膜細胞具有間充質(zhì)干細胞表型和多向分化潛能，可作為牙周組織工程的種子細胞。
[0089]實施例2慢病毒載體介導hOPG基因轉(zhuǎn)染牙周膜干細胞
[0090]1.PCR擴增人骨保護基因
[0091]登陸Genbank查詢?nèi)斯潜Ｗo素基因(Genbank N0.NM_002546)的mRNA序列。根據(jù)文獻報道設計人骨保護素基因cDNA的特異引物序列，由美國Invitrogen公司進行全基因合成hOPG基因的編碼序列區(qū)域。
[0092]2.C端融合IRES-EGFP的中間載體的構(gòu)建
[0093](I)根據(jù)所需融合表達的基因序列設計并合成4條引物，引物序列如下所示:
[0094]SF-Fl:
[0095]5，-AAATAGATCTGCCACCATGAACAACTTGCT-3’ (SEQ NO I)；
[0096]SF-Rl:
[0097]5’ -ATACGTCGACAGCTGGGTCTTATAAGCAGC-3’ (SEQ NO 2)；
[0098]SF-F:
[0099]5’ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCGCCACCATGAACAACTTGCTGTGCTGCG-3’ (SEQ NO 3)；
[0100]SF-R2:
[0101]5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTTGTACAGCTCAT CCATGCCG-3’ (SEQ NO4)；
[0102](2)將hOPG基因的編碼序列區(qū)域克隆連接到T載體上；
[0103](3)使用引物SF-FUSF-Rl擴增含有BglI和BamHI酶切位點的hOPG基因編碼序列片段，PCR反應體系如表1所示,反應條件如表2所示:
[0104]表1PCR反應體系
[0105]

【權(quán)利要求】
1.一種制備基因修飾的組織工程化骨的方法，其特征在于，所述制備方法包括: (1)構(gòu)建pLenti6.3-hOPG-1RES-EGFP 重組慢病毒載體； (2)將步驟(I)得到的所述重組載體包裝成重組慢病毒； (3)將步驟(2)得到的重組慢病毒感染牙周膜干細胞，獲得轉(zhuǎn)染重組慢病毒的牙周膜干細胞； (4)將步驟(3)獲得的所述轉(zhuǎn)染重組慢病毒的牙周膜干細胞同β_磷酸三鈣支架材料體外復合，獲得所述基因修飾的組織工程化骨。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)進一步包括: a、合成人類骨保護素基因的編碼序列區(qū)域； b、將人類骨保護素基因的編碼序列區(qū)域克隆連接到T載體上； C、使用第一引物從連接骨保護素的T載體擴增兩端含有酶切位點的人類骨保護素基因的編碼序列片段； d、將步驟c得到的基因片段連接到pIRES-EGFP載體上，獲得OPG-1RES-EGFP載體； e、利用步驟d獲得的OPG-1RES-EGFP重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克?。? f、使用第二引物從陽性克隆擴增出OPG-1RES-EGFP序列，亞克隆到載體pcDNA6.2w上; g、經(jīng)BP重組反應到入門載體上，再經(jīng)LR重組反應到pLENT6.3/V5載體上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟c中所述第一引物序列為SEQNOl和SEQ N02所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟c中所述酶切位點是BglI和BamHI。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟f中所述第二引物序列為:SEQN03和SEQ N04所示的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)進一步包括: (1)磷酸三鈣支架材料的制備； (2)將pLenti6.3-hOPG-1RES-EGFP轉(zhuǎn)染后的牙周膜干細胞與磷酸三鈣支架材料的體外復合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述磷酸三鈣支架材料的制備的具體操作如下:將顆粒型β -磷酸三鈣支架材料無水乙醇浸泡24h后，用質(zhì)量濃度75%酒精沖洗浸泡15min，用雙蒸水漂洗3遍，經(jīng)高溫高壓滅菌后置入24孔板中，用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液預濕備用。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述體外復合的具體操作如下:將pLenti6.3-hOPG-1RES-EGFP轉(zhuǎn)染牙周膜干細胞，細胞消化后制備成5 X 106/ml的細胞懸液，分別滴加于24孔培養(yǎng)板中備用的β -磷酸三鈣材料上，使細胞自然沉降在材料表面，2h后在培養(yǎng)皿中緩慢注入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液2ml，充分浸沒材料，再加入適量的培養(yǎng)基，在體積分數(shù)為5%的CO2、37 °C孵箱中培養(yǎng)。
9.一種基因工程修飾的組織工程化骨，其是根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述方法獲得的。
10.權(quán)利要求9所述的組織工程化骨在制備治療牙周骨缺損疾病的材料中的用途。
【文檔編號】A61L27/36GK104174064SQ201410331757
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月11日
【發(fā)明者】劉洪臣, 蘇方, 王東勝, 鄂玲玲 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院, 中國人民解放軍第306醫(yī)院