專利名稱：一種提高玉米籽粒產(chǎn)量的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種提高玉米籽粒產(chǎn)量的培養(yǎng)方法，該方法是構(gòu)建植物表達(dá)載體將Zmdal-I基因通過花粉管通道法轉(zhuǎn)化玉米基因組中。
背景技術(shù)：
玉米是世界上分布最廣泛的糧食作物之一，種植面積僅次于小麥和水稻而居第三位。中國(guó)年產(chǎn)玉米占世界第二位。玉米既是重要的糧食作物，又是主要的飼料作物。所以如何提高玉米的產(chǎn)量以及抗逆性就成為了研究熱點(diǎn)之一。玉米基因轉(zhuǎn)化可以通過各種方法，例如花粉管通道法(周光宇1979)子房注射法 (丁群星1995)超聲波法(Zhang H 1992)基因槍法(王國(guó)英1996)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Ishide Y 1996)以及電擊法(D，Halluin K 1992)上述方法除子房注射發(fā)之外都需要通過誘導(dǎo)愈傷組織甚至培養(yǎng)原生質(zhì)體，在誘導(dǎo)愈傷組織以及再生植株的過程中很容易引起突變，造成篩選后的轉(zhuǎn)化植株難以移植，并且從組培環(huán)境中移栽到溫室中后，植株成活率低且容易發(fā)生返祖以及不育等癥狀(王景雪2001)。花粉管通道法作為一種不依賴植物組織培養(yǎng)和誘導(dǎo)再生植物的方法，其操作相對(duì)于子房注射發(fā)簡(jiǎn)單，快速，很適于大規(guī)模的轉(zhuǎn)化。盡管植物的種子以及器官的大小受到外部因素例如光照、溫度等的影響。但是植物種子以及器官最終的大小的確立是受到物種內(nèi)部因子調(diào)控的。當(dāng)植物生長(zhǎng)在貧瘠的土地上，內(nèi)源機(jī)制伴隨著環(huán)境決定了器官以及種子最終的大小(Tsukaya 2006)。擬南芥中的 DAl基因跟BIG BROTHER (BB)基因是等位基因，在擬南芥中DAl扮演著跟E0D1/BB相同的控制種子和器官大小的作用(Yunhai Li 2008)。在擬南芥植物中通過過表達(dá)W-7基因 (DAl的突變形式DAl E358K )增加了擬南芥種子大小。但是，目前的研究中還沒有通過將DAl基因的同源基因在玉米等經(jīng)濟(jì)作物中過表達(dá)，以增加該經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量的方法。目前的科研和生產(chǎn)工作中需要將dal-1基因改造后轉(zhuǎn)化入玉米基因組中，增加玉米籽粒產(chǎn)量的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種提高玉米籽粒產(chǎn)量的培養(yǎng)方法，該方法是構(gòu)建植物表達(dá)載體將 Zmdal-I基因?qū)胗衩字?，所述的為t/a7_7基因的序列為SEQ ID No :1。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種提高玉米籽粒產(chǎn)量的培養(yǎng)方法，該方法是構(gòu)建植物表達(dá)載體將為山7-7基因轉(zhuǎn)化入玉米中。所述的Z麗&7-7基因的序列包括在SEQ ID No :1中；所述的Z麗&7_7基因是玉米基因組中的一個(gè)類似于擬南芥植物中的DAl基因中的基因的突變形式；
所述的ZmDAl基因的序列在Gene Bank的編號(hào)為BT085014. I。所述的植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為質(zhì)粒載體pGreen0229,所述的植物表達(dá)載體帶有Ubiquitin啟動(dòng)子、基因的開放閱讀框，所述的植物表達(dá)載體的標(biāo)記基因?yàn)榭钩輨┑腷ar基因。
所述的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法為
k、、備35Sbar基因連接到PGreen0229質(zhì)粒載體，得到35Sbar- PGreen0229質(zhì)粒載體；
B、將Mxs基因連接到所述的35Sbar_PGreen0229質(zhì)粒載體，得到Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體；
C、將現(xiàn)以基因連接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到UBQI-Nos-35Sbar -PGreen0229 質(zhì)粒載體；
D、將所述的Z麗/a7-7基因連接到所述的UBQI-Nos-35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體，得 到所述的植物表達(dá)載體。所述的玉米的品種為自交系吉444。所述的導(dǎo)入方法為花粉管通道法，所述的花粉管通道法包括以下步驟
A、在玉米開花期時(shí)，選擇發(fā)育正常的植株進(jìn)行套袋授粉處理；
B、在所述的套袋授粉處理后22-23小時(shí)內(nèi)，對(duì)玉米植株的花穗進(jìn)行修剪處理；
C、在上述修剪處理形成的切口處滴注200-210u 1濃度為500 ng/ u 1的所述的植物表 達(dá)載體的溶液，之后重新套袋。本發(fā)明的有益效果為
1、因?yàn)楸景l(fā)明利用為W-7基因潛在的改變植物器官的大小的特性，利用UBQI啟動(dòng)子 m^]Zindal-l基因的表達(dá)，構(gòu)建植物表達(dá)載體將為山7-7基因轉(zhuǎn)入玉米基因組中，所以本發(fā) 明能夠?qū)mdal-1基因提高玉米籽粒產(chǎn)量的潛力變?yōu)榭蒲泻蜕a(chǎn)中切實(shí)可行的成熟方案。2、因?yàn)楸景l(fā)明中植物表達(dá)載體的出發(fā)載體是具有生物安全性的PGreen0229質(zhì)粒 載體，所以本發(fā)明對(duì)環(huán)境友好，避免轉(zhuǎn)基因植物對(duì)生態(tài)的不良影響。3、因?yàn)楸景l(fā)明是直接將含有目的DNA的植物表達(dá)載體溶液直接轉(zhuǎn)入玉米中，不依 賴于玉米的組培再生體系，所以操作簡(jiǎn)便，無需昂貴儀器，生產(chǎn)成本低廉。


圖1為實(shí)施例1中的植物表達(dá)載體圖譜。圖2為實(shí)施例1中的植物表達(dá)載體酶切產(chǎn)物電泳圖。圖3為實(shí)施例1中的T0代抗性植株35Sbar基因PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖。圖4為實(shí)施例1中的T0代抗性植株基因PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖。圖5為實(shí)施例1中的PCR陽(yáng)性植株P(guān)CR-Southern blotting檢測(cè)電泳圖。圖6為實(shí)施例1中的PCR-Southern blotting陽(yáng)性植株RT-PCR檢測(cè)結(jié)果電泳圖。圖7為實(shí)施例1中的PCR-Southern blotting陽(yáng)性植株的ZmDAl基因表達(dá)量示意 圖。圖8為實(shí)施例1中的轉(zhuǎn)入Zmded-1基因的植株生長(zhǎng)出的玉米果穗的照片。實(shí)施例1 :
一種提高玉米籽粒產(chǎn)量的培養(yǎng)方法，該方法是構(gòu)建植物表達(dá)載體將為山7-7基因轉(zhuǎn)化 入玉米中，所述的為W-7基因的序列為SEQ ID No :1。該方法包括以下步驟
I、Zmdal_l基因的獲得
所述的為山7-7基因直接由人工合成；所述的基因的序列包括在序列表SEQID No 1中，該SEQ ID No 1的序列為兩端帶有Mlul、spel酶切位點(diǎn)的Z麗Za7_7基因；以上兩端帶有Mlul、spel酶切位點(diǎn)的為W-7基因由生工生物有限公司合成并連接在puc57 質(zhì)粒上，以puc57-質(zhì)粒的形式購(gòu)買得到；
所述的為山7-7基因是玉米基因組中的一個(gè)類似于擬南芥植物中的DAl基因中的 ZmDAl基因的突變形式；所述的基因的序列在Gene Bank的編號(hào)為BT085014. I。所述的ZmdaH基因的序列是將ZmDAl基因的cDNA的開放閱讀框第998個(gè)堿基由G變?yōu)锳，使得第333個(gè)氨基酸由精氨酸(R)變成賴氨酸(K)。所述的基因共包括11個(gè)外顯子，10個(gè)內(nèi)含子。所述的為山7-7基因也可以在玉米基因組中克隆得到；
II、植物表達(dá)載體(PGM-35Sbar- Zmdal-I質(zhì)粒載體)的構(gòu)建
A、將基因連接到PGreen0229質(zhì)粒載體，得到35Sbar-PGreen0229質(zhì)粒載體；
先將puc57-35Sbar質(zhì)粒用SacI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，回收得到帶有酶切位點(diǎn)的
基因；再將PGreen0229質(zhì)粒載體用SacI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，回收得到大小約為 4451bp的片段；之后將所述的帶有酶切位點(diǎn)的35Sbar基因和大小約為4451bp的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，得到35Sbar- PGreen0229質(zhì)粒載體；
所述的帶有SacI酶切位點(diǎn)的基因35Sbar的序列為序列表中SEQ ID No :I ;所述的基因35Sbar由生工生物有限公司合成并連接在puc57質(zhì)粒上，以puc57_35Sbar質(zhì)粒的形式購(gòu)買得到；
B、將Mxs基因連接到所述的35Sbar_PGreen0229質(zhì)粒載體，得到Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體；
先將puc57-NOS質(zhì)粒用Hind IILcspI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，回收得到帶有酶切位點(diǎn)的 Nos基因；再將所述的35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體用Hind III、cspl內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，回收得到大小約為5804bp的片段；之后將所述的帶有酶切位點(diǎn)的艙S基因和大小約為 5804bp的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，得到Nos- 35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體；
所述的帶有HindlILcspI酶切位點(diǎn)基因Mxs的序列為序列表中SEQ ID No 2 ;所述的基因Ab1S由生工生物有限公司合成并連接在puc57質(zhì)粒上，以puc57-Nos質(zhì)粒的形式購(gòu)買得到；
C、將現(xiàn)￠/基因連接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到UBQI-Nos-35Sbar -PGreen0229 質(zhì)粒載體；
先將puc57-UBQI質(zhì)粒用Hind III內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，回收得到帶有酶切位點(diǎn)的UBQI 基因；再將所述的Nos-35Sbar _ 6代6110229質(zhì)粒載體用把11(1111內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，回收得到大小約為5695bp的片段；之后將所述的帶有酶切位點(diǎn)的現(xiàn)￠/基因和大小約為5695bp 的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，得到UBQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體；
所述的帶有HindIII酶切位點(diǎn)的基因UBQI的序列為序列表中SEQ ID No 3 ;所述的基因UBQI由生工生物有限公司合成并連接在puc57質(zhì)粒上，以UBQI- puc57質(zhì)粒的形式購(gòu)買得到；
D、將所述的Z麗Za7-7基因連接到所述的UBQI-Nos-35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體，得到 PGM_35Sbar- Zmdal-I 質(zhì)粒載體；
先將puc57- Zmdal-I質(zhì)粒用Mlul、spel內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，回收得到帶有酶切位為、飽 Zmdal-I 基因；再將所述的 UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229 質(zhì)粒載體用 Mlul、spel 內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，回收得到大小約為7678 bp的片段；之后將所述的帶有酶切位點(diǎn)的 Zmdal-I基因和大小約為7678bp的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PGM_35Sbar_ Zmdal-I質(zhì)粒載體，即植物表達(dá)載體；
所述的基因由生工生物有限公司合成并連接在puc57質(zhì)粒上,所述的Z〃 t/a7-7 基因兩端帶有酶位點(diǎn)Mlul、spel,以puc57-質(zhì)粒的形式購(gòu)買得到；
上述構(gòu)建植物表達(dá)載體的酶切反應(yīng)中，酶切體系為10Xbuffer 2iU ;內(nèi)切酶2iil (雙酶切時(shí)，兩種內(nèi)切酶各Iu 1)，質(zhì)粒10iil，ddH20 ；6u I ;于371反應(yīng)3小時(shí)；
上述構(gòu)建植物表達(dá)載體的連接反應(yīng)中，連接體系為10Xbuffer :lyl，分子量大的片段i y I，
分子量小的片段7iil，T4DNA連接酶liil ;16°C連接過夜；
以上使用的各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶均購(gòu)自Takara公司。圖I為所述的植物表達(dá)載體的圖譜。將所述的植物表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理、振蕩培養(yǎng)處理、質(zhì)粒提取處理、酶切反應(yīng)， 驗(yàn)證所述的植物表達(dá)載體構(gòu)建正確。所述的轉(zhuǎn)化處理為取所述的植物表達(dá)載體5 ill加入100 U I大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 a感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上放置30分鐘；再42°C熱激45秒，冰上放置2分鐘； 再加入500iilLB無抗培養(yǎng)基，于37°C轉(zhuǎn)速150rpm振蕩培養(yǎng)I小時(shí)；再以轉(zhuǎn)速4000rpm 離心5分鐘，用槍吸掉400 u I左右上清液，余下的用涂布棒涂布在含50mg/L的卡那霉素 (Kan)的養(yǎng)基上；再于37°C過夜培養(yǎng)，得到單菌落；
所述的振蕩培養(yǎng)處理為挑取分別上述生長(zhǎng)出的單菌落，加入LB液體培養(yǎng)基，37°C過夜振蕩培養(yǎng)；
所述的質(zhì)粒提取處理為將上述過夜振蕩培養(yǎng)的菌液用寶生物工程(大連)有限公司的 DV801A型質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取處理，得到所述的植物表達(dá)載體。所述的酶切反應(yīng)為將所述的植物表達(dá)載體用內(nèi)切酶Mlul、spel 進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到酶切產(chǎn)物，酶切體系與步驟II中相同；
將所述的酶切產(chǎn)物進(jìn)行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳；
圖2為所述的植物表達(dá)載體酶切產(chǎn)物電泳圖；泳道M中為全式金Trans 15K DNA marker，泳道1_2中為酶切產(chǎn)物，條帶由上至下分別為約7678bp的大片段和約1538bp的小片段；由于電泳時(shí)膠孔中酶切產(chǎn)物濃度過大，電泳時(shí)間過長(zhǎng)，所以所述的約7678bp的大片段未完全到達(dá)期望中的位置，僅有所述的約1538bp的小片段完全到達(dá)期望中的位置。
III、將所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入玉米中，待玉米果穗成熟時(shí)收獲，得到TO代種子；所述的轉(zhuǎn)化方法為花粉管通道法；所述的花粉管通道法包括以下步驟
A、在玉米開花期時(shí)，選擇發(fā)育正常的植株進(jìn)行套袋授粉處理；
B、在所述的授粉處理后22 23h內(nèi)，對(duì)玉米植株的花穗進(jìn)行修剪處理；
該修剪處理的操作為先將玉米植株的雌穗上的紙袋摘下，用剪刀剪去大約距離穗軸頂端I 2cm的花絲和苞葉，保持花絲切面平齊，并使苞葉內(nèi)的花絲略高于苞葉；
C、然后用一次性針管在上述修剪處理形成的切口處滴注200-210u I濃度為500 ng/ U I的所述的植物表達(dá)載體的溶液，立即重新套上紙袋，記錄轉(zhuǎn)化的時(shí)間；所述的植物表達(dá)載體的溶液用無菌ddH20配制；
所述的玉米的品種為自交系吉444。IV、將所述的TO代種子培養(yǎng)成為TO代幼苗，再將所述的TO代幼苗經(jīng)過篩選處理， 得到TO代抗性植株；再將所述的TO代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)、PCR-Southern blotting 檢測(cè)、RT-PCR檢測(cè)，證明所述的Z麗&7-7基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入所述的TO代抗性植株中；所述的培養(yǎng)的溫度為夜間20-23攝氏度，白天27-28攝氏度，濕度為40_50%，光照強(qiáng)度為3300-3500 Ix ;培養(yǎng)基為蛭石和常規(guī)市售的君子蘭營(yíng)養(yǎng)土(體積比為I :1)的混合培養(yǎng)基；
A、篩選處理
當(dāng)所述的TO代幼苗處于4葉期時(shí)，通過200mg/L的草苷膦(Sigma 45520)篩選處理所述的幼苗TO代幼苗，獲得所述的TO代抗性植株；其中，所述的TO代抗性植株生長(zhǎng)正常，TO 代非抗性植株葉片枯黃；所述的篩選處理為將200mg/L的草苷膦溶液噴灑在TO代幼苗的葉片的表面，每5天進(jìn)行一次，共進(jìn)行3次；
B、PCR檢測(cè)
為了確定所述的基因和所述的基因已經(jīng)整合進(jìn)上述玉米吉444自交系基因組中，對(duì)所述的TO代抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)；
a.當(dāng)最后一次所述的篩選處理完成2周后，從所述的TO代抗性植株的葉片中提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板；所述的葉片的葉齡為3-4天；該提取采用Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega)試劑盒,具體步驟按照該試劑盒的說明書進(jìn)行；
b.將所述的基因組DNA分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
檢測(cè)35Sbar基因的引物為
PGreen0229-35Sbar-F-470 : 5’ - ACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC -3’， PGreen0229-35Sbar-R-810 : 5’ - TCAACTGTCCAATCGTAAGCGTTCC -3’ ；
檢測(cè)Zmdal-I基因的引物為
Zmdal-l-F-324 5’ -TATGTATCATCCGCCTCG-3’，
Zmdal-l-R-621 : 5’ - GGTGAAACTGCTCCTTGTA -3’ ；
以上的引物由上海生工公司合成；
以上2個(gè)PCR反應(yīng)體系均為
50 u I 體系中，包括模板I ii I，10XPCR reaction buffer :5 y 1，dNTP :4 y 1，引物 Iul (濃度為 10iimol/l), Taq DNA polymerase (TaKaRa) :0. 25 U I, ddH20 :余量；
以上35Sbar基因PCR反應(yīng)程序?yàn)?br> 94°C預(yù)變性6min ;94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min, 18°C保存；
\)丄Al Zindal-I基因PCR反應(yīng)程序?yàn)?br> 94°C預(yù)變性6min ;94°C變性30s，53。。退火30s，72。。延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min, 18°C保存；
將所述的PGM-35Sbar- Zmdal-I質(zhì)粒載體為模板在相同條件下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為陽(yáng)性對(duì)照，以相同培養(yǎng)條件相同葉齡的未轉(zhuǎn)基因的玉米自交系吉444的基因組DNA為模板在相同條件下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為陰性對(duì)照。將上述各個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果如下圖3中，泳道M DL2000marker (TaKaRa),泳道H ddH20,泳道I 陰性對(duì)照，泳道P 陽(yáng)性對(duì)照，泳道L1-L9 T0代抗性植株的DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；陽(yáng)性對(duì)照和部分轉(zhuǎn)基因植株 (L2-L9)均擴(kuò)增出所述的35Sbar基因中的340bp左右的目的片段。圖4中，泳道M :DL2000marker (TaKaRa )，泳道H : ddH20，泳道I :陰性對(duì)照，泳道 L2-L9 T0代抗性植株的DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；由于基因存在于玉米基因組中，擴(kuò)增 Zmdal-I基因的上游引物定位于基因的第三個(gè)外顯子，下游引物位于基因的第五個(gè)外顯子，所以未轉(zhuǎn)基因的植株和轉(zhuǎn)基因植株均會(huì)擴(kuò)增出大小約為2209bp的目的片段；由于基因僅存在于轉(zhuǎn)基因植株中，所以未轉(zhuǎn)基因的植株不會(huì)擴(kuò)增出大小約為 297bp的目的片段，而轉(zhuǎn)基因植株會(huì)擴(kuò)增出大小約為297bp的目的片段。L2-L9中的擴(kuò)增產(chǎn)物均能得到約為2209bp、297bp的目的條帶。C、PCR-Southern blotting 檢測(cè)
為了進(jìn)一步證明為W-7基因確實(shí)轉(zhuǎn)入玉米基因組中，對(duì)上述結(jié)果呈陽(yáng)性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(L2-L9)進(jìn)行 PCR-southern blotting 檢測(cè)；
分別取5 u I上述結(jié)果呈陽(yáng)性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(L2-L9)進(jìn)行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳，再將電泳得到的條帶進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理，轉(zhuǎn)至尼龍膜(Amersham);探針為所述的PGM_35Sbar_ Zmdal-I質(zhì)粒載體PCR反應(yīng)后的擴(kuò)增產(chǎn)物；探針標(biāo)記和雜交檢測(cè)按照Roche公司的Roche DIG DNA Labeling and Detection Kit II試劑盒的方法進(jìn)行，得到的雜交信號(hào)由FLA4000 型突光圖像分析儀(Fuji)進(jìn)行分析。圖5為部分上述PCR-southern blotting檢測(cè)結(jié)果； 圖5中，泳道H :ddH20,泳道P 陽(yáng)性對(duì)照，泳道I :陰性對(duì)照，泳道L2-L9 :結(jié)果呈陽(yáng)性的TO代抗性植株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；轉(zhuǎn)基因植株中含有帶為W-7基因的PGM-35Sbar- Zmdal-I質(zhì)粒載體，能夠擴(kuò)增得到大小約為297 bp和2209 bp的雜交信號(hào)條帶，未轉(zhuǎn)入為W-7基因的植株只能擴(kuò)增得到大小約為2209 bp的雜交信號(hào)條帶；L2、L6、L8、L9、HO中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能同時(shí)得到大小約為297 bp和2209 bp的雜交信號(hào)條帶。D、RT-PCR 檢測(cè)
對(duì)以上PCR-Southern blotting陽(yáng)性植株(L2、L6、L8、L9、L10對(duì)應(yīng)的)進(jìn)行cDNA提取處理，得到該P(yáng)CR-Southern blotting陽(yáng)性植株的cDNA,該cDNA提取處理采用TaKaRa公司的PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time試劑盒及其說明書中的方法；
再以該cDNA為模板，分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到該P(yáng)CR-Southern blotting陽(yáng)性植株的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
檢測(cè)Zmdal-I基因的引物為
Zmdal-l-F-324 5’ -TATGTATCATCCGCCTCG-3’，
Zmdal-l-R-621 : 5’ - GGTGAAACTGCTCCTTGTA -3’ ；
檢測(cè)JCT基因(內(nèi)參)的引物為
ACT-F 5，-ACCTCACCGACCACCTAAT-3，，
ACT-R :5’ -CTGAACCTTTCTGACCCAAT-3’
所述的JCT基因?yàn)橛衩譨di/7基因(GenBank登錄號(hào)J01238)，在本實(shí)施例中用于內(nèi)參。以上的引物由上海生工公司合成；
以上2個(gè)PCR反應(yīng)體系均為
850 u I 體系中，包括模板0. 25 ii I，10XPCR reaction buffer 5u I, dNTP:4iil，引物ly I (濃度為 10 u mol/1), Taq DNA polymerase (TaKaRa) :0. 25 U I, ddH20 :余量；
以上擴(kuò)增為W-i基因dCT基因PCR反應(yīng)程序均為
94°C預(yù)變性6min ;94°C變性30s，53。。退火30s，72。。延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min, 18°C保存；
以上PCR反應(yīng)均重復(fù)3次，得到相似的結(jié)果。再將以上陽(yáng)性植株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行I. 2%瓊脂糖凝膠電泳，并采用AlphaView SA 軟件分析電泳結(jié)果；
以上RT-PCR反應(yīng)用于檢測(cè)所述的基因和為W-7基因在常規(guī)條件下生長(zhǎng)的未轉(zhuǎn)基因的植株和轉(zhuǎn)入為山7-7基因的植株中是否已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。預(yù)期中，所述的7〃 伽7基因和 Zmdal-I基因均應(yīng)該在轉(zhuǎn)入為W-7基因的植株中表達(dá)，以上RT-PCR的檢測(cè)并不能分辨出此2基因的表達(dá)，所以將JCT基因用于內(nèi)參，分析未轉(zhuǎn)基因的植株和轉(zhuǎn)入ZmcM-I基因的植株中ZmDAl基因和Zmdal-I基因的mRNA表達(dá)的區(qū)別。圖6中包括4張電泳圖，其中，從上至下前3 HZmdaH基因的每次重復(fù)反應(yīng)的 PCR擴(kuò)增結(jié)果，第4張是JCT基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果A}dtM:DL2000 marker (TaKaRa)，泳道 I :陰性對(duì)照，泳道 L2、L6、L8、L9、L10 =PCR-Southern blotting 陽(yáng)性植株 RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。 圖7為PCR-Southern blotting陽(yáng)性植株的為伽7基因表達(dá)量示意圖。由圖6、圖7所示， “吉444”自交系未轉(zhuǎn)基因的植株(陰性對(duì)照沖基因的表達(dá)量為低水平，轉(zhuǎn)入基因的植株中基因的表達(dá)量比未轉(zhuǎn)基因的植株中基因的表達(dá)量高133%-208%。 以上說明在轉(zhuǎn)入Zmdal-I基因的植株中玉米啟動(dòng)子ubiquitin驅(qū)動(dòng)Zmdal-I基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。因?yàn)檗D(zhuǎn)入基因的TO代植株為雜合體，所以預(yù)期中當(dāng)轉(zhuǎn)入基因的植株是純合子時(shí)，為山7-7基因的表達(dá)量更高。E、轉(zhuǎn)入為W-7基因的植株百粒重檢測(cè)。浪為轉(zhuǎn)尺Zmckl-I基因的植株經(jīng)過了 3次200毫克/升的除草劑的篩選，生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)慢于未經(jīng)過除草劑篩選的植株，所以在本實(shí)驗(yàn)中將12株生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)入U(xiǎn)BQI-Nos-35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體(未帶有Z麗Za7_7基因，僅帶有35S如r基因)的“吉444”玉米自交系植株作為對(duì)照植株(CK)。由于基因組的位置效應(yīng)，不同的轉(zhuǎn)基因的植株表現(xiàn)出不同的表達(dá)量，所以它們對(duì)于除草劑有不同的抗性。所述的TO代抗性植株中，共有14株正常生長(zhǎng)并正常結(jié)籽(分別編號(hào)為Zmdal-1-4、 Zmdal-1-6、Zmdal-1-8、Zmdal-1-9、Zmdal-l-lO、
Zmdal-l-ll、 Zmdal-1-12、 Zmdal-1-14、 Zmdal-1-16、 Zmdal-1-18、 Zmdal-1-19、 Zmdal-l-20、Zmdal-l-21、Zmdal-l-22、)，共生長(zhǎng)出16個(gè)玉米果穗，其他的植株由于除草劑的作用結(jié)籽極少。如圖8所示,一些轉(zhuǎn)入Zmhl-I基因的植株，如Zmdal-I-Il號(hào)和Zmdal-1-16號(hào)， 能夠生長(zhǎng)出2個(gè)玉米果穗，其他的能夠生長(zhǎng)出一個(gè)玉米果穗。如下表所示，轉(zhuǎn)入基因的植株收獲的種子的每百粒重量中的最低的 (Zmdal-1-16號(hào))，是對(duì)照植株的收獲的種子的每百粒重量的109. 9% -MkZmdal-I基因的植株收獲的種子的每百粒重量中的最高的(Zmdal-1-21號(hào))是對(duì)照植株的收獲的種子的每百粒重量的186. 5%基因的植株收獲的種子的每百粒重量平均是對(duì)照植株的收獲的種子的每百粒重量133. 6%。不同的轉(zhuǎn)入基因的植株之間收獲的種子重量差別較大，可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因的位置效應(yīng)導(dǎo)致除草劑對(duì)植株的傷害不同，以及基因表達(dá)的水平不同造成的，但是轉(zhuǎn)入^山7-7基因的植株收獲的種子重量都高于對(duì)照植株收獲的種子重量。以上結(jié)果說明為山7-7基因的表達(dá)能夠顯著增加種子的重量(P〈0. 01)。根據(jù)玉米果穗重量的數(shù)據(jù)，除Zmdal-1-8號(hào)的玉米穗重量?jī)H為對(duì)照植株的54. 1%外，大多數(shù)轉(zhuǎn)入 Zmdal-I基因的植株的玉米穗重量大于對(duì)照植株。轉(zhuǎn)入為山7-7基因的植株的平均玉米果穗重量增長(zhǎng)為對(duì)照植株的125. 0%。以上結(jié)果說明為山7-7基因的表達(dá)能夠調(diào)控玉米作物的產(chǎn)量。
權(quán)利要求
1.一種提高玉米籽粒產(chǎn)量的培養(yǎng)方法，其特征在于該方法是構(gòu)建植物表達(dá)載體將 Zmdal-I基因轉(zhuǎn)化玉米基因組中；所述的Z麗&7-7基因的序列包括在序列表SEQ ID No 1 中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提高玉米籽粒產(chǎn)量的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為PGreen0229質(zhì)粒載體，所述的植物表達(dá)載體帶有啟動(dòng)子UBQI基因、基因的開放閱讀框，所述的植物表達(dá)載體的標(biāo)記基因?yàn)榭钩輨┑娜鐁基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高玉米籽粒產(chǎn)量的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法為k、、備35Sbar基因連接到PGreen0229質(zhì)粒載體，得到35Sbar- PGreen0229質(zhì)粒載體；B、將Mxs基因連接到所述的35Sbar_PGreen0229質(zhì)粒載體，得到Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體；C、將現(xiàn)￠/基因連接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到UBQI-Nos-35Sbar -PGreen0229 質(zhì)粒載體；D、將所述的Z麗&7-7基因連接到所述的UBQI-Nos-35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體，得到所述的植物表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提高玉米籽粒產(chǎn)量的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的基因的序列包括在序列表SEQ ID No :2中；所述的Mxs基因的序列包括在序列表SEQ ID No 3中；所述的UBQI基因的序列包括在序列表SEQ ID No :4中。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的提高玉米籽粒產(chǎn)量的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化方法為花粉管通道法。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提高玉米籽粒產(chǎn)量的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的花粉管通道法包括以下步驟A、在玉米開花期時(shí)，選擇發(fā)育正常的植株進(jìn)行套袋授粉處理；B、在所述的套袋授粉處理后22-23小時(shí)內(nèi)，對(duì)玉米植株的花穗進(jìn)行修剪處理；C、在上述修剪處理的形成的切口處滴注200-210μ I濃度為500 ng/ μ I的所述的植物表達(dá)載體的溶液，之后重新套袋。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提高玉米籽粒產(chǎn)量的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的玉米的品種為自交系吉444。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種提高玉米籽粒產(chǎn)量的培養(yǎng)方法，該方法是構(gòu)建植物表達(dá)載體將Zmda1-1基因通過花粉管通道法轉(zhuǎn)化玉米基因組中。所述的Zmda1-1基因是玉米基因組中的一個(gè)類似于擬南芥植物中的DA1基因中的ZmDA1基因的突變形式。本發(fā)明利用Zmda1-1基因潛在的改變植物器官的大小的特性、UBQI啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Zmda1-1基因的表達(dá)，構(gòu)建植物表達(dá)載體將Zmda1-1基因轉(zhuǎn)入玉米基因組中，能夠?qū)mda1-1基因提高玉米籽粒產(chǎn)量的潛力變?yōu)榍袑?shí)可行的成熟方案；該植物表達(dá)載體的出發(fā)載體是具有生物安全性的PGreen0229質(zhì)粒載體，對(duì)環(huán)境友好，避免轉(zhuǎn)基因植物對(duì)生態(tài)的影響；本發(fā)明直接將含有目的DNA的植物表達(dá)載體溶液直接轉(zhuǎn)入玉米中，不依賴于玉米的組培再生體系，所以無需昂貴儀器，生產(chǎn)成本低廉。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102586318SQ20121001942
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月21日
發(fā)明者吳忠義, 張秀海, 李春華, 梁宏霞, 王霄漢, 程曦, 羅昌, 黃叢林 申請(qǐng)人:北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心