專利名稱：依非韋倫肝細胞毒性分子標志物及其應用的制作方法
依非韋倫肝細胞毒性分子標志物及其應用技術領域
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及依非韋倫(efavirenz，EFV)肝細胞毒性分子標志物及其應用，具體涉及D-3-磷酸甘油脫氫酶在制備檢測肝細胞毒性分子標志物中的用途。
背景技術：
艾滋病全稱為“獲得性免疫缺陷綜合征”(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)。截至2010年底，我國確診艾滋病病毒感染者和病人約37萬，其中2010 年新發(fā)艾滋病人數(shù)15982例，給我國政治和經(jīng)濟造成極大的影響。高效聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(Highly Active Antiretroviral Therapy,HAART)是目前治療艾滋病最主要的方案， 是改善患者預后，提高患者生存質(zhì)量的主要途徑。目前有如下5類藥物可供臨床選擇:核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)、非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)、蛋白酶抑制劑(PI)、整合酶抑制劑及融合抑制劑。其中NNRTI類藥物有3個:依非韋倫(efavirenZ，EFV)、奈韋拉平 (nevirapine, NVP)和地拉韋啶(delavirdine)。依非韋倫EFV為國際艾滋病治療指導方針推薦的非核苷類(NNRTI)首選藥物，聯(lián)合2個核苷類(NRTI)藥物可作為抗HIV感染的一線治療方案。但是EFV耐藥屏障低[1]，HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶(RT)單一位點突變株對依非韋倫耐藥，為此臨床和科研工作者進行大量的病毒耐藥基因檢測工作；此外，EFV有較嚴重的肝損，皮膚過敏反應和神經(jīng)系統(tǒng)毒性U2。隊列研究1顯示:EFV治療導致8.0%肝損傷(312個入選患者)，NVP治療肝損傷的比率為15.6% (256例入選)。結核3、病毒性肝炎及聯(lián)合應用蛋白酶抑制劑(PD會增加肝損傷的比率。
人體CYP2B6代謝酶的多態(tài)性是EFV肝毒性的一個重要原因。Katsounas A等4 對576艾滋病患者進行依非韋倫EFV血藥濃度檢測，發(fā)現(xiàn)EFV的濃度在1000-4000ng/mL之間能較好的控制HIV，超過4000ng/mL容易引起肝毒性。對于基因型為CYP2B6*6/6*或者 *6/26*的患者均出現(xiàn)516位的G變?yōu)門(516G- > T)，EFV的代謝減慢，導致血藥濃度高達 6000ng/mL,出現(xiàn)神經(jīng)毒性和肝毒性。當藥物劑量被減少到400或200mg/天(標準劑量為 600mg/天)時，癥狀得到緩解5。
根據(jù)最新研究，另一個重要原因是EFV即使在臨床濃度仍然能誘導細胞凋亡。EFV 能降低線粒體膜通透性、提高過氧化物等的產(chǎn)生、導致線粒體質(zhì)量提高；EFV抑制O2消耗， 降低細胞內(nèi)ATP的水平；EFV誘導細胞自吞。尋找線粒體凋亡過程中的變化分子，將能為EFV 肝毒性的預警提供標識分子。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供依非韋倫肝細胞毒性分子標志物及其應用，具體涉及 D-3-磷酸甘油脫氫酶在制備檢測肝細胞毒性分子標志物中的用途。
本發(fā)明通過蛋白質(zhì)組學的方法在依非韋倫(EFV)肝細胞毒性模型中發(fā)現(xiàn)NADH脫氫酶為與肝毒性成正相關的蛋白質(zhì)，經(jīng)定量PCR和免疫印跡實驗從mRNA和蛋白質(zhì)的水平驗證了該蛋白質(zhì)的表達。本發(fā)明實驗結果顯示，D-3-磷酸甘油 脫氫酶可用作檢測EFV肝細胞毒性的分子標志。
本發(fā)明通過建立肝毒性的細胞模型，利用蛋白質(zhì)組學方法篩選在依非韋倫EFV處理致線粒體毒性和未經(jīng)處理的肝細胞中差異表達的蛋白質(zhì)，結果顯示了與肝細胞毒性正相關的蛋白質(zhì)(在EFV處理組中高表達)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定確定為D-3-磷酸甘油脫氫酶；進一步的熒光定量PCR和免疫印跡實驗證實，該蛋白質(zhì)在不同濃度的EFV處理組中均比未經(jīng)處理的高表達，且該D-3-磷酸甘油脫氫酶與EFV肝細胞毒性呈正相關。本發(fā)明結果表明，以該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本作為一個分子標志對其轉(zhuǎn)錄水平進行定量檢測可用作檢測EFV肝細胞毒性。
本發(fā)明的另一個目的在于提供D-3-磷酸甘油脫氫酶特異性的引物與抗體(包括單克隆抗體和多克隆抗體)，用于制備檢測EFV肝細胞毒性制劑。
本發(fā)明的再一個目的在于提供一種D-3-磷酸甘油脫氫酶的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，用于制備檢測EFV肝細胞毒性的試劑盒。
本發(fā)明的進一步目的在于提供一種體外檢測EFV肝細胞毒性細胞中D-3-磷酸甘油脫氫酶表達是否異常的方法，該方法包括以下步驟:
A、用特異性抗體或者定量PCR技術檢測待檢肝細胞中D-3-磷酸甘油脫氫酶的數(shù)量;
B、將步驟A所得到的數(shù)量與正常肝細胞中D-3-磷酸甘油脫氫酶的數(shù)量進行比較， 如測得的高于正常值，則表示被檢樣本中D-3-磷酸甘油脫氫酶的表達異常。
本發(fā)明提供了以D-3-磷酸甘油脫氫酶作為一個分子標志對其表達水平進行檢測可以用于檢測EFV肝細胞毒性。進一步的可用于制備檢測EFV肝毒性的制劑或試劑盒等， 本發(fā)明的D-3-磷酸甘油脫氫酶與EFV肝細胞毒性的相關性將為EFV肝毒性的診斷和/或治療提供一條全新的途徑。
下面結合具體附圖和實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些附圖和實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。


圖1:二維凝膠電泳顯示D-3-磷酸甘油脫氫酶的表達量(EFV代表未處理的肝細胞，2.5代表2.5 μ g/L的EFV處理，10代表10 μ g/L的EFV處理；圓圈所指處代表D-3-磷酸甘油脫氫酶所在的位置。
圖2:D-3-磷酸甘油脫氫酶的熒光定量PCR，
EFV代表未處理的肝細胞，2.5代表2.5 μ g/L的EFV處理，10代表10 μ g/L的EFV 處理，GAPDH為內(nèi)參對照。
圖3中顯示了 D-3-磷酸甘油脫氫酶在EFV處理的肝細胞中有較高水平的表達。
具體實施方式
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件參考《分子克隆實驗指南》(第三版，冷泉港出版社)中所 述的條件或者制造廠商的建議條件。
本發(fā)明以不同濃度的EFV刺激肝癌細胞系，通過檢測ROS的量來監(jiān)測線粒體的凋亡情況，收集未處理和2.5 μ g/L以及10 μ g/L的EFV處理I小時的肝癌細胞，裂解獲得細胞蛋白質(zhì)后，以蛋白質(zhì)二維凝膠電泳的方法分離蛋白質(zhì)，通過ImageMaster軟件分析表達差異的蛋白質(zhì)，并對所獲得的差異蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜鑒定，結果顯示，D-3-磷酸甘油脫氫酶在 EFV處理的兩組樣品中均高表達；熒光定量PCR實驗進一步證實D-3-磷酸甘油脫氫酶在 EFV處理的肝細胞中的高表達。
實驗結果表明，以D-3-磷酸甘油脫氫酶作為一個指標對其表達量進行檢測可以用來檢測EFV肝毒性，即D-3-磷酸甘油脫氫酶可作為EFV肝毒性的分子標志。
實施例1制備未處理和EFV處理的肝細胞線粒體蛋白質(zhì)樣品
本實施例中所使用的細胞培養(yǎng)基DMEM購自Invitrogen公司，葡聚糖T500、聚乙二醇3350、尿素、硫脲、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙銨]-1-丙橫酸(CHAPS)均購自Sigma公司，EFV購自美國藥典(U.S Pharmacopeia)。
本實施例用不同濃度的EFV處理，于不同的時間進行ROS的檢測，結果顯示，ROS 的產(chǎn)生量與EFV成時間和濃度依賴性(如圖1所示)，本實施例選定2.5 μ g/L和10 μ g/L 的EFV處理肝癌細胞(Huh7) I小時的細胞進行實驗:收集細胞勻漿破碎，用雙水相離心的方法分離線粒體，將獲得的線粒體加入裂解緩沖液(8mol/L尿素、4% CHAPS,65mmol/L DTT, 2mol/L硫尿、I % NP-40,0.5mmol/L PMSF、I % DNA酶)，在冰上作用30min，再在室溫下孵育 30min，用Bradford法測定裂解得到的蛋白質(zhì)含量后，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> 實施例2篩選差異表達蛋白質(zhì)
本實施例中所使用的丙烯酰胺、N, N'-亞甲基雙(丙烯酰胺)、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三輕甲基氨基甲燒(Tris)、尿素、甘油購自美國Amresco公司，過硫酸胺 (AP)、TEMED 購自 Bio-Rad。
將裂解得到的蛋白質(zhì)通過二維凝膠電泳的方法分離，通過ImageMaster 2D Platinum 6.0軟件分析，獲得差異表達的蛋白質(zhì)，并對所獲得的差異蛋白質(zhì)用戴安納升級液相色譜Ultimate3000串聯(lián)高容量離子阱質(zhì)譜(LC-MS/MS)進行分離鑒定。具體步驟如下:
雙向凝膠電泳的第一向等電聚焦電泳采用pH 3 10非線性膠條，電泳程序設置:水化 30V，12h ;電泳:500V, Ih ；1000V, Ih ;8000V，30min，梯度;8000V，5h，線性;總功率達44千瓦，第二向十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，分離膠濃度為11.5%,電泳結束,剝膠,考馬斯亮藍染膠，Image scanner掃描儀成像,用ImageMaster 2D Platinum 6.0軟件將電泳圖譜分成2個類別進行找點、匹配等分析，找出差異蛋白質(zhì)點。
取差異蛋白質(zhì)點脫色脫水凍干后,每管中加入約5μ L胰酶(0.02μ g/μ L)。37 °C 酶解過夜(16 18h)，酶解后的樣品先經(jīng)過C18預柱(300yL idx5mm,5ym)脫鹽，流速為 20μ L/min，流動相為2% ACN，0.1% FA。然后以300nL/min的流速經(jīng)C-18反向柱(75 μ m id X 15cm length, 3 μ m, PepMapTM)進行分離,色譜的梯度為4-48%,梯度時間為40min。 通過C18色譜柱分離的肽段由納流噴針進入HCT質(zhì)譜進行實時的離子化分析檢測；HCT質(zhì)譜每秒鐘進行一次一級掃描和5次二級掃描分析。
用DataAnalysis 3.2軟件整合肽指紋圖譜和串聯(lián)質(zhì)譜二級圖譜,通過Mascot 軟件查詢SwissProt數(shù)據(jù)庫；MS誤差:±0.6Da，MS/MS誤差:1.2Da.固定修飾是半胱氨酸被修飾為脲甲基半胱氨酸(Carbamidomethyl-Cys),可 變修飾為甲硫氨酸氧化 (Oxidation (M))，每個肽段允許有I個不完全裂解位點，離子選擇(+1，+2，+3)，模式為:單同位素，置信區(qū)間為95%，P < 0.05，蛋白質(zhì)得分36分以上結果可靠。
鑒定獲得12種非冗余蛋白質(zhì)在EFV處理和未處理組中差異表達，其中包括在EFV 處理組(肝細胞毒性)中高表達的蛋白質(zhì)D-3-磷酸甘油脫氫酶(如圖2所示)，考馬斯亮藍染色的雙向凝膠電泳顯示D-3-磷酸甘油脫氫酶在纖維化過程中表達下調(diào)(如圖2所示:6、9代表酒精性肝纖維化的不同時間點，N代表組織來源于正常肝臟，A代表組織來源于肝纖維化肝臟，圓圈代表膜聯(lián)蛋白A3所在的位置)。
表I為質(zhì)譜分析獲得的膜聯(lián)蛋白A3的鑒定結果。
表I
權利要求
1.D-3-磷酸甘油脫氫酶在制備肝細胞毒性分子標志物中的用途。
2.按權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝細胞毒性分子標志物是抗艾滋病病毒藥物依非韋倫肝細胞毒性預警的蛋白質(zhì)分子標記或藥物靶標。
3.按權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的檢測肝細胞毒性分子標志物是檢測 D-3-磷酸甘油脫氫酶蛋白在肝細胞中的表達量。
4.按權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的D-3-磷酸甘油脫氫酶蛋白在肝細胞中的表達量是檢測該蛋白在肝細胞中轉(zhuǎn)錄是否存在上調(diào)。
5.D-3-磷酸甘油脫氫酶在制備檢測依非韋倫肝細胞毒性制劑中的用途，所述制劑中包括D-3-磷酸甘油脫氫酶特異性的引物和抗體。
6.D-3-磷酸甘油脫氫酶在制備檢測依非韋倫肝細胞毒性試劑盒中的用途，所述試劑盒中包括D-3-磷酸甘油脫氫酶特異性抗體。
7.如權利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述抗D-3-磷酸甘油脫氫酶的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
8.—種體外檢測EFV肝細胞毒性細胞中D-3-磷酸甘油脫氫酶表達是否異常的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:A、用特異性抗體或者定量PCR技術檢測待檢肝細胞中D-3-磷酸甘油脫氫酶的數(shù)量；B、將步驟A所得到的數(shù)量與正常肝細胞中D-3-磷酸甘油脫氫酶的數(shù)量進行比較，如測得的高于正常值，則表示被檢樣本中D-3-磷酸甘油脫氫 酶的表達異常。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及依非韋倫(EFV)肝細胞毒性分子標志物及其應用，尤其涉及D-3-磷酸甘油脫氫酶在制備檢測肝細胞毒性分子標志物中的用途。本發(fā)明通過肝毒性的細胞模型，用蛋白質(zhì)組學方法篩選以及熒光定量PCR和免疫印跡實驗，獲得與肝細胞毒性正相關的蛋白質(zhì)D-3-磷酸甘油脫氫酶；該蛋白質(zhì)在不同濃度的EFV處理組中均比未經(jīng)處理的高表達，且該D-3-磷酸甘油脫氫酶與EFV肝細胞毒性呈正相關。本發(fā)明結果表明，以該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本作為一個分子標志對其轉(zhuǎn)錄水平進行定量檢測可用作檢測EFV肝細胞毒性。所述的D-3-磷酸甘油脫氫酶特異性的引物與抗體可用于制備檢測EFV肝細胞毒性制劑，和制備檢測EFV肝細胞毒性的試劑盒。
文檔編號C12Q1/32GK103215341SQ20121001884
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月20日 優(yōu)先權日2012年1月20日
發(fā)明者張麗軍, 馬芳, 賈小芳, 周宏灝 申請人:中南大學, 上海市公共衛(wèi)生臨床中心