專利名稱：一種誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞工程技術(shù)，涉及一種促進(jìn)干細(xì)胞神經(jīng)分化的體外誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)系統(tǒng)難治性疾病多由于神經(jīng)系統(tǒng)損傷導(dǎo)致大量神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的缺失，傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞缺乏再生能力，無法產(chǎn)生新的神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系，神經(jīng)損傷不可逆轉(zhuǎn)。而近年來研究發(fā)現(xiàn)，將干細(xì)胞移植到病損或受傷的腦組織中，可產(chǎn)生新的神經(jīng)細(xì)胞， 從結(jié)構(gòu)及功能上對神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)和改善。干細(xì)胞尤其是成體干細(xì)胞作為一種新型的生物治療方法是醫(yī)學(xué)發(fā)展史上一個開創(chuàng)性的探索。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是存在于骨髓、外周血和臍血等組織中的一類具有自我更新及跨胚層分化能力的干細(xì)胞，體外研究發(fā)現(xiàn)，MSCs在特定的誘導(dǎo)環(huán)境下可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，動物實驗也顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存活并能分化為有功能的神經(jīng)樣細(xì)胞[I]。MSCs取材和體外擴增方便，不受倫理學(xué)的限制，具有免疫耐受的優(yōu)勢，體內(nèi)移植易于控制，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療帶來了新的希望。 如何提高M(jìn)SCs的神經(jīng)分化效率及功能替代作用是MSCs用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的關(guān)鍵。
目前，MSCs體外定向成神經(jīng)誘導(dǎo)有化學(xué)誘導(dǎo)法、神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)法、神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)法等，這些方法均可實現(xiàn)對MSCs的定向成神經(jīng)誘導(dǎo)，但各有優(yōu)劣。其中，Woodbury化學(xué)誘導(dǎo)法是目前常用的誘導(dǎo)大鼠MSCs成神經(jīng)分化的方法，MSCs在體外各種化學(xué)誘導(dǎo)劑及生長因子培養(yǎng)條件下向神經(jīng)樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率高達(dá)50%-90%，但分化后的細(xì)胞多只證實具有神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及表面標(biāo)志的表達(dá)，是否具有成熟的神經(jīng)細(xì)胞功能還鮮有報道，且誘導(dǎo)后的神經(jīng)樣細(xì)胞極易發(fā)生調(diào)亡，存活時間短。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法，能有效促進(jìn)干細(xì)胞神經(jīng)分化。
本發(fā)明的另外一個目的在于提供一種表達(dá)相關(guān)神經(jīng)標(biāo)志蛋白，并具有神經(jīng)元細(xì)胞功能的神經(jīng)樣細(xì)胞。
本發(fā)明的目的是通過以下措施實現(xiàn)的一種誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法，其特征在于使用全反式維甲酸(all-trans-Retinoic Acid, ATRA)作為誘導(dǎo)劑，改良神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(modified neuronal induction medium, MNM)作為培養(yǎng)基處理干細(xì)胞。
為了更有效的促進(jìn)干細(xì)胞神經(jīng)分化，所述ATRA的濃度優(yōu)選為lyM。更優(yōu)選地，所述ATRA誘導(dǎo)時間為24小時。
進(jìn)一步地，為了提高干細(xì)胞向神經(jīng)元定向分化的分化率和存活率，所述MNM的配方為 2%DMS0，200 u M BHA, 25mM KCL, 2mM 丙戊酸，8uM forsklin, I u M 氫化可的松和 5 y g/ ml胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)液。分化率能達(dá)到86%，存活率能達(dá)到近100%。
更進(jìn)一步地，所述干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。具體的說，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源于大鼠。
上述誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法，其特征在于由以下步驟組成1.分離培養(yǎng)及鑒定原代大鼠MSCs2.誘導(dǎo)原代大鼠MSCs分化加入ATRA進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)24小時，再加入MNM誘導(dǎo)24小時。
上述誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法，其特征在于由以下步驟組成I.分離培養(yǎng)及鑒定原代大鼠MSCs :取SPF級4 8周齡SD大鼠，取股骨，5ml空針吸取DMEM/F12反復(fù)沖洗骨髓腔及干垢端，離心去上清，加DMEM/F12/10%FBS/1%青鏈霉素完全培養(yǎng)基吹打，按3X IO6個/瓶的濃度接種在底面積25cm2的的塑料培養(yǎng)瓶中，置于37°C， 5%C02濕化孵箱中培養(yǎng)，24小時后傾去上清液及未貼壁細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)液。隨后每3天換液。細(xì)胞融合度達(dá)80%后胰蛋白酶消化離心，按I :2或I :3的濃度傳代，3-5代細(xì)胞用于實驗。流式細(xì)胞技術(shù)檢測⑶106、⑶90、⑶45、⑶34等干細(xì)胞標(biāo)志。
2. MSCs神經(jīng)誘導(dǎo)方案的優(yōu)化MSCs以3X 105/ml濃度接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿或細(xì)胞孔板中，6-8小時細(xì)胞貼壁后加入終濃度為0-100 ii M的ATRA進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo),24小時后全量換液去除預(yù)誘導(dǎo)液，D-hank’ s洗細(xì)胞2_3次，盡量去除殘留血清，加入MNM誘導(dǎo)24小時。 光鏡下觀察細(xì)胞存活情況及神經(jīng)樣細(xì)胞的形態(tài)，計算神經(jīng)分化效率。Real-time PCR檢測神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)水平，胎盤藍(lán)染色實驗檢測分化后神經(jīng)樣細(xì)胞的存活率，確定最佳誘導(dǎo)方案。
3.誘導(dǎo)后神經(jīng)樣細(xì)胞的鑒定免疫熒光檢測NESTIN、NES、MAP-2、NF等神經(jīng)元標(biāo)志 GFAP、⑶68、BNDF等神經(jīng)表面標(biāo)志。全細(xì)胞膜片鉗檢測細(xì)胞靜息電位，鈣影像測定KCl刺激后細(xì)胞的胞內(nèi)鈣離子濃度變化。
一種具有一定神經(jīng)元功能的神經(jīng)樣細(xì)胞，由上述誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法制得。
本發(fā)明的有益效果I.本發(fā)明誘導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的效率提高22. 66%，干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化后的存活率提高12. 58%，同時具有較高的分化率和存活率。
2.本發(fā)明誘導(dǎo)干細(xì)胞更容易向神經(jīng)元而不是膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞分化，分化后的神經(jīng)樣細(xì)胞更具有神經(jīng)元功能。為神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育研究提供了一個較好的體外模型，為干細(xì)胞用于臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供強有力的依據(jù)。


圖I是原代大鼠MSCs的細(xì)胞形態(tài)1.光鏡，2. H. E染色(100X)圖2是流式細(xì)胞技術(shù)檢測第3代MSCs的干細(xì)胞表面標(biāo)志⑶106，⑶90，⑶45，⑶34 圖3是MSCs經(jīng)不同濃度ATRA預(yù)誘導(dǎo)24小時再MNM神經(jīng)誘導(dǎo)24小時的神經(jīng)樣細(xì)胞光鏡4是MSCs經(jīng)不同濃度ATRA預(yù)誘導(dǎo)后MNM神經(jīng)誘導(dǎo)24小時NESTIN，NSE, MAP-2的 real-time PCR 檢測5是MSCs分化的神經(jīng)樣細(xì)胞的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志NESTIN，NSE，MAP-2， GFAP，CD68 RT-PCR 檢測6是MSCs分化的神經(jīng)樣細(xì)胞的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志4NESTIN, NSE, MAP-2,⑶NF的免疫熒光檢測7是I ii M ATRA預(yù)誘導(dǎo)聯(lián)合MNM誘導(dǎo)MSCs成神經(jīng)樣細(xì)胞過程中NETIN、NSE表達(dá)的 Western blot 檢測8是MSCs及誘導(dǎo)后神經(jīng)樣細(xì)胞的細(xì)胞靜息膜電位比較9是MSCs及誘導(dǎo)后神經(jīng)樣細(xì)胞的胞內(nèi)鈣離子濃度比較10是MSCs及誘導(dǎo)后神經(jīng)樣細(xì)胞的8分鐘動態(tài)跟蹤340nm/380nm熒光強度比值圖
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述本發(fā)明內(nèi)容對本發(fā)明做出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
本發(fā)明實施例中的試劑藥品未做具體說明的均為普通市售，材料方法未做具體說明的均參考《分子克隆實驗指南》(Sambrook和Russell, 2001)實施例I第一步，分離培養(yǎng)及鑒定原代大鼠MSCs :取SPF級4 8周齡SD大鼠，無菌條件下取股骨，5ml空針吸取DMEM/F12反復(fù)沖洗骨髓腔及干垢端，離心去上清，加DMEM/F12/10%FBS/1% 青鏈霉素完全培養(yǎng)基吹打，按3xl06個/瓶的濃度接種在25cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，置于 370C，5%C02濕化孵箱中培養(yǎng)，24小時后傾去上清液及未貼壁細(xì)胞，換液后，可見rMSCs呈散在的細(xì)胞集落樣生長，細(xì)胞個體呈扁平梭形，集落中央的細(xì)胞形態(tài)較圓，集落邊緣的細(xì)胞為扁平梭形。4 5天左右細(xì)胞數(shù)量明顯增加，集落逐漸擴大。6 7天細(xì)胞基本鋪滿瓶底，形態(tài)較均一呈梭形且呈漩渦狀生長(見圖I)。傳代細(xì)胞均勻分布，生長迅速，約3 4 天可鋪滿瓶底，細(xì)胞多呈梭形，漩渦狀生長。MSC傳至第3代，流式細(xì)胞技術(shù)檢測大鼠MSCs 的細(xì)胞表面標(biāo)志取接近融合的第3代MSCs，用胰酶消化后，PBS洗滌3次，制成IXlO6/ ml的單細(xì)胞懸液。取100 u I細(xì)胞懸液5管a管為標(biāo)準(zhǔn)對照，加IgGl-FITC單克隆抗體， b管加⑶34-FITC單克隆抗體，c管加⑶45-PE單克隆抗體，d管加⑶90-PE單克隆抗體，e 管加CD106-PE單克隆抗體，室溫反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀(FACSCanto TM II system, BD Biosciences)檢測。CellQuest Pro software (BD Biosciences)分析結(jié)果顯不99% 以上的MSC表達(dá)⑶106、⑶90，幾乎不表達(dá)⑶45和⑶34 (見圖2)，提示分離獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞純度較高，且沒有骨髓造血干細(xì)胞混雜。
第二步，不同濃度ATRA預(yù)誘導(dǎo)聯(lián)合MNM對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)分化的作用 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)神經(jīng)分化采用3-5代的MSCs，初始密度為50%接種于培養(yǎng)瓶或24孔板，DMEM/F12/10%FBS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，4_5小時細(xì)胞貼壁后分別加入終濃度為0. 01,0. I、I、10、IOOii M的ATRA，預(yù)誘導(dǎo)24小時后，棄去完全培養(yǎng)基，D_hank’ s液洗細(xì)胞兩次，加入 MNM 神經(jīng)誘導(dǎo)液(含 2% DMS0, 200 剛 BHA, 20 mM KCL, I. 6 mM 丙戊酸，8 剛 Forskolin, 0. 8 m氫化可的松，4 ^g/ml胰島素的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基)誘導(dǎo)細(xì)胞24小時，無ATRA預(yù)誘導(dǎo)，僅MNM神經(jīng)誘導(dǎo)24小時設(shè)為對照組。
光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，計算分化效率加入預(yù)誘導(dǎo)液24小時內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變。更換MNM誘導(dǎo)后在倒置顯微鏡下觀察，誘導(dǎo)I小時即可見部分細(xì)胞胞體開始收縮， 折光性增強，并逐漸伸出突起，向神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，隨時間推移，細(xì)胞胞體收縮更加明顯， 突起增多增長。預(yù)誘導(dǎo)的ATRA濃度在0.01-10 ii M范圍內(nèi)，ATRA濃度越高，神經(jīng)樣細(xì)胞分化效率越高，呈雙極或多極神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)，神經(jīng)元胞體直徑越大，軸突更長(圖3，表1，* p〈0. 05)。IOOMm ATRA預(yù)誘導(dǎo)處理的MSC神經(jīng)分化迅速，但24小時大部分細(xì)胞死亡，無法計算神經(jīng)分化效率。
誘導(dǎo)后神經(jīng)樣細(xì)胞的存活率在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察各誘導(dǎo)階段細(xì)胞狀態(tài)，未經(jīng)ATRA預(yù)誘導(dǎo)的細(xì)胞24小時后可觀察到部分神經(jīng)元表型細(xì)胞逐漸脫壁、漂浮、死亡，36小時大部分神經(jīng)樣細(xì)胞死亡。臺盼藍(lán)染色計算細(xì)胞存活率胰酶消化貼壁細(xì)胞，收集貼壁及漂浮細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，并作適當(dāng)稀釋。細(xì)胞懸液與0. 08%臺盼藍(lán)溶液以I: I混合混勻，加 IOul細(xì)胞混合液入計數(shù)板,鏡下觀察,藍(lán)色為死細(xì)胞,拒染呈無色透明狀為據(jù)染的活細(xì)胞。 在三分鐘內(nèi)，分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。計算細(xì)胞存活率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù) +死細(xì)胞總數(shù))X 100%。ATRA預(yù)誘導(dǎo)濃度在0. 01-1 u M，神經(jīng)樣細(xì)胞24小時的存活率明顯增高，而ATRA濃度高于10 u M后，神經(jīng)樣細(xì)胞的死亡率反而高于未預(yù)誘導(dǎo)組(見圖3，表1， * p〈0. 05)。
下表(表I)是不同濃度ATRA預(yù)誘導(dǎo)24小時再MNM神經(jīng)誘導(dǎo)24小時后MSC的神經(jīng)分化效率，神經(jīng)元胞體直徑，軸突長度和細(xì)胞死亡率(*P〈0. 05 vs MNM單獨培養(yǎng)組)
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法，其特征在于使用全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)作為誘導(dǎo)劑，改良神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(modified neuronal induction medium, MNM)作為培養(yǎng)基處理干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法，其特征在于所述ATRA的濃度優(yōu)選為I u M。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法，其特征在于所述ATRA誘導(dǎo)時間為24小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法，其特征在于所述MNM的配方為 2%DMS0, 200 u M BHA, 25mM KCL, 2mM 丙戊酸，8 y M forsklin, I u M 氫化可的松和 5 u g/ml 胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法，其特征在于所述干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法，其特征在于所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源于大鼠。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法，其特征在于由以下步驟組成(1)分離培養(yǎng)及鑒定原代大鼠MSCs；(2)誘導(dǎo)原代大鼠MSCs分化加入ATRA進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)24小時，再加入MNM(含 2%DMS0，200 ii M BHA,25mM KCL，2mM 丙戊酸，8 y M forsklin, IuM 氫化可的松和 5 u g/ml胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)液)誘導(dǎo)24小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法，其特征在于由以下步驟組成(1)分離培養(yǎng)及鑒定原代大鼠MSCs-M SPF級4 8周齡SD大鼠，取股骨，5ml空針吸取DMEM/F12反復(fù)沖洗骨髓腔及干垢端，離心去上清，加DMEM/F12/10%FBS/1%青鏈霉素完全培養(yǎng)基吹打，按3X IO6個/瓶的濃度接種在底面積25cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，置于37°C， 5%C02濕化孵箱中培養(yǎng)，24小時后傾去上清液及未貼壁細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)液；隨后每3天換液；細(xì)胞融合度達(dá)80%后胰蛋白酶消化離心，按I :2或I :3的濃度傳代，3-5代細(xì)胞用于實驗；流式細(xì)胞技術(shù)檢測⑶106、⑶90、⑶45、⑶34等干細(xì)胞標(biāo)志；(2)MSCs神經(jīng)誘導(dǎo)方案的優(yōu)化MSCs以3X 106/ml濃度接種于在底面積25cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)皿或細(xì)胞孔板中，6 8小時細(xì)胞貼壁后加入終濃度為0-100 ii M的ATRA進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo),24小時后全量換液去除預(yù)誘導(dǎo)液，D-hank’s洗細(xì)胞2_3次，盡量去除殘留血清， 加入 MNM (含 2%DMS0, 200 y M BHA，25mM KCL，2mM 丙戊酸，8 y M forsklin，I y M 氫化可的松和5 u g/ml胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)液)誘導(dǎo)24小時；光鏡下觀察細(xì)胞存活情況及神經(jīng)樣細(xì)胞的形態(tài)，計算神經(jīng)分化效率；Real-time PCR檢測神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)水平，臺盼藍(lán)染色實驗檢測分化后神經(jīng)樣細(xì)胞的存活率，確定最佳誘導(dǎo)方案；(3)誘導(dǎo)后神經(jīng)樣細(xì)胞的鑒定免疫熒光檢測NESTIN、NES、MAP-2、NF等神經(jīng)元標(biāo)志 GFAP,⑶68、BNDF等神經(jīng)表面標(biāo)志；全細(xì)胞膜片鉗檢測細(xì)胞靜息電位，鈣影像測定KCl刺激后細(xì)胞的胞內(nèi)鈣離子濃度變化。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法制得的具有一定神經(jīng)元功能的神經(jīng)樣細(xì)胞，由上述誘導(dǎo)干細(xì)胞神經(jīng)分化的方法制得。
全文摘要
本發(fā)明使用全反式維甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)作為誘導(dǎo)劑，改良神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(modifiedneuronalinductionmedium,MNM)作為培養(yǎng)基處理干細(xì)胞，能有效促進(jìn)干細(xì)胞神經(jīng)分化，提高分化率和存活率，制備更具神經(jīng)元功能的神經(jīng)樣細(xì)胞，為神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育研究提供了一個較好的體外模型，為干細(xì)胞用于臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供強有力的依據(jù)。
文檔編號C12N5/0775GK102533647SQ20121000181
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者張贇, 李廷玉, 畢楊, 陳潔, 魏小平, 龔敏 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院