用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝，其中在液化過(guò)程中存在和/或添加熱穩(wěn)定性α-淀粉酶和任選的熱穩(wěn)定性蛋白酶。本發(fā)明亦涉及適用于本發(fā)明的工藝的組合物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝。本發(fā)明亦涉及適用于本發(fā)明的工藝的組合物。
[0002]涉及序列表
[0003]本發(fā)明包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，其通過(guò)提述并入本文。
[0004]發(fā)明背景
[0005]從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇在本領(lǐng)域是公知的。在產(chǎn)業(yè)上，目前使用兩種不同種類(lèi)的工藝。最常用的工藝，通常稱(chēng)作“常規(guī)工藝”，包括通常使用細(xì)菌α-淀粉酶在高溫液化糊化的淀粉，然后在葡糖淀粉酶和發(fā)酵生物的存在下進(jìn)行同步糖化和發(fā)酵(SSF)。另一種公知的工藝，通常稱(chēng)作“生淀粉水解”工藝(RSH工藝)，包括在起始糊化溫度以下，通常在酸性真菌α -淀粉酶和葡糖淀粉酶的存在下，同時(shí)糖化和發(fā)酵粒狀淀粉。
[0006]雖然在過(guò)去十年中發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生工藝顯著改善，但顯著量的剩余淀粉物質(zhì)并未轉(zhuǎn)化為所需的發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇。至少一些未轉(zhuǎn)化的剩余淀粉物質(zhì)例如糖和糊精為不可發(fā)酵的Maillard產(chǎn)物的形式。
[0007]因此，仍然存在對(duì)提供下述用于從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇的工藝的需要，所述工藝可與常規(guī)工藝相比提供更高的發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉 及使用發(fā)酵生物從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇的工藝。本發(fā)明亦涉及適用于本發(fā)明的工藝的組合物。
[0009]在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇的工藝，其包括下述步驟:
[0010]i)在80至90°C范圍的溫度在4.5至5.0范圍的pH使用下述來(lái)液化含淀粉材料:
[0011]-0-淀粉酶，其在？!14.5，851:，0.121111 CaCl2 具有至少 10 的 T 1/2 (min)；
[0012]-任選地，蛋白酶，其具有超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性值，所述熱穩(wěn)定性值是作為800C /70°C的相對(duì)活性確定的；
[0013]ii)使用糖源生成酶進(jìn)行糖化；
[0014]iii)使用發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟i)的液化過(guò)程中存在和/或添加糖源生成酶，特別是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶，和/或普魯蘭酶(pulIulanase)。
[0016]在一個(gè)第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及組合物，其包含α-淀粉酶和蛋白酶，其中
[0017]i)所述 α -淀粉酶在 ρΗ4.5，85。。，0.12mM CaCl2 具有至少 10 的 T 1/2 (min);和
[0018]ii)所述蛋白酶具有作為80°C /70°C的相對(duì)活性確定的超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性值。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含糖源生成酶，特別是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶，和/或普魯蘭酶。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，在液化步驟i)過(guò)程中存在和/或添加第二 α -淀粉酶。[0021 ] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及組合物，其包含:
[0022]i) α -淀粉酶，其在 pH4.5，85°C，0.12mM CaCl2 具有至少 10 的 T l/2(min)，來(lái)源于嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophi lus)；
[0023]ii)蛋白酶，其具有超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性值，所述熱穩(wěn)定性值是作為80°C /70°C的相對(duì)活性確定的，且該蛋白酶來(lái)源于激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和/或橙橘嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus);和任選的
[0024]iii)葡糖淀粉酶,其來(lái)源于草酸青霉(Penicillium oxalicum)
[0025]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含第二 α -淀粉酶。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1顯示用α-淀粉酶1407、并且用或不用蛋白酶Pfu或葡糖淀粉酶ΡΕ001，在ΡΗ4.8制備的用于液化(85°C )的54小時(shí)的乙醇的比較。
[0027]圖2顯示對(duì)于實(shí)施例10中的實(shí)驗(yàn)在32%DS的峰值和斷裂粘度(breakviscosity),其比較了
[0028]- α -淀粉酶 A(l.4 微克)(ρΗ5.8)；
[0029]- α -淀粉酶1407 (1.4微克)+葡糖淀粉酶ΡΕ001 (10微克)+蛋白酶196 (I微克)(ρΗ4.8)；
[0030]- α -淀粉酶A (0.35微克)+ α -淀粉酶1407 (1.4微克)+葡糖淀粉酶ΡΕ001 (10微克)+蛋白酶196 (I微克)(ρΗ4.8)；
[0031 ] - α -淀粉酶A (0.7微克)+ α -淀粉酶1407 (1.4微克)+葡糖淀粉酶ΡΕ001 (10微克)+蛋白酶196(1微克)(ρΗ4.8)；
[0032]圖3顯示了對(duì)于實(shí)施例10中的實(shí)驗(yàn)在32°C在32%DS的最終粘度，其比較了:
[0033]- α -淀粉酶 A(l.4 微克)(ρΗ5.8)；
[0034]- α -淀粉酶1407 (1.4微克)+葡糖淀粉酶ΡΕ001 (10微克)+蛋白酶196 (I微克)(ρΗ4.8)；
[0035]- α -淀粉酶A (0.35微克)+ α -淀粉酶1407 (1.4微克)+葡糖淀粉酶ΡΕ001 (10微克)+蛋白酶196 (I微克)(ρΗ4.8)；
[0036]- α -淀粉酶A (0.7微克)+ α -淀粉酶1407 (1.4微克)+葡糖淀粉酶ΡΕ001 (10微克)+蛋白酶196(1微克)(ρΗ4.8).[0037]圖4顯示了對(duì)于實(shí)施例10中的實(shí)驗(yàn)在32%DS的峰值和斷裂粘度，其比較了 α -淀粉酶八(1.4微克)(?!15.8)和α-淀粉酶A (1.4微克)+葡糖淀粉酶ΡΕ001 (10微克)+蛋白酶 196(1 微克)(ρΗ4.8)。
[0038]圖5顯示了對(duì)于實(shí)施例10中的實(shí)驗(yàn)在32°C在32%DS的最終粘度，比較了 α -淀粉酶八(1.4微克)(?冊(cè).8)和α-淀粉酶Α(1.4微克)+葡糖淀粉酶PEOOldO微克)+蛋白酶196(1微克)(?財(cái).8).[0039]發(fā)明詳述
[0040]本發(fā)明涉及使用發(fā)酵生物從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇的工藝。本發(fā)明亦涉及適用于本發(fā)明的工藝的組合物。
[0041]本發(fā)明人顯示了本發(fā)明的工藝具有多種優(yōu)點(diǎn)。如實(shí)施例中所示，本發(fā)明的工藝導(dǎo)致較高的乙醇產(chǎn)率。其它益處包括對(duì)使用H2SO4調(diào)整pH的需求減少。這導(dǎo)致DDGS中的下游的硫更少，前端沾污(front end fouling)更少，啤酒石(beerstone)更少，且植酸沉淀更少。
[0042]本發(fā)明的工藝亦導(dǎo)致糖和糊精損失為Maillard產(chǎn)物的減少。DDGS的顏色得到改善，且熱交換器壽命(較少的固體)得到延長(zhǎng)。此外，由于所用的酶的較高熱穩(wěn)定性，可減少酶劑量。本發(fā)明的工藝僅需對(duì)現(xiàn)存工藝和工藝設(shè)備進(jìn)行有限的變化，因此僅需有限的資金投入。
[0043]由于在液化中存在如本文中定義的熱穩(wěn)定性α-淀粉酶和第二 α-淀粉酶，(進(jìn)一步)減少了例如衆(zhòng)料罐(slurry tank)中的峰值粘度。這導(dǎo)致混合消耗的能量減少。而且，具有較低的平均粘度可改善漿料罐中醪/淀粉的混合，及其在整個(gè)液化工藝中的抽運(yùn)(pumping)。[0044]在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝，其包括下述步驟:
[0045]i)在80°C至90°C范圍的溫度、4.5至5.0范圍的pH使用下述酶來(lái)液化含淀粉材料:
[0046]- α -淀粉酶，其在 ρΗ4.5，85°C，0.12mM CaCl2 具有至少 10 的 T 1/2 (min)；
[0047]-任選的蛋白酶，其具有超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性值，所述熱穩(wěn)定性值是作為800C /70°C的相對(duì)活性確定的；
[0048]ii)使用糖源生成酶進(jìn)行糖化；
[0049]iii)使用發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵。
[0050]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟ii)和iii)順序或同時(shí)進(jìn)行。在液化步驟i)之前和/或之中可添加熱穩(wěn)定性α -淀粉酶，和任選的熱穩(wěn)定性蛋白酶，以及任選的糖源生成酶，優(yōu)選熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶，和/或任選的普魯蘭酶。熱穩(wěn)定性α-淀粉酶的實(shí)例可見(jiàn)于下文“在液化過(guò)程中存在和/或添加的α-淀粉酶”部分。熱穩(wěn)定性蛋白酶的實(shí)例可見(jiàn)于下文“在液化過(guò)程中存在和/或添加的蛋白酶”部分。本發(fā)明的組合物可合適地在本發(fā)明的工藝中使用。然而亦可分別添加酶組分。
[0051]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在液化過(guò)程中的pH為4.5至4.8。
[0052]在一個(gè)實(shí)施方案中，在液化過(guò)程中亦存在糖源生成酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述糖源生成酶是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述糖源生成酶不同于在步驟?)中的糖化和/或步驟iii)中的發(fā)酵過(guò)程中使用的糖源生成酶。
[0053]“糖源生成酶”的實(shí)例，包括特別是葡糖淀粉酶，可見(jiàn)于下文“在液化過(guò)程中存在和/或添加的糖源生成酶”部分。熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶的實(shí)例可見(jiàn)于下文“在液化過(guò)程中存在和/或添加的葡糖淀粉酶”部分。
[0054]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的工藝進(jìn)一步在步驟i)之前包括下述步驟:
[0055]a)降低含淀粉材料的粒度,優(yōu)選通過(guò)干磨；
[0056]b)形成包含含淀粉材料和水的漿料。
[0057]所述含淀粉材料如全谷粒可通過(guò)例如磨制減小粒度以打開(kāi)其結(jié)構(gòu)并允許進(jìn)一步的加工。通常存在兩種方法，濕磨和干磨。在干磨中，將整粒磨碎并使用。濕磨提供胚和粗粉(淀粉顆粒和蛋白質(zhì))的良好分離，并通常用于使用淀粉水解物產(chǎn)生例如糖漿的地方。干磨和濕磨在淀粉加工領(lǐng)域是已知的。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選干磨。在一個(gè)實(shí)施方案中，粒度減少至約0.05到3.0mm,優(yōu)選0.1-0.5mm,或使得至少30%，優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少70%，甚至更加優(yōu)選至少90%的含淀粉材料可穿過(guò)具有0.05到3.0mm篩目(screen),優(yōu)選0.1到0.5mm篩目的篩。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少50%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，特別是至少90%的含淀粉材料可穿過(guò)具有#6篩目的篩。
[0058]水性漿料可含有10_55w/w%干固形物(DS)，優(yōu)選25_45w/w%干固形物(DS)，更優(yōu)選30-40w/w%干固形物(DS)的含淀粉材料。將漿料加熱到糊化溫度以上，優(yōu)選80至90°C，ρΗ4.5至4.8，進(jìn)行約15至60分鐘。
[0059]可將熱穩(wěn)定性α-淀粉酶，任選的熱穩(wěn)定性蛋白酶和任選的糖源生成酶，特別是熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶，和/或任選的普魯蘭酶添加至所述水性漿料以起始液化(稀化(thinning))。在一個(gè)實(shí)施方案中,僅將一部分酶共混物(本發(fā)明的組合物)添加至所述水性漿料，而將剩余的酶在液化步驟i)過(guò)程中添加。液化步驟i)通常在80至90°C，pH4.5至4.8進(jìn)行I至3小時(shí)。
[0060]在一個(gè)實(shí)施方案中，在進(jìn)行步驟(a)中的液化之前，所述水性漿料可經(jīng)噴射蒸煮(jet-cooked)以進(jìn)一步使衆(zhòng)料糊化。所述噴射蒸煮可在110至145°C,優(yōu)選120至140°C,如125至135°C，優(yōu)選約130°C的溫度進(jìn)行約I至15分鐘，優(yōu)選約3至10分鐘，特別是約5
分鐘左右。
[0061]糖化和發(fā)酵
[0062]在糖化步驟ii)和/或發(fā)酵步驟iii)過(guò)程中存在和/或添加一種或多種糖源生成酶，特別是葡糖淀粉酶。所述糖源生成酶可優(yōu)選為葡糖淀粉酶，但亦可為選自下組的酶:β -淀粉酶，產(chǎn)麥芽糖淀粉酶和α -葡糖苷酶。
[0063]糖源生成酶包括葡糖淀粉酶的實(shí)例，可見(jiàn)于下文“在糖化和/或發(fā)酵過(guò)程中存在和/或添加的糖源生成酶”部分。
[0064]當(dāng)進(jìn)行順序糖化和發(fā)酵時(shí)，糖化步驟ii)可使用本領(lǐng)域中公知的條件進(jìn)行。舉例而言，糖化步驟ii)可持續(xù)約24至約72小時(shí)，然而經(jīng)常僅在30至65°C，通常約60°C的溫度進(jìn)行通常40至90分鐘的預(yù)糖化，接著在同步糖化和發(fā)酵(“SSF”)中在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行糖化。糖化通常在20至75°C，優(yōu)選40至70°C，通常60°C左右的溫度，和在4至5的pH，正常約PH4.5進(jìn)行。
[0065]同步糖化和發(fā)酵(“SSF”)廣泛用于產(chǎn)業(yè)規(guī)模的發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生工藝，特別是乙醇產(chǎn)生工藝。當(dāng)進(jìn)行SSF時(shí)，糖化步驟ii)和發(fā)酵步驟iii)同時(shí)進(jìn)行。對(duì)于糖化無(wú)保持階段，意指發(fā)酵生物如酵母和酶可一同添加。SSF根據(jù)本發(fā)明通常在25°C至40°C，約28°C至35°C，如30°C至34°C，優(yōu)選大約32°C左右的溫度進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵進(jìn)行6至120小時(shí)，特別是24至96小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，pH為3.5至5，特別是3.8至4.3。
[0066]發(fā)酵培養(yǎng)基
[0067]發(fā)酵培養(yǎng)基("Fermentationmedia"或"fermentation medium")指其中進(jìn)行發(fā)酵的環(huán)境，并包括發(fā)酵底物，即由發(fā)酵生物代謝的糖源。發(fā)酵培養(yǎng)基可包含對(duì)于發(fā)酵生物的營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)刺激物。營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)刺激物廣泛用于發(fā)酵領(lǐng)域，并包括氮源如氨；尿素、維生素和礦物質(zhì)，或其組合。
[0068]發(fā)酵牛物[0069]術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵生物”指任何適用于發(fā)酵工藝并能夠產(chǎn)生所需發(fā)酵產(chǎn)物的生物，包括細(xì)菌生物和真菌生物。特別合適的發(fā)酵生物能夠?qū)⑻?，如葡萄糖或麥芽糖，直接或間接發(fā)酵即轉(zhuǎn)化為所需的發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇。發(fā)酵生物的實(shí)例包括真菌生物，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種(Saccharomyces spp.)特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisia)的菌株。
[0070]在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述發(fā)酵生物添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中從而使得每ml發(fā)酵培養(yǎng)基中活的發(fā)酵生物如酵母計(jì)數(shù)為IO5至1012，優(yōu)選IO7至101°的范圍內(nèi)，特別是約5xl07。[0071 ] 商業(yè)上可獲得的酵母包括，例如RED STAR?和ETHANOL RED?酵母(可從Fermentis/Lesaffre, USA 獲得),FALI (可從 Fleischmann，s Yeast, USA 獲得),SUPERSTART和 THERMOSACC?新鮮酵母(可從Ethanol Technology, WI, USA獲得)，B10FERM AFT和 XR (可從 NABC-North American Bioproducts Corporation, GA, USA 獲得)，GERT STRAND (可從Gert Strand AB, Sweden 獲得)和 FERM10L (可從 DSM Specialties 獲得)。
[0072]含淀粉材料
[0073]根據(jù)本發(fā)明，可使用任何合適的含淀粉材料。起始材料通?；谒璧陌l(fā)酵產(chǎn)物而選擇。適用于本發(fā)明的工藝的含淀粉材料的實(shí)例包括全谷粒、玉米、小麥、大麥、黑麥、買(mǎi)羅高粱、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻、豌豆類(lèi)(peas)、豆類(lèi)(beans)或甘薯，或其任意混合物，或從其來(lái)源的淀粉，或谷類(lèi)。亦涵蓋蠟質(zhì)和非蠟質(zhì)類(lèi)型的玉米和大麥。
[0074]發(fā)酵產(chǎn)物
[0075]術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵產(chǎn)物”意指由包括使用發(fā)酵生物的發(fā)酵步驟的工藝產(chǎn)生的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明涵蓋的發(fā)酵產(chǎn)物包括醇(例如乙醇，甲醇，丁醇)；有機(jī)酸(例如檸檬酸，乙酸，衣康酸，乳酸，琥珀酸，葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；氣體(例如4和CO2);抗生素(例如青霉素和四環(huán)素)；酶；維生素(例如核黃素，B12, β-胡蘿卜素)；和激素。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中`，所述發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇，例如，燃料乙醇；飲用乙醇，即可飲用的中性酒；或工業(yè)乙醇或在可消費(fèi)醇類(lèi)工業(yè)(例如啤酒和葡萄酒)、乳制品工業(yè)(例如發(fā)酵乳制品)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)中使用的產(chǎn)品。優(yōu)選的啤酒類(lèi)型包括愛(ài)兒啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、缽爾透啤酒(porter)、陳忙啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麥芽酒(maltliquor)、發(fā)泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcoholbeer)、低熱量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。所用的優(yōu)選發(fā)酵工藝包括醇類(lèi)發(fā)酵工藝。根據(jù)本發(fā)明獲得的發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇，可優(yōu)選地用作燃料，其通常與汽油混合。然而，在乙醇的情況下，其亦可用作可飲用的乙醇。
[0076]
[0077]在發(fā)酵之后，可將發(fā)酵產(chǎn)物從發(fā)酵培養(yǎng)基分離?？烧麴s發(fā)酵培養(yǎng)基以提取所需發(fā)酵產(chǎn)物，或可通過(guò)微濾或膜過(guò)濾技術(shù)從發(fā)酵培養(yǎng)基提取所需發(fā)酵產(chǎn)物。或者，發(fā)酵產(chǎn)物可通過(guò)汽提或其它本領(lǐng)域公知的方法來(lái)回收。
[0078]在液化過(guò)程中存在和/或添加的α -淀粉酶
[0079]根據(jù)本發(fā)明，在液化過(guò)程中存在和/或添加熱穩(wěn)定性α-淀粉酶，熱穩(wěn)定性α-淀粉酶任選地與熱穩(wěn)定性蛋白酶，和任選地與糖源生成酶，優(yōu)選熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶，和/或任選地與普魯蘭酶一同存在和/或添加。根據(jù)本發(fā)明，α -淀粉酶在ΡΗ4.5至5.0的液化中對(duì)淀粉溶解具有高活性，且在ΡΗ4.5至5.0和80°C至90°C，優(yōu)選pH4.5至4.8，85°C左右具有聞熱穩(wěn)定性。[0080]更具體而言，用于本發(fā)明的工藝的α -淀粉酶，如實(shí)施例1中所述確定，在ρΗ4.5，85。。，0.12mM CaCl2 具有至少 10 的 T 1/2 (min)。
[0081]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在pH4.5，85°C，0.12mM CaCl2的T 1/2 (min)為至少15，如至少20，如至少25，如至少30，如至少40，如至少50，如至少60，如10-70，如15-70，如20-70，如 25-70，如 30-70，如 40-70，如 50-70，如 60-70。
[0082]在一個(gè)實(shí)施方案中所述熱穩(wěn)定性α -淀粉酶是嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶變體，其與公開(kāi)于WO 99/019467的SEQ ID NO:3的多肽或本文中的SEQ ID NO:1的成熟部分具有至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少93%，最優(yōu)選至少94%，和甚至最優(yōu)選至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的同一性。
[0083]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中所述α -淀粉酶是細(xì)菌α _淀粉酶，優(yōu)選來(lái)源于芽孢桿菌屬(Bacillus)，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌株，特別是如作為SEQ ID N0:3公開(kāi)于WO 99/019467或本文中的SEQ ID NO:1的嗜熱脂肪芽孢桿菌，其具有雙重缺失I181+G182和取代N193F，進(jìn)一步包括下述突變:
[0084]
【權(quán)利要求】
1.一種用于從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝，其包括下述步驟: i)在80至90°C范圍的溫度、4.5至5.0范圍的pH使用下述來(lái)液化含淀粉材料: -α -淀粉酶，其在 pH4.5、85°C、0.12mM CaCl2 具有至少 10 的 T 1/2 (min)； -任選的蛋白酶，其具有超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性值，所述熱穩(wěn)定性值是作為80°C /70°C的相對(duì)活性確定的； ?)使用糖源生成酶進(jìn)行糖化； iii)使用發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵。
2.權(quán)利要求1的工藝，其中所述α-淀粉酶是細(xì)菌α -淀粉酶，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus) α -淀粉酶的變體，例如本文中SEQ ID NO:1所不的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的變體，特別地，所述嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶是截短的，優(yōu)選截短為具有大約491個(gè)氨基酸。
3.權(quán)利要求2的工藝，其中所述α-淀粉酶變體與本文中的SEQID NO:1的成熟部分具有至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少93%，最優(yōu)選至少94%，以及甚至最優(yōu)選至少95%，例如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的同一性。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的工藝，所述α-淀粉酶來(lái)源于嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，其截短為具有大約491個(gè)氨基酸，并具有選自下組的突變:
-1181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S ；
-1181*+G182*+N19 3F+E129V+K177L+R179E ;和
-1181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的工藝，其中在液化步驟i)過(guò)程中添加第二α-淀粉酶。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的工藝，其包括下述步驟: i)在80至90°C范圍的溫度、4.5至5.0范圍的pH使用下述來(lái)液化含淀粉材料: -α-淀粉酶，其在pH4.5、85°C、0.12mM CaCl2具有至少10的T 1/2 (min)，優(yōu)選為權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的α -淀粉酶；以及第二 α -淀粉酶，其在pH4.5、85°C、0.12mM CaCl2具有少于10的T 1/2 (min)； -蛋白酶，其具有超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性值，所述熱穩(wěn)定性值是作為80°C /70°C的相對(duì)活性確定的； ?)使用糖源生成酶進(jìn)行糖化； iii)使用發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的工藝，其中所述蛋白酶是作為本文中的SEQID N0:3的成熟部分公開(kāi)的金屬蛋白酶的變體，優(yōu)選所述蛋白酶變體與本文中SEQ ID N0:3的多肽的成熟部分具有至少75%同一性，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少93%，最優(yōu)選至少94%，以及甚至最優(yōu)選至少95%，例如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的同一性。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的工藝，其中所述蛋白酶是SEQID N0:3中所示的橙橘嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)蛋白酶的變體,其具有選自下組的突變:
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L ；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L ；-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L ;和
-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的工藝，其中所述蛋白酶是細(xì)菌來(lái)源的，例如是來(lái)源于火球菌屬(Pyrococcus)的菌株、優(yōu)選激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株的蛋白酶,優(yōu)選所述蛋白酶是與本文中的SEQ ID NO: 13具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%的同一性的蛋白酶。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的工藝，進(jìn)一步地，其中在液化步驟i)過(guò)程中存在和/或添加糖源生成酶，優(yōu)選葡糖淀粉酶，特別是其中所述糖源生成酶是在85°C、pH5.3具有至少30%，優(yōu)選至少35%的熱穩(wěn)定性的葡糖淀粉酶。
11.權(quán)利要求10的工藝，其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，優(yōu)選來(lái)源于青霉屬(Penicillium)的菌株的葡糖淀粉酶，特別是作為本文中的SEQ ID N0:9或14公開(kāi)的草酸青霉(Penicillium oxalicum)的菌株的葡糖淀粉酶,特別是其中所述糖源生成酶是所述來(lái)源于草酸青霉的菌株的葡糖淀粉酶的變體，其在SEQ ID NO:9或14中具有K79V取代(使用SEQ ID NO: 14中所示的成熟序列進(jìn)行編號(hào))，例如其中所述葡糖淀粉酶與本文中的SEQID NO: 9或14中所示的成熟多肽具有至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少93%，最優(yōu)選至少94%，以及甚至最優(yōu)選至少95%，例如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%的同一性。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的工藝，進(jìn)一步地，其中在糖化和/或發(fā)酵過(guò)程中存在和/或添加葡糖淀粉酶，優(yōu)選其中所述葡糖淀粉酶是真菌來(lái)源的，優(yōu)選來(lái)自曲霉屬(Aspergillus),優(yōu)選黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)或米曲霉(A.0ryzae)的菌株；或木霉屬(Trichoderma),優(yōu)選里氏木霉(T.reesei)的菌株；或踝節(jié)菌屬(Talaromyces),優(yōu)選埃默森踝節(jié)菌(T.emersonii)的菌株，或密孔菌屬(Pycnoporus)的菌株,或Gloephyllum的菌株 。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的工藝，進(jìn)一步地，其中在液化和/或糖化過(guò)程中存在普魯蘭酶。
14.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的工藝，其包括下述步驟: i)在80至90°C范圍的溫度、4.5至5.0范圍的pH使用下述來(lái)液化含淀粉材料: -來(lái)源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的α -淀粉酶，其在ΡΗ4.5、85°C、0.12mMCaCl2具有至少10的 T 1/2(min)； -來(lái)源于激烈火球菌或橙橘嗜熱子囊菌的蛋白酶，其具有超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性值，所述熱穩(wěn)定性值是作為80°C /70°C的相對(duì)活性確定的；?)使用葡糖淀粉酶進(jìn)行糖化；iii)使用發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵。
15.—種組合物，其包含α-淀粉酶和蛋白酶，其中 i)所述 α -淀粉酶在 pH4.5、85°C、0.12mM CaCl2 具有至少 10 的 T 1/2 (min)；?)所述蛋白酶具有超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性值，所述熱穩(wěn)定性值是作為80°C /70°C的相對(duì)活性確定的。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述α-淀粉酶是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的變體，例如本文中的SEQ ID NO:1所示的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的變體，特別地，其中所述嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶變體是截短的，優(yōu)選截短為具有大約491個(gè)氨基酸，特別地，其中所述α-淀粉酶變體與本文中的SEQ ID NO:1的多肽的成熟部分具有至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少93%，最優(yōu)選至少94%，以及甚至最優(yōu)選至少95%，例如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的同一性。
17.權(quán)利要求15或16的組合物，其中所述α-淀粉酶來(lái)源于嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶，其截短為具有大約491個(gè)氨基酸，具有選自下組的突變:
-1181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S ；
-1181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E ;和
-1181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S。
18.權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)的組合物，進(jìn)一步地，其中所述組合物包含第二α-淀粉酶，特別是細(xì)菌來(lái)源的第二 α-淀粉酶。
19.權(quán)利要求15-18任一項(xiàng)的組合物，其包含: -α -淀粉酶，其在 pH4.5、85°C、0.12mM CaCl2 具有至少 10 的 T 1/2 (min)； -第二 α -淀粉酶，其在 pH4.5、85°C、0.12mM CaCl2 具有少于 10 的 T 1/2 (min)； -蛋白酶，其具有超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性值，所述熱穩(wěn)定性值是作為80°C /70°C的相對(duì)活性確定的； -熱穩(wěn)定性葡糖淀粉酶。`
20.權(quán)利要求15-19任一項(xiàng)的組合物，其中所述蛋白酶具有作為80°C/70°C的相對(duì)活性確定為超過(guò)30%，超過(guò)40%，超過(guò)50%，超過(guò)60%，超過(guò)70%，超過(guò)80%，超過(guò)90%，超過(guò)100%，例如超過(guò)105%，例如超過(guò)110%，例如超過(guò)115%，例如超過(guò)120%的熱穩(wěn)定性。
21.權(quán)利要求15-20任一項(xiàng)的組合物，其中所述蛋白酶是SEQID NO:3中顯示的橙橘嗜熱子囊菌蛋白酶的變體，具有選自下組的突變:
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L ；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L ；
-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L ；
-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L。
22.權(quán)利要求15-21任一項(xiàng)的組合物，其中所述蛋白酶來(lái)源于火球菌屬的菌株，優(yōu)選激烈火球菌的菌株，其中所述蛋白酶與本文中的SEQ ID NO: 13具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%的同一性。
23.權(quán)利要求15-22任一項(xiàng)的組合物，其進(jìn)一步包含糖源生成酶，特別是其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，其優(yōu)選在85°C、pH5.3具有至少20%，至少30%，優(yōu)選至少35%的相對(duì)活性熱穩(wěn)定性，特別是其中所述葡糖淀粉酶來(lái)源于青霉屬的菌株，特別是草酸青霉的菌株，其作為本文中的SEQ ID NO:9或14公開(kāi)，特別是其中所述糖源生成酶是所述來(lái)源于草酸青霉的菌株的葡糖淀粉酶變體，其在SEQ ID NO:9或14中具有K79V取代(使用SEQ ID NO: 14中所示的成熟序列進(jìn)行編號(hào))，特別是其中所述葡糖淀粉酶與本文中的SEQ ID NO:9或14中所示的成熟多肽具有至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少91%，更優(yōu)選至少92%，甚至更優(yōu)選至少93%，最優(yōu)選至少94%，和甚至最優(yōu)選至少95%，例如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%的同一性。
24.權(quán)利要求15-23的組合物，進(jìn)一步包含普魯蘭酶。
25.權(quán)利要求15-24任一項(xiàng)的組合物，其包含: i)來(lái)源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的α -淀粉酶，其在pH4.5、85°C、0.12mMCaCl2具有至少10的 T 1/2(min)； ?)來(lái)源于激烈火球菌或橙橘嗜熱子囊菌的蛋白酶，其具有超過(guò)20%的熱穩(wěn)定性值，所述熱穩(wěn)定性值是作為80°C /70°C的相對(duì)活性確定的；和任選的iii)來(lái)源于草酸青霉的 葡糖淀粉酶。
【文檔編號(hào)】C12P7/06GK103608460SQ201180068324
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月22日
【發(fā)明者】R.德因哈默, S.克拉克, M.奎羅斯, J.馬修斯, A.G.朱爾曼德, C-L.宋, 松井知子, 高木忍 申請(qǐng)人:諾維信北美公司, 諾維信公司