抗基因沉默的經(jīng)修飾的人cmv啟動子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及這樣的核酸分子，其包含皰疹病毒的功能啟動子、皰疹病毒的功能增強子以及aprt（腺嘌呤磷酸核糖轉移酶）基因和/或其功能變體的CpG島的一個或多個內部元件。還公開了使用所述核酸分子、含有所述核酸分子的載體和宿主細胞產(chǎn)生所希望的多肽的方法。
【專利說明】抗基因沉默的經(jīng)修飾的人CMV啟動子
[0001]相關申請的交叉參考
[0002]該申請要求2010年12月24日提交的美國臨時申請?zhí)?1/427，121的優(yōu)先權的權益，為所有目的將所述臨時申請的內容完整引入本文作為參考。
【技術領域】
[0003]本發(fā)明涉及分子生物學、病毒學和基因治療領域，尤其涉及含有皰疹病毒的功能啟動子、皰疹病毒的功能增強子和aprt (腺嘌呤磷酸核糖轉移酶)基因和/或其功能變體的CpG島的一個或多個內部元件的核酸分子，本發(fā)明包括所述核酸分子的用途以及產(chǎn)生目的多肽或蛋白質的方法。
【背景技術】
[0004]迄今為止，基因治療中的大多數(shù)研究已經(jīng)利用了病毒啟動子。一般而言，強的病毒啟動子為有效的病毒繁殖所需，并且它們通過使用控制并募集宿主轉錄機的機制，經(jīng)常比真核啟動子誘導更高水平的轉錄。此外，病毒啟動子傾向于更緊湊，因此更易于操縱并適應于基因治療載體。
[0005]人巨細胞病毒主要立即早期基因啟動子(hCMV)已經(jīng)廣泛用于學術研究和工業(yè)應用中，用于哺乳動物細胞中高水平重組蛋白質的產(chǎn)生。例如，hCMV中驅動立即/早期基因表達的增強子/啟動子元件已經(jīng)廣泛用于生物技術中，用于驅動異源基因在真核表達載體中的表達。正在使用的其他病毒啟動子包括猿猴病毒40(SV40)、勞斯肉瘤病毒長末端重復(RSV-LTR)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR和其他逆轉錄病毒LTR啟動子。因此病毒啟動子的應用已經(jīng)非常普遍，并且已經(jīng)成功用于體外和體內的某些應用。然而，真核細胞已經(jīng)進化了檢測并使病毒轉基因的表達沉默的機制。病毒啟動子已經(jīng)顯示經(jīng)常不能維持體內轉基因的表達，盡管有病毒啟動子易于在體外和體內失活并沉默的大量證據(jù)，但是大部分的基因治療應用還是繼續(xù)利用它們來驅動轉基因的表達。不過，一個普遍的問題在于，通過轉導進入到哺乳動物細胞中的異源基因瞬時表達至足夠的水平，然后在長期培養(yǎng)過程中在穩(wěn)定轉染的細胞系中所述表達被抑制并逐漸被沉默。因此基因沉默是基因治療中的主要障礙。
[0006]轉基因表達的丟失主要歸因于轉錄沉默，其涉及CpG DNA序列上的甲基化、組蛋白脫乙酰作用或整合位點附近的染色質凝聚。CpG島一般至少200bp長，富含GC，并含有至少約60%頻率的CpG 二核苷酸。DNA甲基化是共價修飾，其中胞嘧啶的5’位置被甲基化。在哺乳動物中，該修飾發(fā)生在CpG 二核苷酸。在組蛋白非常分散的開放染色質中，DNA是未甲基化的，由開放的圓圈表示(圖1)，基因活躍地表達。甲基化后，甲基結合(MBD)蛋白將組蛋白修飾蛋白和協(xié)阻抑物募集到甲基化的區(qū)域，引起染色質變得致密，并將所述基因沉默。
[0007]已經(jīng)應用多種抗甲基化技術來防止基因沉默。例如,Senigl, H和同事(Senigl，H;Plachyj J.;Hejnarj J., The core element of a CpG island protects avian sarcoma andleukosis virus-derived vectors from transcriptional silencing(2008)Journal ofVirology, 82:7818-7827)顯示，在小病毒啟動子RSV LTR(_200個堿基)的增強子和啟動子之間插入CpG島的內部元件(IE)防止基因沉默。然而，該策略對于較大的啟動子可能不起作用，因為已經(jīng)報道，IE僅可保護約150個堿基免于甲基化(Siegfried, Z.;Eden, S.，等DNAmethylation represses transcription in vivo(1998)Nature genetics 22:203-206)。
[0008]UCOE (遍在染色質開放元件)已經(jīng)用于研究和生物技術應用中，如細胞培養(yǎng)中的重組蛋白質產(chǎn)物。UCOE賦予增加比例的高產(chǎn)基因整合事件，其在轉基因表達的水平和穩(wěn)定性上均有改良。盡管UCOE在本領域中被稱為CpG島相關元件(W0 2006/095156)，已知UCOE還具有不同的功能，UCOE使染色質在結構上松散，因此即使基因整合到異染色質中也能夠表達。因此并不清楚UCOE是否能防止各種核酸的DNA甲基化。
[0009]產(chǎn)生可在規(guī)模擴大期內維持高生產(chǎn)性的細胞系對生物制藥而言是極其重要的。產(chǎn)品的不穩(wěn)定性可影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和產(chǎn)品的一致性，妨礙該產(chǎn)品的注冊批準。使用目前可用的表達載體產(chǎn)生的大多數(shù)克隆具有不穩(wěn)定的生產(chǎn)性。因此，大量的克隆需要經(jīng)過篩選，以獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)細胞系。在以前的文獻報道中已經(jīng)表明，生產(chǎn)性的丟失主要是由于轉錄沉默，其涉及啟動子內CpG 二核苷酸的甲基化。
[0010]考慮到重組蛋白質的表達在生物技術中的重要性，仍然需要包含經(jīng)修飾的啟動子或增強子組合的改良的表達載體。
[0011]發(fā)明概述
[0012]—方面,本發(fā)明提供包含皰疫病毒的功能啟動子、皰疫病毒的功能增強子和aprt(腺嘌呤磷酸核糖轉移酶)基因和/或其功能變體的CpG島的一個或多個內部元件的核酸分子。
[0013]第二方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生所希望的多肽的方法。所述方法包括提供如本文定義的核酸分子，其中所述核酸分子進一步包含編碼所希望的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列被有效地連接至皰疹病毒的啟動子和皰疹病毒的增強子，和允許表達所述所希望的多肽。
[0014]第三方面，本發(fā)明提供包含如本文定義的核酸分子的載體。
[0015]第四方面，本發(fā)明提供包含如本文定義的核酸分子的宿主細胞。
[0016]第五方面，本發(fā)明提供如本文定義的核酸分子的用途，所述核酸分子用于增強目的多肽的表達，其中所述核酸分子包含編碼目的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列被有效地連接至皰疫病毒的啟動子和皰疫病毒的增強子。
[0017]附圖簡述
[0018]當結合非限制性實施例和附圖進行考慮時，參考詳細的描述能更好地理解本發(fā)明，在所述附圖中:
[0019]圖1闡明了轉錄基因沉默機制的圖示。圖1A顯示了核苷酸的共價修飾，其中胞嘧啶的5’位置被甲基化。圖1B顯示了在CpG 二核苷酸處發(fā)生的DNA甲基化。在組蛋白(“H3”)非常分散的開放染色質中，DNA是未甲基化的，由開放的圓圈表示，基因活躍地表達。通過甲基化，甲基結合(“MBD”)蛋白將組蛋白修飾蛋白(如“HDAC”:組蛋白脫乙酰酶)和協(xié)阻抑物(如“HP1”:異染色質蛋白I)募集到甲基化的區(qū)域，使染色質變得致密，并將所述基因沉默。
[0020]圖2顯示了在倉鼠APRT基因上發(fā)現(xiàn)的CpG島的內部元件(IE)的核苷酸序列(SEQ ID N0:4)。所述內部元件(IE)是倉鼠APRT基因的CpG島的小區(qū)域(Brandeis, Μ.;Frank,D.;Keshet,1.,等 Spl Elements Protect A Cpg Island FromDe-Novo Methylation(1994)Nature 371:435-438)。
[0021]圖3A顯示了含有人巨細胞病毒(CMV)增強子和啟動子的核苷酸序列(SEQ IDNO:6)。以粗體顯示CG 二核苷酸，其均可被甲基化，導致基因沉默。下劃線和粗體顯示的CTCGAG序列表示使用定點誘變在增強子和啟動子之間產(chǎn)生的XhoI位點，用于插入IE。
[0022]圖3B顯示了圖3A的核苷酸序列的圖示。每個環(huán)指的是序列中的CG 二核苷酸。所述CG 二核苷酸均可被甲基化，導致基因沉默。
[0023]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明多個實施方案的12個不同核酸分子的圖示，其中將aprt基因的CpG島的一個或兩個IE以正向或反向插入到增強子的上游、增強子與啟動子(P)之間以及啟動子(P)的下游，以研究定位、方向和拷貝數(shù)對IE防止基因沉默能力的影響以及IE的插入是否影響啟動子的強度。野生型CMV稱為WT CMV,而經(jīng)修飾的CMV在下文中稱為IE CMV。
[0024]圖5顯示了含有CMV增強子區(qū)和啟動子(P)區(qū)的載體序列，其用于在哺乳動物細胞中表達所克隆的DNA插入片段。MluI用于將IE插入到CMV增強子的上游，XhoI用于將IE插入到CMV的增強子和啟動子之間，NheI用于將IE插入到啟動子的下游。IRESatt是衰減的內部核糖體進入位點(IRES)。IRES允許在一個啟動子控制下表達多個基因。IRES翻譯效率的衰減用于更有效地選擇高產(chǎn)克隆。mNPT是具有降低的酶活性的突變新霉素，其允許更有效地選擇高產(chǎn)克隆。
[0025]圖6顯示了克隆產(chǎn)生以及評估細胞培養(yǎng)中本發(fā)明的核酸分子長期表達的圖示方法。
[0026]圖7顯示了在瞬時(圖 7A)和穩(wěn)定基因表達(圖7B)中含有經(jīng)修飾的CMV啟動子(“IE CMV”，見圖4)與野生型CMV啟動子(“WT CMV")的12個核酸分子強度的比較。向CMV中插入IE的目的是為了提高表達的穩(wěn)定性，但不改變表達水平。在瞬時和穩(wěn)定轉染中使用GFP作為報告基因比較經(jīng)修飾的CMV啟動子與WT CMV在表達基因中的強度。使用FACS測定瞬時轉染的庫和穩(wěn)定表達克隆的平均熒光強度。用星號表示95%置信水平上相對于WTCMV的統(tǒng)計學顯著差異。不希望受理論的束縛，在瞬時轉染中，將IE插入到CMV的下游降低表達水平，而插入到其他位置看起來具有較小的影響。在穩(wěn)定轉染中，UF2、UR2和MRl具有的表達水平與野生型CMV相當。
[0027]圖8顯示了使用WT CMV產(chǎn)生的代表性克隆B4在第8周和第O周時GFP陽性細胞的百分比。在第O周時，所有細胞表達GFP。在沒有選擇試劑G418的情況下傳代8周后，僅34%的細胞仍然表達GFP。
[0028]圖9顯示了根據(jù)本發(fā)明的多個實施方案使用IE CMV啟動子(MF2)獲得的代表性克隆B8在第O周和第8周時GFP陽性細胞的百分比。所述IE CMV啟動子(MF2)含有在增強子和小型啟動子之間插入的2個IE(圖9A)。在第O周時，所有細胞表達GFP。在沒有選擇試劑G418的情況下傳代8周后，所有細胞仍然表達GFP。
[0029]圖10顯示了使用WT CMV產(chǎn)生的代表性克隆B4在第O周和第8周時的柱狀圖。將GFP表達的保留(％)如下計算為第8周時的平均熒光強度(MFI)與第O周時平均熒光強度(MFI)的比值:
[0030]
【權利要求】
1.核酸分子，其包含皰疫病毒的功能啟動子、皰疫病毒的功能增強子和aprt(腺嘌呤磷酸核糖轉移酶)基因和/或其功能變體的CpG島的一個或多個內部元件。
2.權利要求1的核酸分子，其中所述aprt基因是下述之一:倉鼠aprt基因、小鼠aprt基因、大鼠aprt基因、人類aprt基因、牛aprt基因、斑馬魚aprt基因、鼠疫耶爾森氏菌aprt基因、熱帶爪蟾aprt基因、霉菌aprt基因、黑腹果蠅aprt基因、釀酒酵母aprt基因、栗酒裂殖酵母aprt基因、大腸桿菌aprt基因、鼠李糖乳桿菌aprt基因和鼠傷寒沙門氏菌aprt基因。
3.權利要求1或2的核酸分子，其中所述倉鼠是灰倉鼠或倉鼠屬物種。
4.權利要求1-3任一項的核酸分子,其中所述aprt基因的CpG島的一個或多個內部元件中的至少一個包含轉錄因子Spl的一個或多個結合位點。
5.權利要求4的核酸分子，其中所述aprt基因是倉鼠aprt基因并且所述aprt基因的CpG 島的 Spl 結合位點具有序列:5’ -GCCCCGCCCCGTCCCGCCCC-3’ (SEQ ID NO:1)。
6.權利要求4的核酸分子，其中所述aprt基因是小鼠aprt基因并且所述aprt基因的CpG 島的 Spl 結合位點具有序列 5’-CCCGCCC-3’ (SEQ ID NO:2)或序列 5’-TCCGCCC-3’ (SEQID NO:3)。
7.權利要求1至5任一項的核酸分子，其中所述aprt基因是倉鼠aprt基因并且所述aprt基因的CpG島的內部兀件具有序列: 5，-
TCCAGCAAATGCGTTACTTCCTGCCAAAAGCCAGCCTCCCCGCAACCCACT
CTCCCAGAGGCCCCGCCCCGTCCCGCCCCCTCCCGGCCTCTCCTCGTGCTG
GATCGCTCCCTAAGGA-3’ (SEQ ID N0:4).。
8.權利要求1至4或6任一項的核酸分子，其中所述aprt基因是小鼠aprt基因并且所述aprt基因的CpG島的內部兀件具有序列: 5，-
AGGATGGACATCGCACATCCCCTTTCCACCCATATATCTTTGAGGTAGGGA
TGCTTGTGTTTAGGCAGCTCAAGAAATCTAACCCCTGACTCAGGCCCCACA
CACACCTCGCAGAGGCCCCGCCTCTCAGCCTGTCCCGCCCCTCGTGCTAGA
CCAACCCGCACCCAGAAGCCCCGCCCATCGAGGACGCTCCGCCCTTGTTC
CCCCCGGGATTGACGTG-3’ (SEQ ID N0:5).。
9.權利要求1至8任一項的核酸分子,其中所述aprt基因的CpG島的一個或多個內部元件以相對于啟動子的序列正向地或反向地獨立地排列在所述核酸分子中。
10.權利要求1至9任一項的核酸分子，其包含所述aprt基因和/或其功能變體的CpG島的多個內部元件。
11.權利要求1至10任一項的核酸分子，其進一步包含編碼目的多肽的可表達的核苷酸序列，所述可表達的核苷酸序列有效連接至所述皰疹病毒的啟動子和所述皰疹病毒的增強子。
12.權利要求11的核酸分子，其中`所述可表達的核苷酸序列是異源核苷酸序列。
13.權利要求1至12任一項的核酸分子，其中所述可表達的核苷酸序列排列在所述皰疫病毒的啟動子和所述皰疫病毒的增強子的下游。
14.權利要求1至13任一項的核酸分子，其中所述啟動子和所述增強子是同一皰疹病毒的啟動子和增強子。
15.權利要求1至14任一項的核酸分子，其中所述皰疹病毒選自巨細胞病毒、棒狀病毒屬、薔薇疫病毒屬、單純皰疫病毒屬、水痘病毒屬、馬立克病毒屬、傳染性喉氣管炎病毒屬、β皰疫病毒、Y皰疫病毒、Epstein-Barr病毒、水痘帶狀皰疫病毒、小鼠Y皰疫病毒-68和猿猴皰疹B病毒。
16.權利要求15的核酸分子，其中所述巨細胞病毒是人巨細胞病毒。
17.權利要求1-16任一項的核酸分子，其中所述功能啟動子和所述功能增強子被包含在以下序列中:
18.權利要求1至17任一項的核酸分子，其中所述功能啟動子具有序列:
19.權利要求1至18任一項的核酸分子，其中所述功能增強子具有序列:
20.權利要求1至19任一項的核酸分子，其中所述皰疹病毒的增強子排列在所述皰疹病毒的啟動子的上游。
21.權利要求1至20任一項的核酸分子,其中所述aprt基因或其功能變體的CpG島的一個或多個內部元件中的至少一個排列在所述皰疹病毒的啟動子的上游或鄰近地排列在所述皰疹病毒的啟動子的下游。
22.權利要求21的核酸分子，其中所述aprt基因或其功能變體的CpG島的一個或多個內部元件中的至少一個排列在(i)所述皰疹病毒的增強子和所述皰疹病毒的啟動子之間或(ii)鄰近地排列在所述皰疹病毒的增強子的上游。
23.權利要求21或22的核酸分子，其中所述aprt基因或其功能變體的CpG島的一個或多個內部元件中的至少一個與所述皰疹病毒的增強子或所述皰疹病毒的啟動子鄰近地排列。
24.權利要求1至23任一項的核酸分子,其中所述核酸分子是DNA分子。
25.權利要求1至24任一項的核酸分子，其中所述皰疹病毒的功能啟動子是所述核酸分子中包含的唯一啟動子。
26.權利要求1至25任一項的核酸分子，其中所述核酸分子被包含在載體中。
27.權利要求26的核酸分子,其中所述載體是真核表達載體或原核表達載體。
28.權利要求26或27的核酸分子，其中所述載體是質粒。
29.權利要求1至28任一項的核酸分子，其中所述核酸分子被包含在合適的宿主細胞中。
30.權利要求29的核酸分子，其中所述宿主細胞是真核細胞或原核細胞。
31.權利要求1至30任一項的核酸分子，其中所述核酸分子是分離的核酸分子。
32.產(chǎn)生所希望的多肽的方法，所述方法包括: -提供根據(jù)權利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子進一步包含編碼所希望的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效連接至所述皰疹病毒的啟動子和所述皰疹病毒的增強子，和 -允許所希望的多肽的表達。
33.權利要求32的方法，其中所述的編碼所希望的多肽的核苷酸序列是異源核苷酸序列。
34.權利要求32或33的方法，其中允許所述所希望的多肽的表達包括將根據(jù)權利要求1的核酸分子引入到合適的宿主細胞中。
35.權利要求34的方法，其中根據(jù)權利要求1的核酸分子被包含在適合于所述宿主細胞中表達的載體中。
36.權利要求34或35的方法，其中允許所述所希望的多肽在所述宿主細胞中表達超過約30代或更多代。
37.權利要求36的方法，其中當與具有編碼目的多肽的異源核苷酸序列的核酸分子相比時，所述宿主細胞在約30代或更多代后，所述所希望的多肽的表達水平提高，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能變體的CpG島的內部元件。
38.權利要求36或37的方法，其中所述所希望的多肽在多個宿主細胞中表達，并且其中當與包含具有編碼目的多肽的異源核苷酸序列的核酸分子的多個宿主細胞相比時，所述宿主細胞在約30代或更多代后，仍然表達所希望的多肽的宿主細胞的數(shù)目增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能變體的CpG島的內部元件。
39.權利要求34至38任一項的方法，其中允許所述所希望的多肽表達超過約4周或更長的時間。
40.權利要求38的方法，其中當與具有編碼目的多肽的異源核苷酸序列的核酸分子相比時，4周或更長的時間后，所述所希望的多肽的表達水平提高，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能變體的CpG島的內部元件。
41.權利要求39或40的方法，其中所述所希望的多肽在多個宿主細胞中表達，并且其中當與包含具有編碼目的多肽的異源核苷酸序列的核酸分子的多個宿主細胞相比時，在4周或更長的時間后，仍然表達所希望的多肽的所述宿主細胞的數(shù)目增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能變體的CpG島的內部元件。
42.權利要求34至41任一項的方法，其中允許所述所希望的多肽在所述宿主細胞中表達超過約60代或更多代。
43.權利要求34至42任一項的方法，其中允許所述所希望的多肽表達超過8周或更長的時間。
44.權利要求43的方法，其中當與不具有aprt基因和/或其功能變體的CpG島的內部元件的核酸分子相比時，8周或更長的時間后，所述所希望的多肽的表達水平提高。
45.權利要求43或44的方法，其中所述所希望的多肽在多個宿主細胞中表達，并且其中當與包含具有編碼目的多肽的異源核苷酸序列的核酸分子的多個宿主細胞相比時，在8周或更長的時間后，仍然表達所希望的多肽的所述宿主細胞的數(shù)目增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能變體的CpG島的內部元件。
46.載體,其包含權利要求1至25任一項的核酸分子。
47.權利要求46的載體，其中所述載體是真核表達載體或原核表達載體。
48.權利要求46或47的載體，其中所述載體是質粒。
49.宿主細胞，其包含權利要求1至28任一項的核酸分子。
50.根據(jù)權利要求1至28任一項的核酸分子的用途，所述核酸分子用于增強目的多肽的表達，其中所述核酸分子包含編碼目的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效連接至所述皰疫病毒的啟動子和所述皰疫病毒的增強子。
51.權利要求50的用途，其中所述目的多肽在合適的宿主細胞中表達.
52.權利要求51的用途，其中允許所述目的多肽在宿主細胞中表達超過約30代或更多代。
53.權利要求51或52的用途，其中允許所述目的多肽在所述宿主細胞中表達超過約60代或更多代。
54.權利要求52或53的用途，其中當與具有編碼目的多肽的異源核苷酸序列的核酸分子相比時，所述宿主細胞在約30代或更多代后，所述所希望的多肽的表達水平提高，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能變體的CpG島的內部元件。
55.權利要求53或54的用途，其中當與具有編碼目的多肽的異源核苷酸序列而不具有aprt基因和/或其功能變體的CpG島的內部元件的核酸分子相比時，所述宿主細胞在約60代或更多代后，所述所希望的多肽的表達水平提高，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能變體的CpG島的內部元件。
56.權利要求52至55的用途，其中所述所希望的多肽在多個宿主細胞中表達，并且其中當與包含具有編碼目的多肽的異源核苷酸序列的核酸分子的多個宿主細胞相比時，所述宿主細胞在約30代或更多代后，仍然表達所述所希望的多肽的宿主細胞的數(shù)目增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能變體的CpG島的內部元件。
57.權利要求53至56的用途，其中所述所希望的多肽在多個宿主細胞中表達，并且其中當與包含具有編碼目的多肽的異源核苷酸序列的核酸分子的多個宿主細胞相比時，所述宿主細胞在約60代或更多代后，仍然表達所述所希望的多肽的宿主細胞的數(shù)目增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能變體的CpG島的內部元件。
58.權利要求50至57任一項的用途，其中所述aprt基因和/或其功能變體的CpG島的內部元件防止功能啟動子和/或功能增強子的甲基化，從而降低和/或防止所述所希望的多肽表達水平的降低。`
【文檔編號】C12N15/869GK103502459SQ201180068239
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2011年12月22日 優(yōu)先權日:2010年12月24日
【發(fā)明者】楊元生, M·馬里亞蒂 申請人:新加坡科技研究局