專利名稱：用于在絲狀真菌子實體中產(chǎn)生異源蛋白的調(diào)控元件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及真菌基因表達的調(diào)控領(lǐng)域。新組合物和方法可用于通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組技術(shù)來改善真菌物種，如改善病原體、害蟲以及殺蟲劑抗性，產(chǎn)量和質(zhì)量，延長生產(chǎn)保存期限，提高烹飪、營養(yǎng)以及醫(yī)藥價值等，以及改善異源蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
約40%商購可獲得的酶來源于絲狀真菌。Lowe, Handbook of Applied Mycology.Fungal Biotechnology (eds.) Arora, D.K.Elander, R.P.&Muker ji, K.G.681-708 (MarcelDekker, New York; 1992)。這些酶通常由曲霉屬(Aspergillus)和木霉屬(Trichoderma)的物種產(chǎn)生。因為它們向培養(yǎng)基中分泌大量蛋白，它們可以在大規(guī)模發(fā)酵時生長，并且通常認為它們對于食品工業(yè)是安全的。與商業(yè)栽培蘑燕(雙孢蘑燕(Agaricus bisporus))相關(guān)的一般問題包括，病原體如菌生輪枝菌(Verticillium fungicola,干泡病)、侵占木霉(Trichodermaaggressivum,綠霉)、托拉氏假單胞菌(Pseudomonas tolaasii,斑)和dsRNA病毒(勒法郎士病(La France disease)和斑病(patch disease))引起的疾病、主要蟲害[尖眼蕈蚊(sciarid fly)(尖眼蕈蚊(Lycoriella mali))]、與細菌性腐敗和快速衰老有關(guān)的產(chǎn)品的極短保存期 限以及與內(nèi)源多酚氧化酶(ΡΡ0，如酪氨酸酶)的作用有關(guān)的子實體褐變(擦傷)。為了進一步提高產(chǎn)品質(zhì)量，雙孢蘑菇的常規(guī)育種程序僅僅是適度成功的，并且長期而言是不足夠的。這是因為真菌的常規(guī)育種技術(shù)非常耗時，并且因為商購可獲得菌株的遺傳變異受到限制，從而提供很小的通過選擇的改進(Horgen et al.“Homologybetween mitochondrial DNA of A.bisporus and an internal portion of a linearmitochondrial plasmid of Agaricus bitorquis，，Curr Genet.1991.19:495-502)。對于雙孢蘑菇而言，有效育種策略的主要障礙是涉及任一親本核異常地同時分離成一個擔孢子的相當異常的生活史。在這種擔孢子長出后，形成異核菌絲，其所含有的核和遺傳特征與親本菌絲中存在的核和遺傳特征并無不同。此外，在減數(shù)分裂期僅觀察到很少的重組活性(Summerbell et al.Genetics, Oct.123 (2) 1989 pp.293-300)。為了克服常規(guī)育種的局限性，全世界的研究人員試圖為商業(yè)蘑菇如雙孢蘑菇開發(fā)和改善用于引入新特性的轉(zhuǎn)化方法。對于其他真菌以及植物、動物和細菌而言，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是相當常見的，并且已經(jīng)導(dǎo)致商業(yè)應(yīng)用。為了提高微生物如真菌產(chǎn)生蛋白的經(jīng)濟性，已經(jīng)做了大量努力來提高轉(zhuǎn)錄和翻譯效率、最大化針對期望的產(chǎn)物產(chǎn)生的總蛋白的比例，提高修飾的宿主的生存力，并提高獲得修飾的宿主的效率。目前用于真菌轉(zhuǎn)化的主要啟動子是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)啟動子。利用強啟動子在適當?shù)乃拗髦斜磉_異源基因是生物技術(shù)應(yīng)用的主要策略。Gpd啟動子是可以通過任何碳源誘導(dǎo)的強啟動子，并且已經(jīng)廣泛用于在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)以及其他酵母中表達異源蛋白。
還從擔子菌中克隆了 gpd基因，包括裂裙菌(Schizophyllum commune)、黃孢原毛皮革菌(Phanerochaete chrysosporium)、雙抱蘑燕(Harmsen et al., 1992)以及埃杜拉香燕(Lentinula edodes (Hirano et al.，1999))。據(jù)報道,利用同源gpd啟動子在這些蘑燕中進行基因轉(zhuǎn)化，僅在雙孢蘑燕、絨狀火燕(Flammulina velutipes)以及香燕(Hirano et al., 2000, Kuo et al., 2004, van de Rhee et al., 1996)中獲得成功。盡管異源啟動子已經(jīng)用于表達藥物抗性標記標志基因，但是基因轉(zhuǎn)化并不足以表達異源基因(Ruiz-Diez, 2002)。為了充分且有效地表達異源基因，對宿主細胞而言重要的是通過其轉(zhuǎn)錄機制識別啟動子序列。Chun-Yi Kuo等證明異源基因即潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)可以在金針菇(Kuo et al., 2004)中表達。然而，據(jù)發(fā)現(xiàn)，盡管擔子菌中的gpd基因高度相似，但是這些基因的啟動子區(qū)明顯不同。如上文所述，本領(lǐng)域持續(xù)需要開發(fā)有效、便利且迅速的真菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和基因表達元件。因此，本發(fā)明的目的是，為真菌提供滿足上述需要的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，特別是強調(diào)控元件?！け景l(fā)明的另一目的是，提供應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的機制，如應(yīng)用于細菌、非絲狀真菌(酵母)、植物以及動物的那些技術(shù)，來提高產(chǎn)量、疾病和害蟲抗性、產(chǎn)品質(zhì)量、保存期限或烹飪、營養(yǎng)或醫(yī)藥價值，來商業(yè)化生產(chǎn)異源蛋白，或其他此類方案。本發(fā)明的另一目的是，提供能驅(qū)動可操作地連接的序列在真菌的子實體以及植物的組織或動物細胞中的高水平蛋白積累的調(diào)控元件。本發(fā)明的另一目的是，提供用于這類轉(zhuǎn)基因方案中的調(diào)控元件、多核苷酸構(gòu)建體、載體以及轉(zhuǎn)化的細胞。根據(jù)隨后的本發(fā)明的描述，本發(fā)明的其他目的會變得顯而易見。發(fā)明概述本發(fā)明包括分離的調(diào)控元件/啟動子，其包含選自以下的多核苷酸序列:a)包含SEQ ID N0:USEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列的多核苷酸序列；和《能調(diào)控可操作地連接的多核苷酸分子在真菌細胞中的轉(zhuǎn)錄的a)的多核苷酸序列的片段。本發(fā)明還包括多核苷酸構(gòu)建體，其包含可操作地連接于異源多核苷酸分子的本發(fā)明的啟動子。本發(fā)明還包括包含本發(fā)明構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化的細胞以及利用本發(fā)明的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化方法和由此產(chǎn)生的異源蛋白產(chǎn)物。本發(fā)明涉及來自雙孢蘑菇凝集素編碼基因的啟動子，用作調(diào)控區(qū)并提供目的核苷酸序列的表達。在一實施方案中，將異源蛋白或目的核苷酸序列的積累驅(qū)動到子實體組織。本發(fā)明還涉及驅(qū)動異源蛋白或目的核苷酸序列在子實體組織中表達的功能片段。并入了驅(qū)動核苷序列表達的啟動子的表達盒，表達核苷酸序列的植物、真菌或細菌細胞，以及用于調(diào)控核苷酸序列表達的方法，都位于本發(fā)明的范圍內(nèi)。


圖1是從雙孢蘑菇子實體提取的蛋白的2-D凝膠分析。根據(jù)制造商的推薦，利用Invitrogen的IPG drystrips進行一維等電聚焦并利用NuPAGE預(yù)制凝膠系統(tǒng)進行二維分離來在2-D SDS PAGE上實施蛋白分離。數(shù)字標記用于MS和MS/MS分析而切除的蛋白斑點。圖2是包括連接于報道基因的本發(fā)明啟動子的二元載體pAGN-750的圖譜。圖3是表示⑶S報道基因在生長于濾紙上的pAGN-750事件的營養(yǎng)菌絲中表達的照片。圖4是表示獨立的pAGN-750轉(zhuǎn)基因事件的子實體切片⑶S染色的照片。樣品 1=750-22B ；樣品 2=750-16A ；樣品 3=750_6B ；樣品 4=750-1 IC ；樣品 5=750_7A ；樣品6=750-13A ;樣品 7=750-8A ;樣品 8=750_23A圖5是包括連接于感興趣的靶基因的本發(fā)明啟動子的二元載體pAGN-755的圖譜。圖6描述凝集素啟動子的序列。每一載體的5’端DNA序列標有下劃線，并且標明相應(yīng)載體。所有的載體都共有所不的同一序列。pAGN-755和pAGN-750共有相同的序列。圖7表示由表5中截短的啟動子所產(chǎn)生的事件的液體菌絲培養(yǎng)物的GUS染色。發(fā)明詳述通過引用，將所提到的所有參考文獻并入本文。除非另外定義，否則本文所用的所有科技術(shù)語都與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的具有相同的含義。除非另有說明，否則本文所用或所包括的技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標準技術(shù)。材料、方法以及實施例僅是說明性的而非限制性的。

根據(jù)本發(fā)明，提供了允許調(diào)控子實體組織中目的同源(cognate)蛋白或核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和積累的核苷酸序列。因此，本發(fā)明的組合物包含新的與編碼雙孢蘑菇凝集素蛋白的核苷酸序列天然相關(guān)的真菌調(diào)控元件的核苷酸序列。在一實施方案中，所述調(diào)控元件驅(qū)動真菌組織中的轉(zhuǎn)錄，或更具體而言，實現(xiàn)目的蛋白或轉(zhuǎn)錄本在真菌子實體組織中的表達，其中所述調(diào)控元件包含選自以下的核苷酸序列:a)與編碼凝集素蛋白的DNA天然相關(guān)且調(diào)控所述DNA的表達的序列；b) SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3 或 SEQ ID N0:4 的序列；或 c)包含 SEQ ID NO: USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列的功能片段的序列。其他實施方案涉及包含上述核苷酸序列的表達盒、轉(zhuǎn)化載體、真菌、細菌以及真菌和細菌細胞。本發(fā)明還涉及在植物、真菌以及細菌組織和它們的細胞中使用所述序列的方法。提供了利用本文所公開的調(diào)控序列在真菌中表達分離的核苷酸序列的方法。所述方法包括用轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化真菌細胞，所述轉(zhuǎn)化載體包含可操作地連接于本發(fā)明的一個或多個調(diào)控序列的分離的核苷酸序列，并由轉(zhuǎn)化的真菌細胞再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的真菌。以這種方式，調(diào)控序列可用于控制子實體組織中內(nèi)源以及外源產(chǎn)物的表達?？蛇x地，可能期望抑制真菌組織中天然DNA序列的表達，以實現(xiàn)期望的表型。在這種情況下，這種抑制可能通過例如以下實現(xiàn)，轉(zhuǎn)化真菌以包含可操作地連接于反義核苷酸序列、發(fā)夾、RNA干擾或其他核酸分子的啟動子，從而使得所述分子的表達干擾天然DNA序列的mRNA的翻譯或抑制其在真菌細胞子集中表達。在所述調(diào)控元件調(diào)控下的將是目的序列，其會提供對真菌表型的修飾。這種修飾包括調(diào)控內(nèi)源產(chǎn)物的產(chǎn)生，如量、相對分布等，或調(diào)控外源表達產(chǎn)物的產(chǎn)生以在真菌中提供新功能或新產(chǎn)物。這類啟動子可用于多種應(yīng)用，如產(chǎn)生具有期望性狀的轉(zhuǎn)基因真菌，包括例如改變含量、蛋白質(zhì)量、細胞生長或營養(yǎng)質(zhì)量，或優(yōu)選用于產(chǎn)生異源蛋白。"子實體組織”啟動子意指能有效轉(zhuǎn)錄可操作地連接的核苷酸序列并由此實現(xiàn)目的蛋白或核苷酸序列在所述組織中高水平積累的表達，所述組織在此是子實體組織細胞。組織可以指具體組織的細胞。"調(diào)控元件"意指負責連接的核酸分子的表達的序列，包括但不限于啟動子、終止子、增強子、內(nèi)含子等。"啟動子"意指能調(diào)控與其連接的序列轉(zhuǎn)錄的DNA的調(diào)控區(qū)。其通常包含能指導(dǎo)RNA聚合酶II在具體編碼序列的適當轉(zhuǎn)錄起始位點啟動RNA合成的TATA盒。啟動子還可以包含通常位于TATA盒上游或5'的其他識別序列，稱為上游啟動子元件，其影響轉(zhuǎn)錄啟動速率并且還包括影響連接的核苷酸序列時空表達的元件。應(yīng)當認識至IJ，已經(jīng)鑒定了本文所公開的啟動子區(qū)的核苷酸序列后，分離和鑒定具體啟動子區(qū)上游5’區(qū)的其他調(diào)控元件屬于現(xiàn)有技術(shù)。因此，本文所公開的啟動子區(qū)可以包含上游調(diào)控元件，如負責核酸分子的組織和時序表達的上游調(diào)控元件，并且可以包括增強子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的DNA應(yīng)答元件、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列、激活序列等。以相同的方式，可以鑒定、分離并與其他核心啟動子一起使用使這類表達成為可能的啟動子元件，以確保子實體組織中的表達。核心啟動子表示啟動轉(zhuǎn)錄所需的最小序列，如稱為TATA盒的序列，其對于編碼蛋白的基因中的啟動子是常見的。因此，SB-LEG的上游啟動子可以任選地與其他來源的其自身或核心啟動子聯(lián)合使用。啟動子對于其所存在的細胞而言可以是天然的或非天然的。本發(fā)明的分離的啟動子序列可以經(jīng)修飾以提供分離的核苷酸序列的一系列的表達水平?？梢岳眯∮谕暾膯幼訁^(qū)并且保留在子實體組織中實現(xiàn)表達的能力。應(yīng)當認識到，可以通過啟動子序列的特定部分的缺失調(diào)控mRNA的表達水平。因此，啟動子可以經(jīng)修飾為弱啟動子或強啟動子。通常，"弱啟動子"意指驅(qū)動編碼序列低水平表達的啟動子。"低水平"意 指約1/10，000轉(zhuǎn)錄本至約1/100，000轉(zhuǎn)錄本至約1/500，000轉(zhuǎn)錄本的水平。相反，強啟動子驅(qū)動編碼序列以高水平或以約1/10轉(zhuǎn)錄本至約1/100轉(zhuǎn)錄本至約1/1，000轉(zhuǎn)錄本表達。通常，會用分離的啟動子序列的至少約20個核苷酸驅(qū)動核苷酸序列的表達。應(yīng)當認識到，為了增加轉(zhuǎn)錄水平，增強子可以與本發(fā)明的啟動子區(qū)組合使用。增強子是發(fā)揮增強啟動子區(qū)表達功能的核苷酸序列。增強子在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括SV40增強子區(qū)、35S增強子元件等。本發(fā)明的啟動子可以分離自其天然編碼區(qū)的5'區(qū)或5'非翻譯區(qū)(5' UTR)。同樣，終止子可以分離自位于其各自終止密碼子側(cè)翼的3'區(qū)。術(shù)語"分離的"指諸如核酸或蛋白的材料，其:(1)基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含如在天然存在的環(huán)境所發(fā)現(xiàn)的通常伴隨其或與其相互作用的組分，或(2)如果所述材料處于其天然環(huán)境中，則所述材料被蓄意的人為干預(yù)而改變?yōu)榻M合物和/或被置于除所述材料天然基因座之外的細胞中的基因座。分離啟動子區(qū)的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。一種方法是利用與Genome Walker Kit.TM.(Clonetech)聯(lián)合使用的引物和基因組DNA。雙孢蘑菇凝集素啟動子顯示于SEQ ID NO:1中，其功能截短物顯示于SEQ IDNO:2, SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4中。最小核心啟動子的長度為45個核苷酸，全長啟動子的長度為約135-180個核苷酸。160在長度上是818個堿基對核苷酸。凝集素啟動子分離自雙孢蘑菇凝集素編碼區(qū)。本發(fā)明的調(diào)控區(qū)可以分離自任何植物、動物或真菌，但是優(yōu)選是絲狀真菌，包括但不限于金錢菌屬(Flammulina)、傘菌屬(Agaricus)、香燕屬(Lentinula)以及側(cè)耳屬(Pleurotus)的真菌。預(yù)期分離自真菌物種的啟動子能夠在另一真菌物種中表達。根據(jù)熟知的技術(shù)，基于與本文所示序列編碼區(qū)的序列同源性，可以從其他真菌中分離調(diào)控序列。在這些技術(shù)中，可以用全部或部分已知的編碼序列作為與存在于來自選定生物體的克隆的基因組DNA片段群(即基因組文庫)中的其他序列選擇性雜交的探針。在本領(lǐng)域中容易獲得用于核酸序列雜交的方法。核酸雜交的廣泛指導(dǎo)見于Tijssen, LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes, Part I，Chapter 2" Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays" , Elsevier, New York (1993);和 CurrentProtocols in Molecular Biology, Chapter 2，Ausubel et al., Eds., Greene Publishingand Wiley-1ntersciencej New York(1995)中。本發(fā)明的組合物還包括調(diào)控序列的功能變體。功能變體包括例如具有一個或多個核苷酸取代、缺失或插入的本發(fā)明的天然調(diào)控序列。本發(fā)明的功能變體可以由定點誘變、誘導(dǎo)突變產(chǎn)生，或可以作為等位基因變體存在(多態(tài)性)。本文所用"功能片段"是較大調(diào)控元件的一個或多個缺失所形成的調(diào)控序列變體。例如，可以缺失啟動子的5'部分，其直至轉(zhuǎn)錄起始位點附近的TATA盒，而不喪失啟動子活性，這在 Opsahl-Sorteberg et al., " Identification of a 49_bp fragmentof the HvLTP2 promoter directing aleurone cell specific expression " Gene341:49-58 (2004)中有描述。這類片段應(yīng)當保持啟動子活性，特別是在選定組織中驅(qū)動表達的能力?？梢岳肦NA印跡分析、利用轉(zhuǎn)錄融合物時采用報道物活性測量等測量活性。參閱例如 Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2nd ed.ColdSpring Harbor Labora tory, Cold Spring Harbor, N.Y.)。功能片段可以通過以下方式獲得:使用限制酶切割本文所公開的天然存在的調(diào)控元件核苷酸序列；由天然存在的DNA序列合成核苷酸序列；或可以通過使用PCR技術(shù)獲得。特別是參閱 Mullis et al.(1987)Methods Enzymol.155:335-350, and Erlich, ed.(1989)PCR Technology(Stockton Press, New York)。例如，除去部分DNA序列的常規(guī)方式是，聯(lián)合使用外切核酸酶與DNA擴增來產(chǎn)生雙鏈DNA克隆的單向巢式缺失。用于此目的的商業(yè)試劑盒以商品名Exo-Size.TM.(NewEngland Biolabs, Beverly, Mass.)銷售。簡而言之，這種方法必須將外切核酸酶III與DNA孵育，以按3'到5'的方向漸進性除去DNA模板中5'突出端、粘末端或缺口處的核苷酸。然而，外切核酸酶III不能除去3'、4堿基突出端處的核苷酸。用這種酶定時消化克隆，產(chǎn)生單向巢式缺失?？梢杂萌繂幼有蛄谢蚱洳糠肿鳛槟芘c相應(yīng)啟動子序列特異性雜交的探針。為了在多種條件下實現(xiàn)特異性雜交，這類探針包括獨特的且優(yōu)選長度至少為約10個核苷酸、最優(yōu)選產(chǎn)長度為至少約20個核苷酸的序列。這類探針可以用于從選定的生物體利用熟知的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法擴增相應(yīng)的啟動子序列。這種技術(shù)可以用于從期望的生物體分離其他啟動子序列或用作確定生物體中啟動子序列存在的診斷測定。實例包括平板接種的DNA文庫的雜交篩選(斑塊或集落；參見例如Innis et al.(1990)PCR Protocols, AGuide to Methods and Applications, eds., Academic Press)。用于分離本發(fā)明啟動子的引物顯示于下文中。在提到終止子序列時，意指發(fā)揮聚腺苷酸化信號功能并發(fā)出轉(zhuǎn)錄結(jié)束信號的核苷酸序列。保留這種活性的功能片段落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明公開的調(diào)控元件以及其變體和片段，當與分離的目的核苷酸序列可操作地連接時，可以用于任何真菌的基因操作，所述核苷酸序列的表達受到控制，從而實現(xiàn)期望的表型應(yīng)答。"可操作地連接"意指調(diào)控區(qū)與另一序列之間的功能連接，其中調(diào)控序列啟動并介導(dǎo)對應(yīng)于所述另一序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的調(diào)控元件可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的若干方式中的任一方式可操作地連接于分離的目的核苷酸序列。利用U.S.Pat.N0.6，187，994所述的位點特異性整合，可以將分離的目的核苷酸序列插入基因組中在本發(fā)明啟動子3'的位點。術(shù)語"目的核苷酸序列"指可以是RNA分子以及DNA分子并且可以是編碼期望的多肽或蛋白的分子的核酸分子(其可以稱為多核苷酸)，但是也可以指不構(gòu)成完整基因以及不必編碼多肽或蛋白的核酸分子。例如，當用于同源重組方法中時，可將啟動子置于具有靶向真菌染色體的區(qū)域但是可能不編碼蛋白的序列的構(gòu)建體中。如果需要，可以針對真菌翻譯優(yōu)化目的核苷酸序列，通過優(yōu)化真菌所用的密碼子和真菌的翻譯起始位點周圍的序列。也可以避免導(dǎo)致潛在的mRNA不穩(wěn)定的序列。本發(fā)明的調(diào)控元件可以與分離的目的核苷酸序列一起在表達盒中可操作地連接，用于在期望的真菌或植物或動物中表達。提供了具有多個用于插入在調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄控制下的目的核苷酸序列的限制位點的這類表達盒?？蛇x地，通過提供真菌中一種或多種內(nèi)源產(chǎn)物特別是酶或輔因子的表達降低實現(xiàn)特定結(jié)果。這種下調(diào)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多不同方法實現(xiàn)，包括反義、共抑制、利用發(fā)夾形成或其他方法，并且在下文做了討論。輔因子的引入或輸出也允許控制組成。應(yīng)當認識到，可以以其天然或其他編碼序列使用調(diào)控元件來增加或降低轉(zhuǎn)化的真菌、植物、種子或動物細胞中可操作地連接的序列的表達。用于本發(fā)明目的的目的基因的一般類別包括，例如與信息有關(guān)的基因，如鋅指；與通訊有關(guān)的基因如激酶；以及與管家有關(guān)的基因，如熱休克蛋白。轉(zhuǎn)基因的更具體類別包括，編碼農(nóng)藝重要特性、昆蟲抗性、疾病抗性除草劑抗性以及其他特征的基因。轉(zhuǎn)基因還有的其他類別包括，誘導(dǎo)外源產(chǎn)物如酶、輔因子以及激素表達的基因。其他的類別還包括編碼抗體、次級代謝物、治療化合物、生物大分子、醫(yī)用酶的那些基因；或賦予或有助于增值性狀的基因。實例包括諸如凝集素的次級代謝物，諸如疫苗的治療化合物，諸如干擾素、內(nèi)皮抑素或胰島素的生物大分子，諸如血栓溶解酶或腦苷酶的醫(yī)用酶，以及賦予害蟲、疾病或除草劑抗性的基因，如殺蟲化合物蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)蛋白(Bt毒素)。應(yīng)當認識到，任何目的核苷酸序列，包括天然編碼序列，都可以可操作地連接于本發(fā)明的調(diào)控元件并在真菌中表達。增加或抑制蛋白的方式對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的，并包括但不限于 轉(zhuǎn)基因表達、反義抑制、共抑制、RNA干擾、 利用轉(zhuǎn)錄因子和/或阻抑物的基因激活或抑制；誘變，包括但不限于轉(zhuǎn)座子標記；定向和位點特異性誘變、染色體工程(參見Nobregaet.al.，Nature 431:988-993 (04))、同源重組、TILLING (定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)，Targeting Induced Local Lesions In Genomes)以及操作蛋白表達的生物合成競爭。用于基因沉默的許多技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的，包括但不限于敲除(如通過插入轉(zhuǎn)座兀件如 Mu, Vicki Chandler, The Maize Handbook ch.118 (Springer-Verlag1994)或其他遺傳因子如FRT、Lox或其他位點特異性整合位點；RNA干擾(Napoliet al.(1990)Plant Cell 2: 279-289 ; U.S.Pat.N0.5，034，323，Sharp (1999) GenesDev.13:139-141, Zamore et al.(2000) CelllOl: 25-33 ;以及 Montgomery et al.(1998)PNAS USA 95:15502-15507);病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Burton et al.(2000)Plant Cell12:691-705，和 Baulcombe (1999) Curr.0p.Plant Bi0.2:109-113);革巴-RNA-特異性核酶(Haseloff et al.(1988) Nature 334:585-591);發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Smith et al.(2000) Nature407:319-320;WO 99/53050 ；和 WO 98/53083);MicroRNA(Aukerman&Sakai(2003)PlantCell 15:2730-2741);核酶(Steinecke et al.(1992)EMBO J.11:1525，和 Perriman etal.(1993) Antisense Res.Dev.3:253);寡核苷酸介導(dǎo)的靶向修飾(如 WO 03/076574 和 WO99/25853);鋅指靶向分子(如 WO 01/52620 ;W0 03/048345 ;和 WO 00/42219);以及其他方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的上述方法的組合?？刹僮鞯剡B接于本文所公開的調(diào)控元件的核苷酸序列可以是靶基因的反義序列。(參閱例如 Sheehy et al.(1988)PNAS USA 85:8805-8809 ；和 U.S.Pat.Nos.5，107，065; 5, 453，566 ;和5，759，829)。"反義DNA核苷酸序列"意指采用與所述核苷酸序列的5'-到-3'正常方向相反方向的序列。當被送遞到細胞時，反義DNA序列的表達阻止靶基因DNA核苷酸序列的正常表達。反義核苷酸序列編碼與靶基因的DNA核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的內(nèi)源信使RNA (mRNA)互補且能與之雜交的RNA轉(zhuǎn)錄本。在這種情況下，靶基因所編碼的天然蛋白的產(chǎn)生受到抑制，從而實現(xiàn)期望的表型應(yīng)答。因此，本文所公開的調(diào)控序列可以可操作地連接于反義DNA序列，以減低或抑制真菌天然蛋白的表達。如所指出的，影響真菌中蛋白表達的其他潛在方法包括，傳統(tǒng)的共抑制，即通過表達轉(zhuǎn)化所引入的結(jié)構(gòu)相同的基因或基因片段，抑制內(nèi)源基因的表達(Goring，D.R., Thomson, L., Rothstein, S.J.1991.Proc.Natl. Acad.Sc1.USA 88: 1770-1774co-suppression;Taylor(1997)Plant Cell 9:1245;Jorgensen(1990)Trends Biotech.8(12):340-344;Flavell(1994)PNAS USA91:3490-3496;Finnegan et al.(1994)Bio/Technology 12:883-888 ;以及Neuhuber et al.(1994) Mol.Gen.Genet.244:230-241))。在一實例中，共抑制可以通過以下實現(xiàn):將啟動子連接于DNA節(jié)段，從而使得所述節(jié)段的轉(zhuǎn)錄本在有義方向產(chǎn)生，且其中所述轉(zhuǎn)錄本與目的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄本具有至少65%的序列相同性，從而抑制所述真菌細胞中內(nèi)源基因的表達。(參見U.S.Pat.N0.5，283，184)。靶向共抑制的內(nèi)源基因可以是編碼在目的真菌物種中積累的任何蛋白的基因。下調(diào)的其他方法是本領(lǐng)域已知的，并且可以同樣應(yīng)用于本發(fā)明。這些方法包括通過剪接的發(fā)夾RNA ' s和也稱為RNA干擾和啟動子沉默的相似方法沉默祀基因(參見 Smith et al.(2000)Nature 407:319-320, Waterhouse andHeIli we11 (2003)) Nat.Rev.Genet.4:29-38;Waterhouse et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 95:13959-13964;Chuang and Meyerowitz (2000)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 97:4985-4990;Stoutjesdijk et al.(2002)Plant Physiol.129:1723-1731 ；和Patent Application WO 99/53050;WO 99/49029;WO 99/61631;WO 00/49035 和 U.S.Pat.N0.6, 506, 559。對于mRNA干擾，將表達盒設(shè)計為在內(nèi)源miRNA基因上建模的RNA分子。miRNA基因編碼形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)含有與另一內(nèi)源基因(靶序列)互補的22-核苷酸序列。miRNA分子高效抑制內(nèi)源基因的表達，且它們誘導(dǎo)的RNA干擾被下一代真菌繼承。本發(fā)明的調(diào)控區(qū)也可以與另一啟動子聯(lián)合使用。在一實施方案中，真菌選擇標記和目的基因可以功能性連接于同一啟動子。在另一實施方案中，選擇標記和目的基因可以功能性連接于不同的啟動子。還在另一實施方案中，表達載體可以含有2個或更多個可以連接于同一啟動子或不同啟動子的目的基因。例如，本文所述的SB-LEG啟動子可以用于驅(qū)動目的基因和選擇標記，或針對一個或另一個使用不同的啟動子。這些其他啟動子元件可以是這樣的啟動子元件，其是組成型的或足以使啟動子依賴性基因表達細胞類型特異性地、組織特異性地或時間或發(fā)育階段特異性地或外部信號或試劑可誘導(dǎo)地可控。這類元件可以位于基因的5'或3'區(qū)。盡管其他啟動子可以是目的結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)源啟動子，但是啟動子也 可以是外源調(diào)控序列。用于控制產(chǎn)物蛋白和選擇基因表達的啟動子元件可以是任何兼容的啟動子。這些可以是具有真菌活性的真菌基因啟動子，諸如例如gpd啟動子，或來自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒的啟動子，如胭脂堿合酶、章魚堿合酶以及甘露堿合酶啟動子(Velten，J.and Schell，J.(1985)" Selection-expression plasmid vectors for use in genetic transformationof higher plants" Nucleic Acids Res.13:6981-6998;Depicker et al., (1982)Mol.and Appl.Genet.1:561-573Shaw et al.(1984)Nucleic Acids Research vol.12, N0.20pp.7831-7846);或病毒啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV) 19S和35S啟動子(Guilleyet al.(1982) " Transcription of Cauliflower mosaic virus DNA:detection ofpromoter sequences, and characterization of transcripts " Cel130:763-773;OdelI et al.(1985)" Identification of DNA sequences required for activity of thecauliflower mosaic virus 35S promoter" Nature 313:810-812,玄參花葉病毒FLt啟動子(Maiti et al.(1997)" Promoter/leader deletion analysis and plant expressionvectors with the figwort mosaic virus (FMV) full length transcript (FLt) promotercontaining single or double enhancer domains " Transgenic Res.6:143-156)或TMV 的包被蛋白啟動子(Grdzelishvili et al., 2000) " Mapping of the tobaccomosaic virus movement protein and coat protein subgenomic RNA promoters invivo" Virology 275:177-192)。表達盒也可以在分離的目的核苷酸序列的Y端包括在真菌中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。終止區(qū)可以是本發(fā)明的啟動子核苷酸序列天然的終止區(qū)，可以是目的DNA序列天然的終止區(qū)，或可以來源于另一來源。因此，任何常見的終止區(qū)都可以與本發(fā)明的啟動子聯(lián)合使用，并且可從根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒獲得，如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。還參見:Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144; Proudfoot (1991) Cell64:671-674;Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5:141-149;Mogen et al.(1990)PlantCell2:1261-1272;Munroe et al.(1990)Gene 91:151-158;Balias et al.1989)NucleicAcids Res.17:7891-7903;Joshi et al.(1987)Nucleic Acid Res.15:9627-9639。表達盒還含有5'前導(dǎo)序列。這類前導(dǎo)序列可以發(fā)揮增強翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括:小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎 5'非編碼區(qū))，Elroy-Stein et al.(1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 86:6126-6130;馬鈴薯Y病毒屬前導(dǎo)序列，例如TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus)), Allison et al.(1986) ;MDMV 前導(dǎo)序列(Maize dwarf mosaicvirus), Virology 154:9-20 ;人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP), Macejak et al.(1991)Nature 353:90-94 ;來自苜猜花葉病病毒(Alfalfa mosaic virus)包被蛋白mRNA的非翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA 4)，Jobling et al.(1987)Nature 325:622-625);煙草花葉病病毒(Tobacco mosaic virus)前導(dǎo)序列(TMV), Gallie et al.(1989) Molecular Biology ofRNA, pages237_256 ;以及玉米枯黃斑點病毒(Maize chlorotic mottle virus)前導(dǎo)序列(MCMV), Lommel et al.(1991) Virology 81:382-385。還參見Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiology84:965_968。盒也可以含有增強翻譯和/或mRNA穩(wěn)定性的序列，如內(nèi)含子。在期望分離的核苷酸序列的表達的產(chǎn)物定向特定細胞器特別是質(zhì)體、淀粉體或定向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或分泌在細胞表面或細 胞外的情況下，表達盒還可以包含轉(zhuǎn)運肽的編碼序列。這類轉(zhuǎn)運肽在本領(lǐng)域中是熟知的，并且包括但不限于:酰基載體蛋白的轉(zhuǎn)運肽、RUBISC0的小亞基、植物EPSP合酶等。在制備表達盒時，可以操作各種DNA片段，從而在適當?shù)姆较蛏?，并且如果合適，在適當?shù)木幋a框中提供DNA序列。為此目的，可以使用連接物或接頭來連接DNA片段，或可以包括其他操作以提供常規(guī)限制位點、除去多余的DNA、除去限制位點等。為此，可以涉及體外誘變、引物修復(fù)、限制消化以及再取代，如轉(zhuǎn)換和顛換。可以將報道基因包括于轉(zhuǎn)化載體中。本領(lǐng)域已知的合適的報道基因的實例可以見于例如:Jefferson et al.(1991) in Plant Molecular Biology Manual, ed.Gelvin et al.(Kluwer Academic Publishers)，pp.1-33;DeWet et al.(1987)Mol.Cell.Biol.7:725-737;Goff et al.(1990)EMBO J.9:2517-2522;Kain et al.(1995)BioTechniques 19:650-655 ;以及 Chiu et al.(1996) Current Biology6:325-330。用于選擇轉(zhuǎn)化的細胞或組織的選擇標記基因可以包括于轉(zhuǎn)化載體中。這些可以包括賦予抗生素抗性或除草劑抗性的基因。合適的選擇標記基因的實例包括但不限于:編碼針對以下的抗性的基因:氯霉素Herrera Estrella et al.(1983)EMBOJ.2:987-992 ;甲氨蝶呤，Herrera Estrella et al.(1983)Nature303:209-213;Meijeret al.(1991)Plant Mol.Biol.16:807-820 ;潮霉素，Waldron et al.(1985)Plant Mol.Biol.5:103-108;Zhijian et al.(1995)Plant Science 108:219-227 ;鏈霉素，Joneset al.(1987)Mol.Gen.Genet.210:86-91 ;壯觀霉素，Bretagne-Sagnard et al.(1996)Transgenic Res.5:131-137 ;博來霉素，Hille et al.(1990)Plant Mol.Biol.7:171-176 ；橫酸胺，Guerineau et al.(1990)Plant Mol.Biol.15:127-136 ；溴苯臆，Stalker etal.(1988)Science242:419-423 ;草甘膦，Shaw et al.(1986) Science 233:478-481 ;草丁磷，DeBlock et al.(1987) EMBO J.6:2513-2518，包括玉米“優(yōu)化”的"pat"基因，Gordon-Kamm(1990)The Plant Cell 2:603;Uchimiya et al.(1993)Bio/Technology11:835 ;以及 Anzai et al.(1989)Mol.Gen.Gen.219:492)。此外，當本發(fā)明的啟動子與編碼可檢測蛋白的核苷酸序列連接時，可以在真菌中追蹤連接的序列的表達，從而提供有用的篩選或評分標記?？梢詸z測連接的蛋白的表達，而無需破壞組織。作為實例而非限制，啟動子可以與可檢測的標記連接，包括β-葡萄糖醛酸酶或UidA基因(⑶S)，其編碼各種顯色底物已知的酶(Jefferson etal.，1986, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:8447-8451);氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶；堿性磷酸酶；R-基因座基因，其編碼調(diào)控組織中花青素色素(紅色)產(chǎn)生的產(chǎn)物(Dellaporta etal., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appelsand Gustafson eds., pp.263-282 (1988) ; Ludwig et al.(1990) Science247:449) ;p-內(nèi)酸胺酶基因(Sutcliffe, Proc.Nat' 1.Acad.Sc1.U.S.A.75:3737 (1978))，其編碼各種顯色底物已知的酶(如PADAC,顯色頭孢霉素)；xylE基因(Zukowsky et al., Proc.Nat' 1.Acad.Sc1.U.S.A.80:1101 (1983))，其編碼可以轉(zhuǎn)變顯色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶；α -淀粉酶基因(Ikuta et al., Biotech.8:241 (1990));酪氨酸酶基因(Katz et al., J.Gen.Microbiol.129:2703(1983))，其編碼能將酪氨酸氧化為DOPA和多巴醌的酶，其轉(zhuǎn)而濃縮形成易于檢測的化合物黑色素；綠色熒光蛋白(GFP)基因(Sheen et al.，PlantJ.8 (5): 777-84 (1995)) ;lux基因，其編碼熒光素酶，熒光素酶的存在可以利用例如X-射線膠片、閃爍計數(shù)、突光分光光度法、微光攝影機(low-light video camera)、光子計數(shù)攝像機或多孔發(fā)光檢測儀(multiwell luminometry)來檢測(Teeri et al.(1989)EMBOJ.8:343) ；DS-RED EXPRESS (Matz et al.(1999)Nature Biotech.17:969-973，Beviset al.(2002)Nature Biotech20:83-87，Haas et al.(1996)Curr.Biol.6:315-324)；已經(jīng)為了更亮的熒光而被改造的?？?Zoanthus sp.)黃色熒光蛋白(ZsYellow) (Matzet al.(1999) Nature Biotech .17:969-973,可獲得自 BD Biosciences Clontech, PaloAlto, Calif., USA, catalog n0.632443);以及青色突光蛋白(CYP) (BoIte et al.(2004)J.Cell Science 117:943-54 和 Kato et al.(2002)Plant Physiol 129:913-42)。如本文所指出的，本發(fā)明提供了能在調(diào)控元件的控制下表達目的基因的載體。通常，載體在真菌細胞中應(yīng)當是功能性的。一般而言，優(yōu)選在E.coli中是功能性的載體(如產(chǎn)生用于引發(fā)抗體的蛋白、DNA序列分析、構(gòu)建插入物、獲得大量核酸)。用于在E.coli中克隆和表達的載體和方法討論于Sambrook et al.(同上)。包含在表達盒中可操作地連接于分離的核苷酸序列的本發(fā)明的調(diào)控序列的轉(zhuǎn)化載體也可以含有至少一個其他待共轉(zhuǎn)化到生物體中的基因的核苷酸序列?？蛇x地，可以將其他序列提供于另一轉(zhuǎn)化載體上。在真菌中是功能性的載體可以是來源于農(nóng)桿菌(Agrobacterium)的二元質(zhì)粒。這類載體能轉(zhuǎn)化真菌細胞。這些載體含有整合到宿主染色體所需的左右邊界序列。至少，待在本發(fā)明調(diào)控元件控制下表達的基因位于這些邊界序列之間。在一實施方案中，還包括選擇標記和報道基因。包含在表達盒中可操作地連接于分離的目的核苷酸序列的本發(fā)明的具體調(diào)控序列的轉(zhuǎn)化載體可以用于轉(zhuǎn)化任何真菌。以此方式，可以獲得遺傳學(xué)修飾的真菌、真菌細胞、真菌組織等。轉(zhuǎn)化方案可以變化，這取決于細胞類型。轉(zhuǎn)化真菌細胞的合適方法包括顯微注射 Crossway et al.(1986)Biotechniques 4:320-334 ;電穿孔，Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 83:5602-5606 ;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，參見例如 Townsend etal.U.S.Pat.N0.5, 563, 055; Romaine et al US Pat N0.7，700，439，直接基因轉(zhuǎn)移，Paszkowski et al.(1984) EMBO J.3:2717-2722 ;以及彈道粒子加速，參見例如 Sanford etal.U.S.Pat.N0.4, 945, 050。依照常規(guī)方法可以使已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞生長成真菌。隨后可以用相同的轉(zhuǎn)化菌株或不同的菌株繁殖這些真菌。接著可以鑒定組成型表達期望的表型特征的所得真菌?？梢陨L兩代或更多代以確保期望的表型特征的組成型表達得到穩(wěn)定維持和遺傳。下述實施例意圖進一步說明本發(fā)明，無論如何并非限制本發(fā)明。本文的實施例和討論具體涉及雙孢蘑菇，然而本文的教導(dǎo)同樣適用于任何其他真菌，優(yōu)選產(chǎn)生肉質(zhì)子實體的絲狀真菌。
實施例實施例1.從雙孢蘑菇鑒定高表達凝集素基因序列利用總可溶蛋白的2-D蛋白譜，確定凝集素基因在雙孢蘑菇子實體中高表達。所選的子實體(商業(yè)中間雜交菌株)接近成熟，但是無外露的菌褶。將新近收獲的子實體組織在液氮中冷凍，利用研缽及研杵研磨，用冷丙酮與20%三氯乙酸鹽和0.2% 二硫蘇糖醇提取，并提交至Alphalyse Inc.(Palo Alto, CA),用于2_D蛋白譜。所得的凝膠圖像顯示于圖1中。圖1.雙孢蘑菇子實體蛋白的2-D凝膠分析根據(jù)制造商的推薦,利用Invitrogen的IPG drystrips進行一維等電聚焦并利用NuPAGE預(yù)制凝膠系統(tǒng) 進行二維分離來在2-D SDS PAGE上實施蛋白分離。數(shù)字標記用于MS和MS/MS分析而切除的蛋白斑點。電泳后，基于2-D凝膠圖像上的染色強度，幾個蛋白被鑒定為高度豐富。蛋白#4、#6以及#7(圖1)最豐富，因此，選擇其用于其他分析，包括Alphalyse Inc所進行的肽作圖和測序分析。將所得的蛋白#4、#6和#7的肽圖譜和部分肽序列信息針對AlphalyseInc所制作的蛋白數(shù)據(jù)庫進行blast搜索，并顯示匹配雙孢蘑菇凝集素基因的cDNA序列(U14936, Crenshaw et al.1996)。3個蛋白共享相同的氨基酸序列。所觀察到的凝集素蛋白分離成3個不同的蛋白斑點，可能反映了翻譯后修飾的變化，如糖基化。實施例2:包含啟動子的凝集素基因的5’上游DNA區(qū)的分離和序列測定利用基因組步移(APAgene Gold Genome Walking Kit, BIO S&T Inc.Montreal, QC, Canada)進行凝集素基因的基因組5’上游DNA區(qū)的分離。根據(jù)凝集素cDNA序列設(shè)計下述引物:凝集素-Fl (5’-TTCGTTCAACGGGACGGAAGAAGCCTTT-3，)和凝集素-F2 (5’-TCTGGTAGACGCGAATGCTGATGGTGTA-3’)(Crenshaw et al.，1995)，并用于基因組步移。利用AquaGenomic Kit (MultiTarget Pharmaceuticals LLC, Salt Lake City, Utah)提取雙抱蘑菇的基因組DNA，并用作根據(jù)APAgeneTMG0ld Genome Walking Kit提供的方案進行基因組步移PCR的模板。簡而言之，將4份15- μ I PCR反應(yīng)混合物的等分試樣添加于標有A、B、C和D的PCR管，對于管A和B利用3x APAgene Gold緩沖液I，對于管C和D利用APAgene Gold緩沖液II。15μ I初級PCR混合物含有5μ I 3x APAgene Gold緩沖液、0.3 μ I 50x PCR退火增強劑、0.4μ I 40mM dNTPs、0.7μ1 20pmol/μ I 凝集素 _F1、I μ I 基因組 DNA ( IOOng)、
0.2 μ I (IU)Taq DNA聚合酶(Platinum Taq, Invitrogen, Carlsbad, CA)以及7.4μ I水。PCR程序由以下組成:94°C下I個循環(huán)4min，隨后25個循環(huán)94°C 30sec、63°C lOsec，以0.1°C /sec 斜升至 66°C，并 68°C 3min，最后一個循環(huán) 68°C lOmin。PCR 擴增后，將 0.3 μ I (1.5U)Taq聚合酶添加于每一管中，并將I μ I 15χ簡并隨機標記(DRT)引物Α、B、C和D分別添加于Α、B、C和D管中。將反應(yīng)混合物渦旋并進行第二 PCR程序，第二 PCR程序由以下組成:94°C 2min，隨后 94°C 30sec—個循環(huán)，25°C lOsec，以 0.1°C/sec 斜升至 65°C，68°C6min,然后 94°C 30sec 20 個循環(huán)，55°C 30sec, 68°C 2min 和 50sec,以及最后一個循環(huán)68°C 30min。第二次PCR擴增后，將來自A、B、C和D管的的0.5 μ I PCR產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)移至標有A1、B1、C1和Dl的管。將I μ I IOx DRT引物消化緩沖液的等分試樣添加于具有0.5 μ I消化酶和8μ I水的每一管中。渦旋消化混合物，并于37°C孵育30min。然后于95°C將消化混合物中的酶熱失活5min。消化反應(yīng)后，利用巢式PCR擴增凝集素基因上游的5’基因組。對于巢式PCRJf 15 μ I反應(yīng)混合物添加于標有A2、B2、C2和D2的4個管中的每一管，A2和B2管利用3x APAgene Gold緩沖液I，對于C2和D2管利用APAgene Gold緩沖液
II。用于巢式PCR的15μ I反應(yīng)混合物含有5μ I 3x APAgene Gold緩沖液(I或II)、
0.3μ I 50x PCR 退火增強劑、0.3μ I 40mM dNTPs、0.4μ1 20pmol/μ I 凝集素-F2 引物、
0.4μ I通用標記引物、0.5μ I來自A1、B1、C1或Dl的消化的PCR產(chǎn)物、0.3 μ I Taq DNA聚合酶(InvitiOgen)以及7.8μ1水。擴增推斷的凝集素基因的巢式PCR程序由以下組成:94°C 4min —個循環(huán)，然后 30 個循環(huán)，94°C 30sec、62°C lOsec、以 0.1°C/sec 斜升至 65°C，之后68°C 2min和30sec,最后一個循環(huán)68°C IOmin0利用凝膠電泳，在1%的瓊脂糖凝膠上，在 Ix TBE(lxTRIS/B0RATE/EDTA、54g Tris 堿、27.5g 硼酸、20ml 0.5M EDTA(pH 8.0)，1000ml)上分離PCR產(chǎn)物。反應(yīng)A2、C2和D2的PCR產(chǎn)物的大小范圍為約400bp至約600bp。利用Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen),從瓊脂糖凝膠中回收擴增子。利用Τ0Ρ0 TA Cloning Kit (Invitrogen)、遵循制造商的方案,將凝集素基因上游推斷的5’基因組DNA區(qū)的PCR擴增產(chǎn)物克隆到pCR2.1 Τ0Ρ0載體中。簡而言之，將從瓊脂糖凝膠中回收的4μ I PCR產(chǎn)物添加于6μ I pCR2.1連接反應(yīng)中。在室溫下連接5min后，用3μ I每一種反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化0NE-SH0T DH5a化學(xué)感受態(tài)細胞(Invitrogen)。將轉(zhuǎn)化的細胞鋪平板，并在LB (Growce 11 S，Irvine, CA)瓊脂板中選擇,所述瓊脂板含有50 μ g/ml 卡那霉素與涂抹于表面上的 40 μ I 40mg/ml X-gal (MP Biomedicals, Solon, Ohio) 于37°C避光過夜孵育后，挑選白色菌落用于質(zhì)粒DNA制備。將質(zhì)粒DNA用EcoRI消化，并在IxTBE(如上文所述)中利用1%瓊脂糖凝膠分離，以鑒定具有正確的插入大小的克隆。含有A2反應(yīng)的PCR產(chǎn)物的克隆稱為pAGN-743，來自C2反應(yīng)的稱為pAGN_744，以及來自D2的稱為 pAGN-745。
通過利用M13R反向引物對pAGN-743、pAGN-744和pAGN745中的插入物進行測序，測定凝集素基因啟動子的核苷酸序列。pAGN-743、pAGN-744和pAGN-745克隆的插入序列間的比對表明3個PCR產(chǎn)物重疊。pAGN745克隆(pAGN_745_l、-2和-3)含有凝集素基因上游最長的5’基因組DNA區(qū)。利用來自pAGN-745克隆的序列信息，產(chǎn)生凝集素基因上游5’基因組DNA區(qū)的共有序列。共有序列與凝集素基因5’端cDNA序列的重疊證實，基因組步移所產(chǎn)生的DNA片段代表凝集素基因的啟動子區(qū)?；蚪M步移所產(chǎn)生的基因組DNA序列與凝集素cDNA序列(U14936, Crenshaw et al.1996)之間的比對揭示了凝集素mRNA5’UTR中的內(nèi)含子。用“所有GenBank+EMBL+DDBJ+PDB序列”進行的凝集素基因上游5 ’基因組DNA區(qū)共有序列的核苷酸blast搜索(blastn)未能表現(xiàn)出與任何已知序列的相同性，這表明分離的序列是新啟動子。實施例3:證明凝集素啟動子在雙孢蘑菇中指導(dǎo)⑶S報道基因表達的能力構(gòu)建二元載體pAGN-750 (圖2)以檢測凝集素啟動子(稱為pLctn)驅(qū)動β -葡萄糖醛酸酶(OTS)報道基因在雙孢蘑菇中表達的能力。利用引物Lctn-BglII (5’-AGCTTAGATCTGAACACGCG TCGTTTACCTCC-3’)和 Lctn-NcoI (5’-GTAAGTCCATGGTCTGCTCAACGTTATGAGTTAGTTG-3’)，從pAGN-745擴增pLctn。將限制酶位點BglII和NcoI并入引物中來利于克隆。用Bglll/Ncol消化PCR產(chǎn)物，并用消化的產(chǎn)物取代⑶S表達載體pAGN-030中的BglI1-Nc0I片段，以產(chǎn)生pAGN-750。利用測序證實pAGN-750中的序列。遵循Chen et al.(2000)所述的轉(zhuǎn)化方法，將pAGN-750引入根癌農(nóng)桿菌并隨后引入雙孢蘑菇。針對營養(yǎng)菌絲和生殖子實體中GUS表達(Sean R.Gallagher, 1991的GUS方案)，分析pAGN-750所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因事件。為了測定菌絲中⑶S表達，使轉(zhuǎn)基因事件的菌絲在濾紙上于含有30 μ g/ml潮霉素B的SM瓊脂板中建群10-14天?；谠跒V紙上暴露于染色緩沖液的菌絲菌落中存在的綠色強度，評估菌絲中GUS表達(圖3)。該研究的結(jié)果表明，在雙孢蘑菇營養(yǎng)生長階段，pLctn驅(qū)動⑶S表達。還評估了子實體組織中的⑶S表達。用轉(zhuǎn)基因事件的菌絲接種生長培養(yǎng)基，用于產(chǎn)生蘑菇。在潮霉素上轉(zhuǎn)化并選擇轉(zhuǎn)基因系后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基(2%麥芽提取物培養(yǎng)液(Difco)，并于室溫下維持于此，暫停子實體培養(yǎng)基接種。液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物與滅菌的黑麥/小米顆粒混合物(50:50)在滅菌的250ml塑料容器中混合，并且轉(zhuǎn)基因雙孢蘑菇菌絲在室溫下在顆?；|(zhì)上建群約2周。將完全建群的顆粒用3cm深的泥炭腐殖質(zhì)套管混合物(peat humus casing mixture)覆蓋,并當菌絲出現(xiàn)于套管的頂部時,將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到18°C培養(yǎng)箱。給培養(yǎng)物頻繁施水，以維持生物體優(yōu)選的濕潤生長環(huán)境。在孢子形成之前，收獲成熟的子實體，且直接置于-80°C用于儲存或未來分析，或?qū)τ趃us表達系，簡單儲存于4°C,然后利用GUS可視染色或MUG定量測定進行分析。為了使gus基因表達可視，將每一子實體的3-mm厚的切片浸入⑶S染色緩沖液中。根據(jù)組織中顯色強度的可視評估，記錄子實體中的⑶S表達(表I)。該研究結(jié)果(表1，圖3)表明，pLc tn可以指導(dǎo)雙孢蘑菇生殖子實體中⑶S高水平積累。對于pAGN-750構(gòu)建體，觀察到不同的獨立轉(zhuǎn)基因事件間染色強度水平的變化。這種變化可以由轉(zhuǎn)基因整合到不同的染色體位置所致的序列環(huán)境差異和/或事件間轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)量的差異來解釋，這對于轉(zhuǎn)化到雙孢蘑菇中的其他啟動子/轉(zhuǎn)基因組合而言常觀察到，并且常報道于其他植物、動物和真菌系統(tǒng)中(Peach C.and Velten J.1991; Siegal M.L.and HartlD.L.1998; Butaye et al.2005)。選擇5個事件的子實體，以利用MUG (4-甲基傘型基葡糖苷酸)測定(Gallagher，S.R.1991)定量測量⑶S活性。為了提取用于MUG測定的總可溶蛋白，將IOOmg子實體組織與3個玻璃珠(直徑3.5mm) 一起添加于含有300ul PBS緩沖液(IX PBS:8g NaCl, 0.2gKCl, 1.44g Na2HPO4 和 0.24g KH2PO4,1000ml, pH7.4)的試管中，并以 400 次擊打 /min 用 Geno/Grinder (SPEX SamplePrep 2000 Geno/Grinder, SPEXSamplePrep LLC, Metuchen, NJ)均質(zhì)化 3min。遵循制造商 BCA Protein Assay Kit (ThermosScientific, Rockford, IL)的用法說明，定量可溶性提取物中的蛋白濃度。子實體組織中GUS活性定量，表示為MUG讀數(shù)/ μ g從組織提取的總可溶蛋白。MUG測定數(shù)據(jù)(表2)證實了子實體中⑶S表達的定性分析結(jié)果。結(jié)果顯示于圖3中。
表1.子實體組織中⑶S積累的可視評分
權(quán)利要求
1.分離的調(diào)控元件，其驅(qū)動目的蛋白或核苷酸序列在子實體組織中的積累，其中所述調(diào)控元件包含SEQ ID NO:USEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
2.包含權(quán)利要求1的調(diào)控元件的表達盒，其中所述調(diào)控元件可操作地連接于核苷酸序列。
3.用權(quán)利要求2的表達盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的真菌。
4.權(quán)利要求3的真菌，其中所述真菌是絲狀真菌。
5.權(quán)利要求4的真菌,其中所述絲狀真菌是傘菌屬(Agaricus)物種。
6.權(quán)利要求3的真菌的子實體組織，其中所述組織包含所述表達盒。
7.在真菌細胞中表達核苷酸序列的方法，所述方法包括: a)用表達盒轉(zhuǎn)化真菌細胞，所述表達盒包含可操作地連接于核苷酸序列的分離的調(diào)控元件，其中所述調(diào)控元件包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；以及b)使所述真菌細胞生長以表達所述核苷酸序列。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述分離的調(diào)控元件起始所述核苷酸序列的表達并實現(xiàn)在子實體組織細胞中表達。
9.權(quán)利要求7的方法，還包括從所述真菌細胞再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的真菌；其中所述核苷酸序列的表達改變所述真菌的表型。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述真菌是絲狀真菌。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述絲狀真菌是傘菌屬物種。
12.權(quán)利要求9的方法， 其中所述真菌所產(chǎn)生的子實體組織包含所述表達盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了調(diào)控真菌中核苷酸序列表達的組合物和方法。所述組合物是分離自雙孢蘑菇凝集素基因的組織偏好性啟動子的新的核苷酸序列。所述序列偏好驅(qū)動表達至子實體組織。提供了利用本文所公開的調(diào)控序列在真菌中表達核苷酸序列的方法。所述方法包括，轉(zhuǎn)化真菌細胞從而包含可操作地連接于本發(fā)明的一個或多個調(diào)控序列的核苷酸序列，并由轉(zhuǎn)化的細胞再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的真菌。
文檔編號C12N1/15GK103180433SQ201180051472
公開日2013年6月26日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者Z·石, J·Q·威爾金森, D·S·瓦爾特斯, C·P·羅曼 申請人:英特拉克森公司