專利名稱：直接克隆的制作方法
直接克隆 從DNA混合物如基因組DNA或cDNA制備物中克隆DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)程序包括從蛋白、脂質(zhì)以及其它污染物中純化DNA，通常在限制性酶切后將該DNA制備物連接到克隆載體上以制備文庫。由于文庫通常為克隆DNA片段的復(fù)雜混合物，因此回收特定的DNA片段需要采用幾種費力的方法之一來篩選文庫。特定的DNA片段通常不是包含在單克隆中的，而是需要由兩個或多個克隆重新構(gòu)建或者伴隨需要移除的不需要的側(cè)翼序列(flankingsequence)ο這些額外的亞克隆步驟使克隆的DNA文庫方法更加費力。由于對人類疾病更加深入的了解，患者特定治療方法的發(fā)展將變得更加普遍，包括患者特定基因修正方法的發(fā)展。理想地，患者特異基因修正可采用獲得自患者的有問題的DNA區(qū)域，在實驗室中修正并重新插入到患者體內(nèi)。此外，下一代基因測序技術(shù)(例如454、Solexa或S0LiD4)的發(fā)展允許在不構(gòu)建基因文庫的情況下獲得基因組序列數(shù)據(jù)。該方法稱為“宏基因組學(xué)·，”目前在沒有伴隨基因文庫資源的情況下，已經(jīng)了解了許多種類的大量的基因組序列數(shù)據(jù)，所述基因組序列數(shù)據(jù)在原核基因組的情況下可以是完整的。但是，功能研究需要獲得并且操縱編碼待研究的基因的克隆的DNA。因此需要一種新的技術(shù)以直接從基因組DNA池中將特定的DNA區(qū)域克隆到載體中，在本文中稱為“直接克隆?！贝送?，在合成生物學(xué)中線性DNA片段組裝的需求增加。這些線性DNA可以是ssDNA，優(yōu)選寡核苷酸，或dsDNA。DNA片段的合成生物組裝已用于產(chǎn)生基因、操縱子、染色體，并且最近用于產(chǎn)生整個基因組(參見參考文獻42)。包括多于10個不同DNA分子的組裝方法通常使用傳統(tǒng)的DNA連接或由Red操縱子介導(dǎo)的同源重組或釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)細(xì)胞的內(nèi)源性機制。因此開發(fā)一種按照確定的順序組裝DNA片段的新方法的需求增加。之前已描述過通過同源重組進行直接克隆和亞克隆，也稱為“缺口修復(fù)克隆”或“線性到線性”(1-4)。術(shù)語“克隆”涉及一種通過連接于載體并在宿主細(xì)胞中增殖而從初始來源擴增DNA片段方法，所述宿主細(xì)胞通常為大腸桿菌(E. coli)或酵母。術(shù)語“亞克隆”涉及一種已經(jīng)通過前述的克隆或PCR從初始來源擴增的DNA片段在宿主細(xì)胞中增殖的方法。除前述的直接克隆外，也描述了線性到線性同源重組的亞克隆應(yīng)用(例如，參見克隆試劑盒CkmeEZ PCR Cloning Kit http://www. genscript. com/cloneez_P CR_Cloning_kit.html;或 Cold Fusion Cloning Kit http://www.systembio.co m/cold-fusion-cloning/)。目前通過同源重組進行亞克隆的方法不是很有效。但是，由于底物DNA片段在亞克隆之前基本上是純的，因此并不需要高效。已經(jīng)使用酵母實現(xiàn)了從基因組DNA制備物中直接克隆基因(8-12)。但是，該方法存在技術(shù)上的挑戰(zhàn)，并且由于在酵母中重組不可控，因此克隆的DNA分子在基因方面通常不穩(wěn)定。因此在酵母中進行直接克隆僅僅限制于實驗室(V. Larionov-參見Selectiveisolation of mammalian gene s by TAR cloning. Kouprina Nj Larionov V. Curr ProtocHum Genet. 2006May; Chapter5:Unit5. 17)。之前將該酵母技術(shù)商業(yè)化的嘗試失敗了(Biotech company"Caliper"in Boston 于 2002 年關(guān)閉)。
由于表達(dá)rac卩遼菌體蛋白RecE和RceT,大腸桿菌sbcA菌株在線性到環(huán)狀同源重組(在此處稱為“LCHR”)中非常有效(5-7)。由于RecE和RecT與λ噬菌體蛋白中的Reda和RedP同源，Reda和RedP也顯不可以介導(dǎo)非常有用和高效的同源重組。通過表達(dá)RecE/RecT或Red a /Red β，線性到線性同源重組(在本文中稱為“LLHR”)也大大增加。目前RecE/RecT介導(dǎo)的同源重組使用了截短形式的RecE。AJ Clark最初發(fā)現(xiàn)的RecE為279個氨基酸的5’到3’外切酶(RecE588)(參見文獻5)。在5’端缺少14個氨基酸的較短形式(RecE602)也顯示出LCHR和LLHR活性。該形式已經(jīng)被結(jié)晶(Structure.2009Mayl3;17(5):690-702. C rystal structure of E.coli RecE protein reveals atoroidal tetramer for p rocessing double-stranded DNA breaks.),并且與相似大小的5’到3’核酸外切酶Reda相當(dāng)。這些RecE類型是原始的866個氨基酸長的rac噬菌體基因的截短形式。RecE的較短形式(RecE602)對應(yīng)于最后的約265個氨基酸。換言之，與截短的RecE602相比，全長的RecE在其N-末端具有額外的601個氨基酸，而與截短的RecE588相比，全長的RecE在其N-末端具有額外的587個氨基酸。在大腸桿菌中，通過RecET介導(dǎo)的重組，DNA池中的基因可以通過一步反應(yīng)克隆入線性載體中(7)。但是，該系統(tǒng)非常低效，不能常規(guī)的用于從基因組DNA制備物中直接克隆。特別的，它不能允許直接克隆隨DNA池的復(fù)雜性而改變的超過一定大小的DNA片段。在復(fù)雜性較低的池中，如原核基因組DNA制·備物，已有的技術(shù)允許直接克隆一些大于IOkb的DNA區(qū)域。在復(fù)雜性較高的池中，如哺乳動物基因組DNA制備物，已有的技術(shù)僅允許以非常低的效率直接克隆短DNA區(qū)域(2kb左右)。本發(fā)明的一個目的是改進克隆方法。特別的，本發(fā)明的一個目的是提供一種直接克隆的方法，所述方法可以用作從DNA池中釣出感興趣基因的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種改進的亞克隆方法。本發(fā)明的另一目的是提供改進的用于復(fù)雜DNA工程任務(wù)的方法，如將多個DNA片段組裝成精確的產(chǎn)物。發(fā)明概沭在第一個方面中，本發(fā)明提供一種在共享至少一個序列同源性區(qū)域的第一核酸分子和第二核酸分子之間進行同源重組的方法，其中所述方法包括在5’到3’核酸外切酶和退火蛋白存在下，將第一核酸分子與第二核酸分子接觸；其中，所述5’到3’核酸外切酶包括具有5’到3’核酸外切酶活性的區(qū)域并且至少i)SEQ ID NO:1 的氨基酸 564-587 ;或ii)24個氨基酸的序列，所述序列與SEQ ID NO:1的第564-587位氨基酸在其24個氨基酸序列全長上具有至少70%的同一性。在第二個方面中，提供了一種在至少一個與經(jīng)受同源重組的核酸分子無序列同源性的單鏈寡核苷酸存在的情況下進行同源重組而提高同源重組效率的方法，其中，與當(dāng)所述至少一個單鏈DNA寡核苷酸不存在時進行同源重組相比，同源重組的效率提高了。在第三個方面中，提供了一種在共享至少一段序列同源性區(qū)域的第一核酸分子和第二核酸分子之間進行同源重組的方法，包括在進行體內(nèi)同源重組之前采用稀有切割序列特異性DNA切割酶對至少一個體內(nèi)環(huán)狀核酸分子進行線性化以生成所述第一和/或所述第二核酸分子的步驟。發(fā)明詳沭驚奇的發(fā)現(xiàn)可以采用RecE來介導(dǎo)同源重組，所述RecE含有不存在于現(xiàn)有同源重組技術(shù)中使用的截短型RecE中的內(nèi)源性N-末端RecE序列的部分。此外，驚奇的發(fā)現(xiàn)采用這樣的N末端延伸的RecE可以提高LLHR的效率。使用全長RecE可以獲得最高的LLHR效率，因此本發(fā)明優(yōu)選地包括使用全長RecE介導(dǎo)LLHR。來自大腸桿菌K12的全長RecE的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO:1)
權(quán)利要求
1.一種用于在共享至少一段序列同源區(qū)域的第一核酸分子和第二核酸分子之間進行同源重組的方法，其中所述方法包括在5’到3’外切核酸酶和退火蛋白的存在下，將所述第一核酸分子與所述第二核酸分子接觸； 其中所述5’到3’外切核酸酶包含具有5’到3’外切核酸酶活性的區(qū)域并且至少包含 i)SEQ ID NO:1的第564-587位氨基酸；或 ii)與SEQID NO:1的第564-587位氨基酸在其24個氨基酸序列全長上具有至少70%同一性的24個氨基酸的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述5’到3’外切核酸酶是RecE。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述RecE包含或由SEQI D NO:1的第564-866位氨基酸序列或其變體組成，所述變體包含長度為303個氨基酸的序列或由其組成，所述序列與SEQ ID NO:1在其303個氨基酸序列全長上具有至少70%的序列同一性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述RecE包含選自SEQID NO:1的第1-866、141-866或564-866位氨基酸的序列或其變體或由選自SEQ ID ΝΟ:1的第1-866、141-866或564-866位氨基酸的序列或其變體組成，其中所述變體與SEQ ID NO:1在其序列全長上具有至少70%的序列同一性。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述RecE與SEQI D NO:1中所提供的RecE具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述RecE是全長RecE。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一項所述的方法，其中所述退火蛋白是RecT。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子是線性核酸分子。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述同源重組在宿主細(xì)胞內(nèi)進行。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述5’到3’外切核酸酶是由異源DNA表達(dá)的。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述5’到3’外切核酸酶是RecE并且是由整合的原噬菌體的RecE基因表達(dá)的，其中RecE的表達(dá)是由異源啟動子驅(qū)動的。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其中所述5’到3’外切核酸酶的表達(dá)是由誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動的，所述誘導(dǎo)型啟動子如阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子或鼠李糖誘導(dǎo)型啟動子。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第二核酸分子是線性化的克隆載體，如線性化的BAC、線性化的基于pl5A起始區(qū)的載體、線性化的基于pBR322起始區(qū)的載體、線性化的粘粒、線性化的基于PUC起始區(qū)的載體或線性化的基于ColEl起始區(qū)的載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子是線性的，并且所述方法進一步包括在所述5’到3’外切核酸酶和所述退火蛋白的存在下將第三核酸分子與所述第一和第二核酸分子接觸，其中所述第一核酸分子與所述第二核酸分子共享一段同源區(qū)域并且與所述第三核酸分子共享一段不同的同源區(qū)域，其中所述第二核酸分子與所述第一核酸分子共享一段同源區(qū)域并且與所述第三核酸分子共享一段不同的同源區(qū)域，其中所述第三核酸分子與所述第二核酸分子共享一段同源區(qū)域并且與所述第一核酸分子共享一段不同的同源區(qū)域。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子是線性的，并且所述方法進一步包括在所述5’到3’外切核酸酶和所述噬菌體退火蛋白的存在下將第三核酸分子和第四核酸分子與所述第一和第二核酸分子接觸，其中所述第一核酸分子與所述第二核酸分子共享一段同源區(qū)域并且與所述第四核酸分子共享一段不同的同源區(qū)域，其中所述第二核酸分子與所述第一核酸分子共享一段同源區(qū)域并且與所述第三核酸分子共享一段不同的同源區(qū)域，其中所述第三核酸分子與所述第二核酸分子共享一段同源區(qū)域并且與所述第四核酸分子共享不同的同源區(qū)域，其中所述第四核酸分子與所述第三核酸分子共享一段同源區(qū)域并且與所述第一核酸分子共享一段不同的同源區(qū)域。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第一核酸分子包含感興趣的序列，所述第二和第四核酸分子是短的寡核苷酸，所述第三核酸分子是克隆載體。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一核酸分子包含長度為2kb或更長的感興趣的序列。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一核酸分子包含的感興趣的序列是基因族。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述基因簇編碼次級代謝產(chǎn)物途徑或脂肪酸合成途徑。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一核酸分子是基因組DNA的片段。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一核酸分子是線性化的BAC，所述方法用于將來自BAC的感興趣的序列亞克隆至克隆載體中。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述至少第一和第二核酸分子是線性的，并且所述方法進一步包括在Red α和Red β或截短的RecE和RecT的存在下，將所述至少第一和第二核酸分子之間的線性到線性同源重組反應(yīng)的產(chǎn)物用于在線性到環(huán)狀同源重組的第二步中。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述線性到線性同源重組在全長RecE和RecT的存在下在體外進行，其中所述方法進一步包括將所述線性到線性同源重組反應(yīng)的產(chǎn)物與宿主細(xì)胞中的另外的核酸分子接觸，并在Reda和Redii以及優(yōu)選還包括Red Y的存在下在體內(nèi)進行線性到環(huán)狀同源重組。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一核酸分子是線性的并且在鄰近它的5’端處包含硫代磷酸酯化以及在鄰近它的3’端處包含硫代磷酸酯化。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述第二核酸分子是線性的并且在鄰近它的3’端處包含硫代磷酸酯化但是在鄰近它的5’端處不包含硫代磷酸酯化。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，所述方法用于生成cDNA文庫。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-25中任一項所述的方法，其中所述第一和第二核酸分子是線性的，并且其中所述方法進一步包括在所述5’到3’外切核酸酶和退火蛋白的存在下將所述第一和第二核酸分子與一個或多個其它核酸分子接觸以產(chǎn)生線性產(chǎn)物。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述線性產(chǎn)物是基因、操縱子、染色體或整個基因組。
29.表達(dá)如權(quán)利要求1-6中任一項所述的5’到3’外切核酸酶的宿主細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的宿主細(xì)胞，其中還包括編碼Reda和RedP的基因，其中所述5’到3’外切核酸酶在與Reda和RedP不同的啟動子的控制下。
31.一種包含在整合的原噬菌體上的recE基因的宿主細(xì)胞，其中所述recE基因在異源啟動子的控制之下。
32.包含編碼權(quán)利要求1-6中任一項所述的5’到3’外切核酸酶的核酸的試劑盒，所述試劑盒用于同源重組方法。
33.包含權(quán)利要求1-6中任一項所述的5’到3’外切核酸酶的試劑盒，所述試劑盒用于 同源重組方法。
34.一種用于提高同源重組效率的方法，所述方法通過在至少一個與經(jīng)歷同源重組的核酸分子沒有序列同源性的單鏈寡核苷酸的存在下進行同源重組，其中所述同源重組的效率相對于當(dāng)所述至少一個單鏈寡核苷酸分子不存在時進行的同源重組提高。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述至少一個單鏈寡核苷酸包含或由DNA組成。
36.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的方法，其中所述至少一個單鏈寡核苷酸的長度為10-100個核苷酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述至少一個單鏈寡核苷酸的長度為約40個核苷酸。
38.根據(jù)權(quán)利要求34-37中任一項所述的方法，其中所述至少一個單鏈寡核苷酸在每次電穿孔中使用的濃度為l-200pmol。
39.根據(jù)權(quán)利要求34-38中任一項所述的方法，其中所述同源重組由RecE和RecT介導(dǎo)。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述RecE是截短型的RecE。
41.根據(jù)權(quán)利要求34-39中任一項所述的方法，其中所述同源重組方法是根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項所述的方法。
42.根據(jù)權(quán)利要求34-38中任一項所述的方法，其中所述同源重組由Reda和Red^介導(dǎo)。
43.包含權(quán)利要求34-37中任一項所述的至少一個單鏈寡核苷酸的試劑盒,所述試劑盒用于進行同源重組。
44.根據(jù)權(quán)利要求32、33或43中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括含有編碼RecE的核酸的宿主細(xì)胞。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中所述宿主細(xì)胞是如權(quán)利要求24-26中任一項所述的細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求43所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括表達(dá)Reda和Red3的宿主細(xì)胞。
47.根據(jù)權(quán)利要求44或45所述的試劑盒，其中所述宿主細(xì)胞還包括編碼Redy、RecA、Reda和Redii中一個或多個的核酸序列。
48.根據(jù)權(quán)利要求32、33和43-47中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包括一個或多個線性化的克隆載體。
49.一種用于在共享至少一段序列同源區(qū)域的至少第一核酸分子和第二核酸分子之間進行同源重組的方法，所述方法包括，在體內(nèi)進行同源重組之前，使用稀有切割序列特異性DNA切割酶在體內(nèi)線性化至少一個環(huán)狀核酸分子以生成所述第一和/或第二核酸分子的步驟。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述稀有切割序列特異性DNA切割酶選自歸巢內(nèi)切核酸酶、鋅指核酸酶(ZFN)或轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述歸巢核酸內(nèi)切酶選自1-Scel、1-CeuI,1-CreI,1-ChuI,1-Csm1、1-DmoI,1-PanI,1-SceII,1-SceIII,1-SceIV, F-Sce1、F-SceI1、P1-AaeI, P1-ApeI, PICeuI, P1-CirI, P1-CtrI, P1-DraI, P1-MavI, P1-MfII, P1-MgoI,P1-Mja1、P1-Mka1、P1-MIe1、P1-Mt ul、P1-MtuH1、P1-PabII1、P1-Pfu1、P1-Pho1、P1-Pko1、P1-Psp1、P1-RmaI, ΡΙ-Sce1、P1-Ssp1、P1-TfuI, P1-TfuI1、P1-Tlil、P1-Tlill. P1-Tsp1、P1-TspI1、P1-Bsp1、P1-MchI, P1-Mfa1、P1-Mga1、P1-MgaII, P1-Min1、P1-Mma1、P1-MshI,P1-MsmII, P1-MthI, P1-Tagl、ΡΙ-ThyI1、1-NcrI,1-NcrII,1-PanII,1-TevI,1-Ppol、1-DirI,1-HmuI,1-HmuII,1-TevI1、1-TevII1、F-SceI, F-SceII (HO)、F-SuvI, F-TevI 和F-TevII。
52.根據(jù)權(quán)利要求49-51中任一項所述的方法，其中所述同源重組由RecE和RecT介導(dǎo)。
53.根據(jù)權(quán)利要求49-52中任一項所述的方法，其中所述同源重組的方法是根據(jù)權(quán)利要求1-28或34-42中任一項所述的方法。
54.根據(jù)權(quán)利要求29-31中任一項所述的宿主細(xì)胞，還包括如權(quán)利要求50或51中所述的稀有切割序列特異性DNA切割酶。
55.一種用于進行同源重組方法的試劑盒，所述試劑盒包括至少一個如權(quán)利要求50或51中所述的稀有切割序列特異性DNA切割酶。
56.一種用于進行同源重組方法的試劑盒，所述試劑盒包括如權(quán)利要求54所述的宿主細(xì)胞。
全文摘要
一種用于在共享至少一段同源序列的第一核酸分子和第二核酸分子之間進行同源重組的方法。一種提高同源重組效率的方法。
文檔編號C12N9/22GK103068995SQ201180038908
公開日2013年4月24日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者Y.張, J.付, F·斯圖爾特 申請人:基因橋有限責(zé)任公司