專利名稱：人乳頭狀瘤病毒的快速基因型鑒定分析及其裝置的制作方法
人乳頭狀瘤病毒的快速基因型鑒定分析及其裝置
本申請要求2010年4月29日提交的美國專利申請序號12/770034的優(yōu)先權(quán)，該申請是部份接續(xù)2006年4月4日提交的美國專利申請序號11/398433，而后者是部分接續(xù) 2002年11月7日提交的美國專利申請序號10/291168，同時該申請聲明要求2001年11月 7日提交的美國專利申請序號60/345948的權(quán)益。美國專利申請序號11/398433也是部分延續(xù)2002年11月9號提交的美國專利申請序號10/293248。前述申請內(nèi)容特此全文并入本申請中作為參考。技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明是關(guān)于鑒定人乳頭狀瘤病毒的多種基因型。
背景技術(shù)：
鑒定人類白細(xì)胞抗原(HLA)
在器官或骨髓移植中，通過準(zhǔn)確的HLA分型使得供體和受體相匹配(4)，是預(yù)防急性移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)生的關(guān)鍵。HLA分型通常是通過標(biāo)準(zhǔn)血清學(xué)分型(2)來完成。最近的研究表明，DNA分型提供的結(jié)果更加準(zhǔn)確和肯定(7，9，8)。將HLA-DQ、HLA-DR和HLA-DP 分型檢測結(jié)果用于高精度匹配，這已是選擇潛在器官捐獻(xiàn)者的必備途徑(3)。先前已有報(bào)道，利用序列特異性引物的聚合酶鏈反應(yīng)(SSP-PCR)擴(kuò)增，可進(jìn)行HLA基因分型。然而，由于 HLA-DQ、DR和DP位點(diǎn)的高度多態(tài)性，所需序列特異性引物(SSP)的數(shù)目將會多達(dá)數(shù)百個， 超出了多重PCR擴(kuò)增極限，從而無法進(jìn)行有效的PCR擴(kuò)增。要確保HLA基因分型的結(jié)果在臨床上有實(shí)際應(yīng)用，必須設(shè)置多項(xiàng)檢測，每項(xiàng)各有50至100個獨(dú)立的PCR反應(yīng)。如今市場上提供一種試劑盒，其中包括一個擴(kuò)增過程，需要進(jìn)行96個獨(dú)立的PCR反應(yīng)，然后對凝膠電泳分離得到的片段大小進(jìn)行分析。這不僅耗費(fèi)時間和金錢，而且非常容易出現(xiàn)差錯，因?yàn)榉磻?yīng)設(shè)置復(fù)雜，另外判斷凝膠電泳中片段大小也存在不確定性。因此，DNA測序仍然被認(rèn)為是 HLA基因準(zhǔn)確分型的首選方法。遺憾的是，由于在序列上高度同源，假基因也可以在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中被共同擴(kuò)增，使得單獨(dú)通過DNA測序進(jìn)行高分辨HLA基因分型將會更加困難并且昂貴。授予JWO Tam先生的美國專利第5471547和6020187號，公開了一種可以在費(fèi)用低廉的設(shè)備上進(jìn)行的快速退火過程，用于準(zhǔn)確的突變型檢測、基因分型和指紋圖譜分析。 本發(fā)明公開了一種使用改進(jìn)的導(dǎo)流方式，利用ASO寡核苷酸探針對HLA基因座DP、DR和DQ beta序列進(jìn)行快速分析的方法。DNA指紋圖譜快速鑒定人類和生物體
1985年，基于限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)的DNA指紋圖譜首次應(yīng)用于人類身份鑒定(12)，并隨后開始應(yīng)用于其他生物體的鑒定。在實(shí)際應(yīng)用中，DNA指紋技術(shù)作為最好的法醫(yī)學(xué)工具已經(jīng)被廣泛接受，可用于在刑事案件中確定犯罪嫌疑人、親子糾紛、建立或證實(shí)一個人的身份。耗時的RFLP方法已逐漸被高通量的自動化過程取代。目前，利用PCR 擴(kuò)增，分析人類基因組10、16、18或更多位點(diǎn)上的短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的數(shù)目(1991年發(fā)現(xiàn)(11))，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平的鑒定。但是，不論STR還是可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列3(VNTR)，都相對昂貴，因?yàn)檫@些方法需要使用復(fù)雜的設(shè)備，以及人工密集并且過程耗時的方法，比如Southern印跡雜交。自發(fā)突變(10)也可能會降低準(zhǔn)確性和最終鑒定結(jié)果的確定性。此外，STR數(shù)據(jù)表明，突變的頻率，特別是在癌癥患者中，并不鮮見。因此，需要找到新的替代方法。單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因型鑒定是在法醫(yī)或個人身份識別中一種分辨率更高的方法，這種方法基于在不連鎖位點(diǎn)上選擇一定數(shù)量的SNP位點(diǎn)，其中每個位點(diǎn)的突變頻率均低于VNTR或STR系統(tǒng)。本發(fā)明展示了一種利用SNP基因型鑒定的方法，快速、明確鑒定個體生物特征，包括人、動物、植物或其他生物。HPV基因型鑒定
人乳頭狀瘤病毒(HPV)攻擊粘膜細(xì)胞，具有高度多樣性，世界范圍內(nèi)已報(bào)道的有大約200種不同的基因型，在不同種群中患病率各不相同。根據(jù)導(dǎo)致疾病的嚴(yán)重程度，人乳頭狀瘤病毒分為高風(fēng)險株(HR)和低風(fēng)險株(LR)。HR類型較常出現(xiàn)在宮頸的癌前病變或惡性病變，而LR類型多為良性病例(4)。每年有大約50萬宮頸癌新發(fā)病例，死亡病例預(yù)計(jì)超過 25萬。因此，HPV感染與宮頸癌仍然是威脅全球女性的主要癌癥(5)?；谶@個原因，HPV 篩查建議用于預(yù)防宮頸癌，因?yàn)樗燃?xì)胞學(xué)方法更敏感(6，7)。
臨床研究顯示，99. 7%的子宮頸癌與HR-HPV感染有關(guān)。盡管在大多數(shù)感染病例中，HPV可能會被清除，但是持續(xù)的HR-HPV感染，會導(dǎo)致重度宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(如 CIN IXIN II或CIN III)，并發(fā)展成為子宮頸癌(7，8)。因此，針對HPV病毒DNA的分析方法，已被開發(fā)并推向市場。美國食品藥品監(jiān)督局已經(jīng)批準(zhǔn)了 Hybrid capture 2 (HC2)系統(tǒng) (Digene公司，美國馬里蘭州Gaithersburg)和AMPLICOR HPV測試(羅氏分子診斷，美國新澤西州Branchburg)。這些篩查測試確定的是常見的HPV (HR株或LR株)是否存在，而無法區(qū)分其基因型。雖然這些測試提供了良好的HPV篩查檢測，但是無法進(jìn)行HPV的基因型鑒定限制了它們在臨床診斷和預(yù)后中的應(yīng)用，因?yàn)椴煌局暌鸺膊〉膰?yán)重程度有很大的不同，其中16型導(dǎo)致病癥最為嚴(yán)重，緊隨其后的是18型、33型、45型和59型等(8)。此外持續(xù)感染相同基因型的HPV，將進(jìn)一步增加子宮頸癌的風(fēng)險(9)。因此，有效和費(fèi)用可接受的HPV基因型鑒定檢測方法是最需要的。
LINEAR ARRAY HPV基因型檢測(羅氏分子診斷，美國新澤西州Branchburg，涵蓋37 種基因型)和INNO-LIPA HPV基因型鑒定(Innogenetics公司，比利時，涵蓋28種基因型)， 可以作為HC2或AMPLICOR HPV測試的補(bǔ)充，用于區(qū)分特定HPV基因型，并確定涉及多個HPV 基因型的感染?；谙铝惺聦?shí)1)不同HR-HPV毒株的致癌性不同；2)相同基因型的持續(xù)性感染導(dǎo)致風(fēng)險升高；3)已有的HPV疫苗不能防止所有類型的HPV感染，除了確定HPV病毒存在與否的常規(guī)篩查，HPV基因型鑒定仍然是需要的。然而，上述測試非常昂貴，并且仍然使用傳統(tǒng)的雜交過程，需要較高的運(yùn)行成本和人工操作時間。最重要的是，這些基因型鑒定試劑盒不能檢測超出預(yù)先設(shè)定的基因型譜，因此在HPV篩查中產(chǎn)生較高的假陽性率。因此， HPV基因型檢測方法需要實(shí)現(xiàn)更快捷、更便宜、覆蓋更多的基因型，并因此更高效，作為目前 HPV檢測的可負(fù)擔(dān)的替代方法。發(fā)明概要HLA基因型鑒定
初步結(jié)果表明，在檢測特定目標(biāo)HLA的DNA序列時，等位基因特異性寡核苷酸反相斑點(diǎn)印跡(ASO-RDB)導(dǎo)流雜交是一種更好的選擇。由其獲得的數(shù)據(jù)代表HLA-DP、DR和DQ beta位點(diǎn)上的特征片段，因而能夠準(zhǔn)確地鑒定基因型。使用一對PCR引物和35個ASO寡核苷酸探針，可以將世界衛(wèi)生組織(WHO)確定的83個DPBl等位基因進(jìn)行有效的分類。同樣，使用一對相同的PCR引物和18個ASO寡核苷酸探針，這個簡單的雜交方法可以識別DR 和DQ beta位點(diǎn)特定基因型的頭兩位編碼，足以區(qū)分這些主要人類白細(xì)胞抗原。ASO數(shù)據(jù)通過直接測序法進(jìn)行驗(yàn)證。但是，當(dāng)相同的PCR引物對用于DR和DQ位點(diǎn)的直接測序時，經(jīng)常會產(chǎn)生一些無法解釋的數(shù)據(jù)，這是因?yàn)橄嗤囊飳σ部梢酝瑫r擴(kuò)增HLA基因簇內(nèi)高度同源的內(nèi)源性假基因片段。出于這個原因，DNA測序(許多人認(rèn)為的金標(biāo)準(zhǔn))可能無法保證 HLA分類結(jié)果。在這樣的情況下，為確認(rèn)ASO數(shù)據(jù)，許多套相應(yīng)于每一個待測HLA類型的PCR 引物被創(chuàng)建，并用在獨(dú)立的PCR反應(yīng)中，以得到擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。這是直接測序法費(fèi)用高和耗時的一個主要的原因。相比之下，本發(fā)明提供了一種低成本的HLA識別程序，通過使用通用的引物對，執(zhí)行一個簡單的多重PCR，然后將所需數(shù)量的ASO探針，在低密度點(diǎn)陣列平臺進(jìn)行雜交。擴(kuò)增所得到的HLA片段(包括假基因)，可以在一張包被有ASO探針的膜上進(jìn)行明確的HLA分類。因此，這是一個比當(dāng)前其他DNA或血清學(xué)方法優(yōu)越得多的方法。盡管進(jìn)行進(jìn)一步具體的DR、DQ亞型分類，這種直接的導(dǎo)流方法需要額外的寡核苷酸探針，但是其數(shù)量已經(jīng)完全在此平臺檢測能力范圍內(nèi)。本發(fā)明提供了一種更快和更簡單的HLA分型技術(shù)，不需要昂貴的設(shè)備，因此制造和使用成本都低于直接DNA測序方法和多重PCR凝膠電泳過程。
此處公布的HLA基因型鑒定引物和寡核苷酸探針已經(jīng)通過測試，并證實(shí)能用于上述相應(yīng)的HLA-DR、DB和DP基因分類。依圖I或圖IA中設(shè)計(jì)所示，可以獲得、測試、驗(yàn)證更多的引物或寡核苷酸探針，從而進(jìn)行更全面的基因型鑒定。雖然在數(shù)據(jù)驗(yàn)證的例子中，PCR反應(yīng)被用于擴(kuò)增，但其它方法也可以使用，只要能夠獲得足夠數(shù)量的特定靶序列用于ASO-RDB 導(dǎo)流雜交分析。對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，在閱讀本文的教學(xué)后，其他適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法或技術(shù)是顯而易見的。只要能夠獲得足夠數(shù)量的特定靶序列用于ASO-RDB導(dǎo)流雜交分析， 擴(kuò)增并非是必需的。檢測可以通過對靶DNA或結(jié)合物進(jìn)行標(biāo)記來完成。
盡管在本申請中例示了 HLA基因型鑒定，遵照本應(yīng)用的示教，基于SNP的基因型鑒定技術(shù)也可以應(yīng)用到其他遺傳材料或從任何有機(jī)體得到的序列，如圖I或圖IA中所示程序。類似美國專利第5741547或6020187號中描述的裝置，或任何新的實(shí)施例，能夠進(jìn)行導(dǎo)流雜交的都可以使用。SNP基因型鑒定
人類基因組與許多其他生物的基因組已經(jīng)被測序和繪制圖譜。任何物種內(nèi)部，一般的DNA序列信息是非常相似的。然而，每一個物種都有它自己獨(dú)特的一套遺傳信息。因此，許多科學(xué)家們試圖在種群中找到與疾病有聯(lián)系的特征。例如，人類學(xué)家采用遺傳變異來重建人類的歷史，試圖了解文化和地理對人類特征群體在全球分布的作用。單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)可以實(shí)現(xiàn)這些目的(UXBrightwell等報(bào)道了一個SNP基因型鑒定的應(yīng)用，使用簡單快速的，在單管中進(jìn)行的，改進(jìn)了的擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)，分析一個具有FRAXA 重復(fù)擴(kuò)張的男性群體中的6個SNP位點(diǎn)(15)。
本發(fā)明描述了等位基因特異性寡核苷酸(ASO)陣列的應(yīng)用。在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員按照本應(yīng)用的示教，可以輕易得到足夠鑒定要求所需要的SNP數(shù)目?；谀さ奈㈥嚵蠥SO-RDB導(dǎo)流雜交平臺(例如，見美國專利編號5741647)，可以用于進(jìn)行SNP基因型鑒定。本發(fā)明的微陣列雜交平臺上所產(chǎn)生的可見斑點(diǎn)，既可以通過目視檢出，也可以通過使用成本低廉的圖像分析儀分析。與此相反，目前市場上提供的雜交平臺需要由高分辨率圖像分析儀進(jìn)行分析。原則上，基因組中的任何位置的單核苷酸多態(tài)性，只要數(shù)量足夠，都可用于識別目的。然而，這可能會影響親子鑒定和親緣關(guān)系分析的準(zhǔn)確性，因?yàn)樵诨蚪M不同部分的基因突變率有差異。因此，高度多態(tài)性位點(diǎn)或基因組中突變率相對較低的位點(diǎn)(包括但不限于編碼區(qū)或任何滿足條件的突變率相對低的區(qū)域)都可以選作以驗(yàn)證親緣關(guān)系。從9個高度多態(tài)的染色體位點(diǎn)進(jìn)行的單核苷酸多態(tài)性分析的初步數(shù)據(jù)顯示，這些單核苷酸多態(tài)性已經(jīng)足夠用作SNP基因型鑒定。所需位點(diǎn)的數(shù)目將取決于鑒別要求的準(zhǔn)確率，這對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在閱讀本文的示教后是顯而易見的。在構(gòu)建每個位點(diǎn)的多態(tài)頻率數(shù)據(jù)庫時，對從50-150個無關(guān)個體取得的DNA樣本進(jìn)行測序。20個家庭親緣關(guān)系的分析與STR Profile Plus人類身份試劑盒測試平行進(jìn)行，結(jié)果100%吻合。SNP為基礎(chǔ)的導(dǎo)流平臺已被證明是人類身份識別的一個更好的選擇。除了已經(jīng)積累和分析的數(shù)據(jù)，在本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員閱讀本文的示教后，可以容易地實(shí)現(xiàn)多態(tài)頻率數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)展。SNP基因型鑒定作為診斷工具
除了建立DNA指紋圖譜，SNP基因型鑒定還可用于鑒定基因片段，或引起基因功能改變或減弱的基因多態(tài)性。出于這個原因，本發(fā)明可以用于快速、明確的鑒別傳染性病原體、特定DNA序列造成的遺傳性疾病，或者存在或缺失這類傳染因子或DNA序列而引起的遺傳性疾病。HPV基因型鑒定
本發(fā)明提供了一種基于PCR試驗(yàn)的HPV基因型鑒定方法，包括通過基于膜的導(dǎo)流雜交技術(shù)(美國專利編號5741647)，共擴(kuò)增一種人的基因作為內(nèi)部對照，來測量樣品中是否有靶HPV整合。這種方法確定了 33個高風(fēng)險(HR)和低風(fēng)險(LR)HPV病毒的基因型(6，11， 16，18，26，31，33，35，39，40，42，43，44，45，51，52，53，54，55，56，57，58，59，61，66，68，70， 71，72，73，81，82，84)。此外，新型通用探針也被設(shè)計(jì)用來捕捉具有HPV共有序列的HPV基因型。因此，在除了測試樣板中包括的33種基因型，在臨床篩查中通用探針還捕獲至少5 種其他HPV病毒亞型，敏感度和特異性令人滿意，成本大幅度減少(10)，從而為HPV基因型鑒定提供了一個更好的選擇。
雖然在數(shù)據(jù)驗(yàn)證的例子中，PCR反應(yīng)被用于擴(kuò)增，但其它方法也可以使用，只要能夠獲得足夠數(shù)量的特定靶序列用于ASO-RDB導(dǎo)流雜交分析。對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，在閱讀本文的教學(xué)后，其他適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法或技術(shù)是顯而易見的。只要能夠獲得足夠數(shù)量的特定靶序列用于ASO-RDB導(dǎo)流雜交分析，擴(kuò)增并非是必需的。檢測可以通過對靶DNA 或結(jié)合物進(jìn)行標(biāo)記來完成。
類似美國專利第5741547或6020187號中描述的導(dǎo)流裝置，或任何新的實(shí)施例，能夠?qū)嵤?dǎo)流雜交過程的裝置都可以使用。


圖I示本發(fā)明用于構(gòu)建ASO探針和PCR引物庫的方法。
圖IA示本發(fā)明構(gòu)建HLA基因型鑒定的寡核苷酸探針庫的方法。
圖2示利用本發(fā)明的方法所獲得的HLA-DQB基因型AS0檢測結(jié)果。圖3示利用本發(fā)明的方法所獲得的HLA-DPB1基因型AS0檢測結(jié)果。圖4示某樣本的HLA-DRB和DQB基因型鑒定結(jié)果。圖5示某樣本的HLA-DPB基因型鑒定結(jié)果。圖6示本發(fā)明中用于高通量分析的膜。圖7示本發(fā)明中雜交裝置的分解視圖，以及連接到中央控制單元的多個側(cè)向?qū)Я?檢測裝置。在一個實(shí)施例中，雜交裝置包括一個中央控制單元，和連接到中央控制單元的一 個或多個側(cè)向液流裝置。中央控制單元提供電源并控制側(cè)向液流裝置，雜交和顯影都在液 流裝置中進(jìn)行。多個反應(yīng)(或多個樣品或分析物)可以同時在一個單一的側(cè)向液流裝置進(jìn)行 測試，也可以同時在幾個裝置(每個單獨(dú)控制在不同的條件下)進(jìn)行。側(cè)向液流裝置可以是 nXm的點(diǎn)陣(排列)格式或線性點(diǎn)陣形式(如圖所示)。由于在反應(yīng)過程中，測試溶液從點(diǎn)陣 的一端流至另一端(即從東到西或者由北向南的方向)，檢測的靈敏度顯著增加。靈敏度的 增加程度取決于膜的面積和含有捕獲探針的斑點(diǎn)或線的區(qū)域面積的比率。例如，假設(shè)的總 面積是100平方毫米，斑點(diǎn)大小為1平方毫米。在直接導(dǎo)流過程中(即與常規(guī)流動過程一樣， 溶液從膜的頂部流動到膜的底部)，所使用的試驗(yàn)溶液僅有1/100會流經(jīng)該點(diǎn)，而只有在該 點(diǎn)目標(biāo)分子才能與固定于膜上的探針結(jié)合。然而，如果使用側(cè)向?qū)Я鬟^程，靈敏度僅依賴于 點(diǎn)的寬度和膜的寬度的比率(如膜的橫截面)。例如，在一個側(cè)向?qū)Я鬟^程中，10毫米X 10 毫米的膜上，從1毫米寬的點(diǎn)上流過的液體體積將是總量的約1/10，這意味著使用相同量 的目標(biāo)分析物(含有目標(biāo)分子的試驗(yàn)溶液)，靈敏度有10倍的增加。當(dāng)線性點(diǎn)陣被使用在側(cè) 向?qū)Я鬟^程中，靈敏度將進(jìn)一步提高，因?yàn)樗械哪繕?biāo)分子都將通過沿條帶(或膜)分布的 線。側(cè)向?qū)Я鬟^程允許定量測量，因?yàn)樵陔s交過程中待分析物的流動更加均勻。圖8示本發(fā)明用于構(gòu)造SNP數(shù)據(jù)庫的方法。圖9示使用SNP基因型鑒定人或生物體樣本的數(shù)據(jù)。圖10示圖8方法中使用的基因位點(diǎn)。圖11示一個中國人群樣本中HLA-DPB1基因型鑒定結(jié)果(表1)。圖12示一個中國人群樣本中HLA-DPB1等位基因和基因型頻率(表2)。圖13示鑒定HLA各基因型的AS0寡核苷酸探針序列，和擴(kuò)增相應(yīng)片段進(jìn)行分析的 PCR引物對序列。圖14示鑒定HPV各基因型的寡核苷酸探針序列，和擴(kuò)增相應(yīng)L1片段進(jìn)行分析的 PCR引物對序列?！? A”表示腺嘌呤鎖核酸，“+T”表示胸腺嘧啶鎖核酸。圖15示HPV感染中HPV-33基因型鑒定陣列的典型影像。圖16示HPV感染中HR-HPV-14基因型鑒定陣列的典型影像。圖17示改進(jìn)的HPV檢測試劑盒簡化篩查形式，以降低成本和提高通量。圖18示其他改進(jìn)的HPV檢測試劑盒簡化篩查形式，以降低成本和提高通量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明使用下列術(shù)語描述。如果未在此處闡述具體定義，描述本發(fā)明所使用的術(shù) 語均為本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解的通用意思。本處所用“等位基因特異性寡核苷酸反相斑點(diǎn)印跡(AS0-RDB)”是指將等位基因特異的寡核苷酸探針固定在固體基質(zhì)表面，在雜交過程中捕獲待檢測的目標(biāo)分子。
本處所用“導(dǎo)流雜交”是指利用美國專利編號5741647中所描述技術(shù)進(jìn)行的雜交過程。
本處所用“導(dǎo)流雜交裝置”或“導(dǎo)流裝置”指的是在美國專利編號6020187中所描述的設(shè)備和/或圖5中所示的側(cè)向液流裝置，或隨后設(shè)計(jì)的任何導(dǎo)流裝置。HLA基因型鑒定
下列文字描述了本發(fā)明從基因組序列數(shù)據(jù)庫中獲得HLA分型的ASO探針和PCR引物，并用于HLA基因型鑒定分析的方法。選擇合適的基因片段并確定適當(dāng)?shù)腜CR引物和ASO位點(diǎn)
通過從GenBank中篩選，或?qū)Π谢蚧駾NA片段測序進(jìn)行人群篩選，得到適合HLA 基因型鑒定的SNP或ASO。
本發(fā)明中用于選擇適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)序列的方法詳述如下
(a)按各自的分類(I類、II類)和亞型(如DR、DQ和DP等)從GenBank中找出所有HLA DNA序列的數(shù)據(jù)。根據(jù)個自的分類和亞型對HLA DNA序列進(jìn)行比對，以確定最具多態(tài)性的區(qū)域，用于HLA基因型鑒定。
(b)在多態(tài)性區(qū)域內(nèi)，確定PCR引物對能夠匹配所感興趣的亞型中的保守序列，從而當(dāng)使用這些引物時，所有感興趣的亞型都可以擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，用于進(jìn)一步的導(dǎo)流雜交分析。
(c)為驗(yàn)證這些引物的適用性，大量隨機(jī)樣本被用于PCR擴(kuò)增，以獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上該待查區(qū)域陽性擴(kuò)增的滿意結(jié)果，并確保沒有由于假陰性擴(kuò)增結(jié)果排除任何等位基因。除了統(tǒng)計(jì)學(xué)確認(rèn)，驗(yàn)證時也包含內(nèi)部對照(1C)，以確保測試樣品中不存在任何PCR抑制劑，導(dǎo)致 PCR擴(kuò)增反應(yīng)失敗。內(nèi)部對照的設(shè)計(jì)(可以是I個或多個)將取決于測試需要。利用HLA和 SNP指紋圖譜以及基因型鑒定確定遺傳性疾病時，內(nèi)部對照的序列不能和待查的人基因組存在同源性，也就是說，使用一個和待查序列完全無關(guān)的序列。由于人體細(xì)胞大多是二倍體的基因組(胚系細(xì)胞除外)，濃度問題相對非常簡單，因?yàn)槔碚撋蠝y試位點(diǎn)的濃度或者是I (純合子)或者是O. 5 (雜合子)。因此，兩個序列不同而兩側(cè)具有相同PCR引物序列的片段即可作為內(nèi)部對照。這是指，使用不同于待分析靶片段的片段作為內(nèi)部對照時，可以選擇該片段內(nèi)部位點(diǎn)已知為純合或雜合的序列作為探針，即該片段中有兩個不同的探針(純和探針和雜合探針)，這樣使得這些內(nèi)部對照的濃度比可以計(jì)算出來。由于PCR擴(kuò)增不影響相對濃度，理論上信號的比值為2:1。比例上如果發(fā)生任何波動將被視作雜交效率的變化。以這兩個比例為2:1的內(nèi)部對照作為標(biāo)準(zhǔn)，分別指示待查位點(diǎn)為純合子和雜合子。如果所觀察到的結(jié)果表明只有一個等位基因，但待查濃度等于或小于O. 5倍純合子內(nèi)部對照，或與雜合子內(nèi)部對照比例接近1，此時應(yīng)調(diào)查雜合性丟失的可能性可能是兩個染色體其中之一丟失或不能擴(kuò)增。純合子由于兩個染色體是相同的，其印記點(diǎn)的預(yù)期結(jié)果應(yīng)該是濃度接近純合子內(nèi)部對照，而不是雜合子內(nèi)部對照。因此，內(nèi)部對照對于獲得精確的結(jié)果非常重要， 因?yàn)榕R床上可靠的結(jié)果對任何診斷測試都至關(guān)重要。
關(guān)于DNA數(shù)據(jù)庫和序列比對的進(jìn)一步信息可以在本申請的參考資料部分找到(見參考文獻(xiàn)5和6)。
這里所描述HLA基因型鑒定的程序，均可由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在學(xué)習(xí)閱讀本申請材料后，用于其他基因或感興趣的DNA序列的基因型鑒定，或用于結(jié)合導(dǎo)流雜交過程來確定DNA指紋/識別的SNP檢測。
為最大限度地提高PCR擴(kuò)增的效率，通常選擇的ASO探針的片段長度保持盡可能短，最好不超過幾百個堿基對。
在開發(fā)基因型鑒定測試的過程中，如果找不到合適的引物對，可對PCR反應(yīng)組分以及PCR擴(kuò)增過程，即PCR程序進(jìn)行調(diào)整，通過擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化來確保產(chǎn)物得到擴(kuò)增。 這樣的改進(jìn)對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在學(xué)習(xí)閱讀本申請材料后是顯而易見的。在某些情況下，如果無法使用序列完全保守的PCR引物，可以使用具有相同識別位點(diǎn)的簡并引物或多個引物。在這樣的情況下，應(yīng)該對PCR條件作出適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以確保不會錯過任何位點(diǎn)。
如果不能找到成功區(qū)分亞型的獨(dú)特區(qū)域時，可以使用多重PCR。設(shè)計(jì)引物時，引物的Tm值要保證擴(kuò)增過程中的退火溫度在可操作范圍內(nèi)。此處所述“Tm值”是指，例如，雙鏈和單鏈的DNA分子濃度相等時的反應(yīng)溫度。因此，在較高的溫度下更多的雙鏈DNA解離成為單鏈，與此相反，在較低溫度下，更多的單鏈分子將退火形成雙鏈。對于一個序列數(shù)據(jù)未知的人群，通常通過直接DNA測序進(jìn)行人群篩查。例如，對一個中國人群樣本的篩查進(jìn)行如下(a)從超過一百個受試者隨機(jī)取樣，使用2對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后使用ASO探針進(jìn)行雜交，探針設(shè)計(jì)在下面章節(jié)描述；(b) DNA測序驗(yàn)證結(jié)果。
使用上述得到的數(shù)據(jù)，確定和選擇被用于基因型鑒定的ASO位點(diǎn)。從GenBank或隨機(jī)樣本測序得到的數(shù)據(jù)中，判斷用于抽樣人群的HLA分型的位點(diǎn)選擇是否的確為獨(dú)特的。 ASO探針的設(shè)計(jì)和獨(dú)特性驗(yàn)證方法如下
(a)從亞型的序列比對中選擇滿意的多態(tài)性區(qū)域，進(jìn)一步搜索得到具有獨(dú)特性的 20-30的核苷酸序列或片段。這樣的獨(dú)特性序列或片段將被用作等位基因特異性寡核苷酸 (ASO)探針，通過雜交過程捕獲已擴(kuò)增的靶片段，從而檢測到各獨(dú)特的HLA亞型的存在。此處“獨(dú)特的序列或片段”是指，例如，在這些亞型序列中，與該序列或片段完全同源的亞型序列只有一個。
(b)為了驗(yàn)證ASO探針是獨(dú)特的，將序列與GenBank中或歐洲的類似數(shù)據(jù)庫中所有人類的DNA序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，以確定ASO探針是否的確是只100%匹配感興趣的HLA亞型。這將確保至少在現(xiàn)有的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上——直到新的序列發(fā)現(xiàn)前——ASO探針是該區(qū)域內(nèi)特有的。
(c)由于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度要短，以提高擴(kuò)增效率，單一 ASO探針可能不足以提供明確的結(jié)論以區(qū)分各獨(dú)特亞型。因此，在同一 PCR片段和/或使用多重PCR生成的不同片段中，有必要運(yùn)用多個ASO探針給出一個明確的基因型分類。在這種情況下，每一個給定的HLA亞型，將會產(chǎn)生一個獨(dú)特的雜交譜圖。經(jīng)過深入的數(shù)據(jù)分析之后,ASO序列使用隨機(jī)的人類DNA樣本進(jìn)行驗(yàn)證。
最終決定了使用的ASO捕獲探針數(shù)量后，各基因型的點(diǎn)陣圖譜將被確定。圖2和圖3顯示的是特異性點(diǎn)陣圖譜的例子。圖2和圖3所示的點(diǎn)陣圖譜是用于測定HLA DRB、 DQB和DPB亞型，分別使用了 18個ASO探針和35個ASO探針。
類似的步驟可以用于其他的基因和來自其它有機(jī)體的遺傳物質(zhì)。針對不同基因和不同應(yīng)用，引物序列和ASO探針數(shù)目會有所變化。例如，人類身份識別可能需要50個或更多的ASO點(diǎn)陣以獲得明確的識別(參見圖3和圖4)。檢測形式可以包括一列點(diǎn)或線，取決于導(dǎo)流雜交裝置的構(gòu)造。講行ASO-RDB檢測
ASO寡核苷酸被固定在膜或任何合適的基質(zhì)上，用于捕獲目標(biāo)位點(diǎn)。此處“膜” 是指，例如，任何合適的基質(zhì)材料，能夠固定ASO寡核苷酸探針，并且多孔以利于含有靶核酸分子的溶液自由通過。在一個實(shí)施例中，膜或基質(zhì)可以是尼龍、硝酸纖維素、Biodyne、 Porex、多孔金屬或耐用凝膠基質(zhì)。
靶序列(或位點(diǎn))的固定可以通過共價鍵、非共價鍵(即靜電吸引、疏水作用或其他的相互作用包括紫外線交聯(lián))，或通過介導(dǎo)物，如受體或抗體)的相互作用來實(shí)現(xiàn)。圖2和3 中顯示的是Biodyne C膜，利用EDC在膜的羧基端和修飾后ASO探針的氨基端之間形成共價鍵。親和素-生物素連接或ASO的多聚T尾部紫外交聯(lián)也同樣有效。
使用適當(dāng)?shù)囊飳δ繕?biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增，以生成足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物來滿足分析需要。目標(biāo)分子可以根據(jù)最終的信號檢測方法，進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉?biāo)記以產(chǎn)生足夠的信號。標(biāo)記過程可以通過引物進(jìn)行，在一個或兩個引物5’末端共價結(jié)合上標(biāo)記分子，或者在PCR擴(kuò)增過程中，用標(biāo)記的核苷酸代替四種dNTP核苷酸中的其中一種，使新延伸得到的擴(kuò)增產(chǎn)物被標(biāo)記。標(biāo)記物可以是任何信號可以被檢測到并顯色的分子。生物素聯(lián)合親和素標(biāo)記的酶可用于顏色檢測。其它合適的標(biāo)記系統(tǒng)包括(但不僅限于)膠體金和熒光標(biāo)記、磁珠結(jié)合物、量子點(diǎn)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記分子，或其它已經(jīng)開發(fā)的或待開發(fā)的適合的系統(tǒng)也可以被應(yīng)用。
ASO分析使用美國專利編號5741647描述的導(dǎo)流雜交方法進(jìn)行。雜交在雜交室中進(jìn)行，ASO捕獲探針交聯(lián)在膜上。ASO分析方法如下所述
(a)將含有靶DNA或序列的溶液變性并與膜接觸；
(b)用洗滌溶液(或者SSC，或封閉溶液)洗滌膜，最好三次；
(c)顯色，并目視檢測或光譜測量。對于定量測量，可以使用掃描儀和圖像處理軟件來分析。另外，目標(biāo)DNA或序列可以用熒光染料標(biāo)記，并在洗滌步驟之后立即使用光譜成像儀分析。
結(jié)果與已知序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以確?；蛐蜋z測的準(zhǔn)確性。
探針和測試條件進(jìn)一步優(yōu)化，以提高基因型鑒定的準(zhǔn)確性，并通過DNA測序驗(yàn)證 RDB-ASO 數(shù)據(jù)。驗(yàn)證
使用隨機(jī)樣本進(jìn)行驗(yàn)證。本發(fā)明的一個驗(yàn)證步驟描述如下
如上文所述，一旦引物對和ASO的捕獲探針被固定在膜上，足夠數(shù)量的隨機(jī)DNA樣品被用來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。靶序列或擴(kuò)增并標(biāo)記的DNA產(chǎn)物/分子被雜交以生成一個ASO點(diǎn)陣圖譜。
HLA亞型和相應(yīng)的DNA序列由ASO探針確定。相應(yīng)的PCR樣品被制備用于DNA直接測序。HLA基因型檢測的驗(yàn)證，需要DNA測序的結(jié)果和導(dǎo)流陣列的結(jié)果相符。用于基因型檢測驗(yàn)證的樣品可以從任何隨機(jī)選擇的個體獲得。一旦獲得樣品，真正的基因型鑒定可以如第3. 5節(jié)中所述，經(jīng)DNA測序進(jìn)行。如果測序數(shù)據(jù)與從導(dǎo)流陣列得到的數(shù)據(jù)一致，數(shù)據(jù)的有效性即被確認(rèn)?；蛐蜋z測的進(jìn)一步驗(yàn)證可以通過現(xiàn)場測試進(jìn)行，如隨機(jī)抽樣測試，數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，如靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值或陰性預(yù)測值，以上均由獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，以評估基因型檢測的準(zhǔn)確性。SNP基因型鑒定
下面是本發(fā)明用于構(gòu)建SNP數(shù)據(jù)庫和開發(fā)SNP基因型檢測的方法。選擇SNP位點(diǎn)并確定排除概率
此處“排除概率”是指，比如區(qū)分人或有機(jī)體方法的準(zhǔn)確性。例如，排除概率為100 億或1000億分之一是指當(dāng)使用選定數(shù)目的SNP位點(diǎn)，分別需要篩查100億或1000億個體才可以找到兩個完全相同的個體。
選擇SNP位點(diǎn)并確定排除概率。此處“排除概率”是指，比如區(qū)分人或有機(jī)體方法的準(zhǔn)確性。例如，排除概率為100億或1000億分之一是指當(dāng)使用選定數(shù)目的SNP位點(diǎn)，分別需要篩查100億或1000億個體才可以找到兩個完全相同的個體。
選擇適當(dāng)?shù)腟NP寡核苷酸探針，以捕獲特定的待分析靶序列，既可以通過從 GenBank中篩選數(shù)據(jù)得到，也可以進(jìn)行群體篩查，比如靶基因或靶DNA片段的DNA直接測序，從而獲得SNP /[目息和在群體中的頻率。
從這些數(shù)據(jù)中，按照多態(tài)性頻率，確定要用于指紋檢測的SNP位點(diǎn)，并確定所選位點(diǎn)在這個群體中是否為突變熱點(diǎn)，這可以通過群體中隨機(jī)樣本的測序來確定。確定所需要的SNP探針的數(shù)量，并計(jì)算總的雜合率以確定分析所用SNP位點(diǎn)的排除概率(即圖9所示 SNP點(diǎn)陣列)。
排除概率取決于在該位點(diǎn)上的SNP數(shù)量。例如,在一個指定的位點(diǎn),如果有2個不同的堿基，例如G和A，發(fā)現(xiàn)在某個取樣群體中各占50%。這樣的概率是1/2。如果可以找到50個這樣的位點(diǎn)(這些位點(diǎn)是隨機(jī)分布的，在染色體上不相互連鎖)，那么區(qū)分概率將是 1/2的50次方。講行SNP圖譜檢測(SNP點(diǎn)陣組合顯示個體各位點(diǎn)相應(yīng)的基因型組成)
設(shè)計(jì)合適的引物進(jìn)行擴(kuò)增，如上所述，篩查并確定位點(diǎn)后，再選擇適當(dāng)?shù)腟NP探針進(jìn)行雜交檢測。
擴(kuò)增靶序列，通過導(dǎo)流雜交過程分析SNP圖譜，方法如美國專利編號5741647所描述。
將上述獲得的數(shù)據(jù)與已知序列數(shù)據(jù)比較，來評估SNP基因型鑒定分析的準(zhǔn)確性。
優(yōu)化SNP探針和測試條件，以提高SNP基因型鑒定分析的精確性。RDB SNP數(shù)據(jù)通過DNA測序進(jìn)行驗(yàn)證。
用隨機(jī)樣本進(jìn)行方法驗(yàn)證。HPV基因型鑒定
在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種快速鑒定人乳頭狀瘤病毒(HPV)基因型的方法。此處公開的發(fā)明也可以應(yīng)用于篩查和檢測其他的病毒、細(xì)菌、寄生蟲或其它病原體。例如，本發(fā)明可用于結(jié)核病、乙型肝炎、丙型肝炎、傳染性非典型肺炎和呼吸道感染病毒(單獨(dú)的或組合的)的基因型鑒定。
在一個實(shí)施例中，快速檢測人乳頭狀瘤病毒(HPV)的方法包括以下步驟(a)獲得含有核酸模板的樣品；(b)用序列號116-118的引物擴(kuò)增模板核酸，得到HPV LI的擴(kuò)增產(chǎn)物；(C)HPV LI擴(kuò)增產(chǎn)物與固定的寡核苷酸探針雜交，探針選自序列號121-173組成的探針組，雜交結(jié)果將提示HPV病毒是否存在，其中包括高風(fēng)險(HR)HPV病毒和低風(fēng)險(LR)HPV 病毒。在一個實(shí)施例中，引物含有一個信號標(biāo)記。在另一個實(shí)施例中，引物中進(jìn)一步包括了與內(nèi)部對照互補(bǔ)的引物(例如，含有序列號為119-120的引物)。在又一個實(shí)施例中，寡核苷酸探針進(jìn)一步包括能夠捕獲通用HPV病毒DNA的探針(例如，探針具有序列號為170-173的序列)，其中所述的探針包括鎖核酸(LNA )。在本發(fā)明中，使用LNA -修飾的核苷酸能夠增加用于HPV檢測的寡核苷酸探針的熱穩(wěn)定性和靶特異性。
在一個實(shí)施例中，HPV LI的擴(kuò)增產(chǎn)物與多個固定的寡核苷酸探針雜交是在一個導(dǎo)流過程或側(cè)向?qū)Я鬟^程中進(jìn)行。在一個導(dǎo)流過程的實(shí)施例中，雜交的靈敏度取決于探針?biāo)嫉拿娣e與點(diǎn)陣所用膜的總面積的比率。在側(cè)向?qū)Я鬟^程的一個實(shí)施例中，雜交的靈敏度取決于流動方向上探針?biāo)嫉臋M截面積與膜的總橫截面積的比率。
在一個實(shí)施例中，上述方法可以檢測下列的一個或多個HPV基因型HPV6，11，16， 18，26，31，33，35，39，40，42，43，44，45，51，52，53，54，55，56，57，58，59，61，66，68，70，71， 72，73，81，82和84。HPV基因型可被單獨(dú)檢測，或者集合到一個或多個組中進(jìn)行檢測(例如，參見圖15-18)。在一個實(shí)施例中，HPV16和18可被分別檢測，而HPV31，33，35，39，45，51， 52，56，58，59，73，82可被集合到一個或多個組中進(jìn)行檢測(參見圖16 -18)，例如HPV31, 33，35，39可作為一組被檢測，HPV45，51，52，56作為第二組，HPV 58，59，73，82作為第三組。 在另一個實(shí)施例中，該方法可以進(jìn)一步在一個或多個組中檢測HPV 6，11，26，40，42，43，44， 53，54，55，57，61，66，70，71，72，73，81 和 84 (參見圖 18 中的示例)。
本發(fā)明還提供了進(jìn)行人乳頭狀瘤病毒(HPV)基因型鑒定的試劑盒，其中包括序列號為116-118的引物和選自序列121-173的寡核苷酸探針。在一個實(shí)施例中，引物進(jìn)一步包括信號標(biāo)記。在另一實(shí)施例中，引物中更進(jìn)一步包括了與內(nèi)部對照互補(bǔ)的引物(例如，含有序列號為119-120的引物)。在又一實(shí)施例中，寡核苷酸探針還進(jìn)一步包括能夠捕獲通用HPV病毒DNA的探針(例如，探針具有序列號為170-173的序列)。在一個實(shí)施例中，該試劑盒可以檢測一個或多個下列的HPV基因型HPV6,11，16，18，26，31，33，35，39，40，42，43， 44，45，51，52，53，54，55，56，57，58，59，61，66，68，70，71，72，73，81，82，和 84。HPV 基因型可被分別檢測，或者集合到一個或多個組中進(jìn)行檢測(參見圖15-18中示例)。
通過參考下面的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，本發(fā)明將會更容易被理解。本領(lǐng)域的專業(yè)人員將容易理解，具體的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)只是用作說明的，并不意味著本發(fā)明只是局限于如下所示，這在后面的聲明中會有準(zhǔn)確解釋。
本申請中引用了多種參考文獻(xiàn)或出版物。這些參考文獻(xiàn)或出版物的完整公開內(nèi)容作為參考并入本申請中，以更加充分地描述本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的狀態(tài)。需要注意的是，過渡詞“包含”與“包括”、“含有”或“特點(diǎn)在于”是同義詞，是包羅廣泛，沒有固定限度的，并不排除額外的，沒有被弓I用的原理或方法步驟。實(shí)施例I 測試程序 DNA提取
推薦如下的實(shí)驗(yàn)方案，但也可以采用對在本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的并同樣有效的替代方案。取有核細(xì)胞如白血細(xì)胞或組織，用PBS洗滌，離心，棄去上清。將細(xì)胞沉淀重新懸浮在200微升的PBS中。用QIAamp DNA mini試劑盒(QIAGEN)，按生產(chǎn)商推薦的“血液和體液離心實(shí)驗(yàn)方案”抽提DNA。其他市售用于分離DNA的試劑盒，也可以使用。但是，DNA的提取過程不能在最后提純的DNA中摻雜有DNA聚合酶抑制劑，這對于確保有效的擴(kuò)增至關(guān)重要。將DNA洗脫在50-200微升AE緩沖液中，并存儲于_20°C備用。PCR擴(kuò)增
由于PCR擴(kuò)增是極度敏感的過程，必須特別小心以防止交叉污染或假陽性結(jié)果。 因此，必須遵守以下準(zhǔn)則PCR過程中須一直戴手術(shù)手套，最好在“前PCR”區(qū)域或干凈的沒有擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR準(zhǔn)備臺，制備PCR反應(yīng)混合物；PCR反應(yīng)和雜交應(yīng)在不同的區(qū)域進(jìn)行，例如，雜交應(yīng)在“后PCR”區(qū)域進(jìn)行。
使用70%乙醇和紙巾清潔工作臺或工作區(qū)域。在開始PCR擴(kuò)增前，用70%乙醇和紙巾清潔所有的移液器。所有移液步驟均使用過濾/無菌槍頭，不重復(fù)使用槍頭。
PCR只是許多可用于擴(kuò)增的技術(shù)之一。其他對在本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員顯而易見的擴(kuò)增技術(shù)也可以使用，如多種等溫?cái)U(kuò)增的方法，使用適當(dāng)?shù)囊飻U(kuò)增靶序列，以獲得足夠量的靶序列(或DNA分子)，用于導(dǎo)流點(diǎn)陣檢測。
PCR反應(yīng)使用市場上可買到的聚合酶，例如AmpliTaq Gold聚合酶(Applied Biosystem)。五對引物(I對用于擴(kuò)增DR基因，即正向引物 DRB-Fl :5’-ATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3’ [序列號 97]和反向引物 DRB-Rl : 5’ -GCCGCTGCACTGTGAAGCTCTC-3’ [序列號98] ; I對用于擴(kuò)增DQ基因，即正向引物 DQB-E2-F2 :5’ CGGTGATTCCCCGCAGAGGAT-3’ [序列號"]和反向引物 DQB-E2 -R2 5’ -CCACCTCGTAGTTGTGTCTGC-3’ [序列號100] ；3對用于擴(kuò)增DP基因，正向引物[序列號 101-103]和反向引物[序列號[序列號104-106]在各自的5’-末端分別標(biāo)記有生物素。前面描述的其他合適的標(biāo)記方法也可以使用。在25微升的反應(yīng)體系中，PCR預(yù)制混合試劑制備如下(這個例子是用來說明本發(fā)明的用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的一個特定程序。如果使用其他 SNP的引物序列，必須優(yōu)化PCR和雜交的條件)
權(quán)利要求
1.一種用于快速檢測人乳頭狀瘤病毒(HPV)的方法，其特征是包括以下步驟 (a)獲取含有模板核酸的樣品； (b)使用序列號為116-118的引物，擴(kuò)增模板核酸，從而生成HPVLI的擴(kuò)增子；和 (c)將HPVLI的擴(kuò)增子與固定的寡核苷酸探針雜交，探針選自序列號為121-173的探針組，雜交結(jié)果顯示HPV的存在與否。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是引物中還包括與ー個內(nèi)部對照互補(bǔ)的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是與內(nèi)部對照互補(bǔ)的引物序列為119-120。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是引物包括ー個信號生成標(biāo)簽。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是寡核苷酸探針還包括能夠捕獲通用HPV病毒DNA的探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是能夠捕獲通用HPV病毒DNA的探針選自序列170-173。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是HPVLI的擴(kuò)增子與多個固定的寡核苷酸探針的雜交是在ー個導(dǎo)流過程或側(cè)向?qū)Я鬟^程中進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是HPVLI的擴(kuò)增子與多個固定的寡核苷酸探針的雜交是在一個有靶分析物溶液再循環(huán)的導(dǎo)流過程中進(jìn)行，從而導(dǎo)致敏感性増加。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是該方法可以檢測出的HPV基因型選自HPV6，11，16，18，26，31，33，35，39，40，42，43，44，45，51，52，53，54，55，56，57，58，59，61，66，68，70,71,72,73,81,82 和 84。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征是所述HPV基因型是分別檢測，或者集合到一個或多個組中檢測。
11.聲明9所述方法中，其特征是HPV基因型16和18是分別檢測，HPV基因型31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，73和82集合到ー個或多個組中進(jìn)行檢測。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征是該方法進(jìn)ー步集合到ー個或多個組中檢測HPV 基因型 6，11，26，40，42，43，44，53，54，55，57，61，66，70，71，72，73，81 和 84。
13.一種用于人乳頭狀瘤病毒(HPV)基因型鑒定的試劑盒，其特征是包括序列號為116-118的引物和選自序列121-173的寡核苷酸探針。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征是引物中還包括與ー個內(nèi)部對照互補(bǔ)的引物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其特征是與內(nèi)部對照互補(bǔ)的引物序列為119-120。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征是引物包括ー個信號生成標(biāo)簽。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征是寡核苷酸探針還包括能夠捕獲通用HPV病毒DNA的探針。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征是能夠捕獲通用HPV病毒DNA的探針選自序列 170-173。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征是該試劑盒可以檢測出的HPV基因型選自HPV 6，11，16，18，26，31，33，35，39，40，42，43，44，45，51，52，53，54，55，56，57，58，59，61，66，68，70，71，72，73，81，82 和 84。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，其特征是所述HPV基因型是分別檢測，或者集合到一個或多個組中檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于快速基因型鑒定的方法和裝置，在一個實(shí)施例中，本發(fā)明被應(yīng)用到人乳頭狀瘤病毒(HPV)的基因型鑒定，包括使用病毒基因型特異性寡核苷酸探針、反向斑點(diǎn)雜交基因型點(diǎn)陣方式和導(dǎo)流雜交過程，從而提供一種更高效、更快速和更經(jīng)濟(jì)的方法進(jìn)行HPV基因型鑒定。這種基因型鑒定的方法可以兼容通用探針，從而擴(kuò)大了HPV基因型的檢測范圍。
文檔編號C12Q1/68GK102985565SQ201180032327
公開日2013年3月20日 申請日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月29日
發(fā)明者譚約瑟夫榮安, 周約瑟夫, 陳里斯卓宇 申請人:達(dá)雅高生物科技有限公司