一種用于預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒感染和宮頸癌的微小rna的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種用于預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒感染和宮頸癌的微小
RNA
技術(shù)領(lǐng)域
:
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于預(yù)防和治療人乳頭瘤毒感染以及人宮頸癌的微小RNA。
技術(shù)背景:
[0002]宮頸癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的女性生殖道惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年大約有將近50萬(wàn)的宮頸癌新發(fā)病例，超過(guò)27萬(wàn)婦女死于該病。近年來(lái)其發(fā)病率不斷上升且出現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，死亡率也有回升的趨勢(shì)。因此，研發(fā)新的安全有效的治療靶點(diǎn)刻不容緩。
[0003]人乳頭瘤病毒(humanpapilloma virus,HPV)是一種無(wú)包膜雙鏈環(huán)狀DNA病毒,其基因組全長(zhǎng)約7200-8000bp，編碼6個(gè)早期蛋白(El，E2, E4, E5, E6, E7)和兩個(gè)晚期蛋白(LI和L2)。根據(jù)致癌危險(xiǎn)性，分為高危型HPV和低危型HPV，前者與宮頸癌及重度癌前病變相關(guān)，后者則弓I起生殖道疣等良性病變?，F(xiàn)已明確，高危型HPV感染是導(dǎo)致宮頸癌的直接病因和首要病因。國(guó)內(nèi)外經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期、大規(guī)模的臨床流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，超過(guò)99%的宮頸癌樣本存在HPV病毒感染，其中，HPV16為主要感染型別。HPV病毒感染宮頸組織后，通常要經(jīng)過(guò)一個(gè)較為長(zhǎng)期、緩慢的過(guò)程，一般為十余年甚至數(shù)十年，組織才會(huì)出現(xiàn)癌變。因此，在這個(gè)長(zhǎng)期持續(xù)的HPV感染過(guò)程中，尋找抗HPV感染及其病毒癌基因的靶點(diǎn)，可以阻斷HPV持續(xù)感染以及組織癌變，是預(yù)防和治療宮頸癌的關(guān)鍵。
[0004]微小RNA (microRNA,miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)約19?25nt的單鏈小分子非編碼RNA,通常與靶基因的3 ‘非翻譯區(qū)結(jié)合，有時(shí)也可與5 ‘非翻譯區(qū)或編碼區(qū)結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)。miRNA廣泛存在于從植物、線(xiàn)蟲(chóng)到人類(lèi)的細(xì)胞中，參與調(diào)控一系列的生命活動(dòng)。截止目前，miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄各物種中已發(fā)現(xiàn)的成熟miRNA共達(dá)21264個(gè)，其中在人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)并已經(jīng)得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)的有2042個(gè)(Releasel9:August2012)。近年的研究顯示miRNA與多種惡性腫瘤密切相關(guān),其可充當(dāng)癌基因或抑癌基因的角色，在腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
[0005]近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)顯示miRNA具有直接抗病毒作用。從2005年至今，有多條人類(lèi)細(xì)胞miRNA被報(bào)道可直接靶向攻擊外源性致病病毒，調(diào)控病毒基因的表達(dá)，如:miR-196、miR-448 抗 HCV 病毒;miR_199a、miR-210、miR_125a 抗 HBV 病毒；以及一系列miRNAs抗HIV、H5N1、HlNl病毒等。這種作用模式被證實(shí)在機(jī)體抗病毒感染免疫中發(fā)揮重要作用。由于miRNA的內(nèi)源性及相對(duì)安全性，利用其靶向攻擊外源性病毒這一特性開(kāi)發(fā)相應(yīng)的藥物或方法，可以模擬機(jī)體抗病毒免疫，為預(yù)防和/或治療病毒感染誘發(fā)惡性疾病(如丙型肝炎、乙型肝炎、艾滋病等)帶來(lái)了新的契機(jī)。
[0006]然而，宮頸癌作為與病毒感染明確相關(guān)的惡性腫瘤中的一種，到目前為止還沒(méi)有任何文獻(xiàn)報(bào)道某種miRNA可以直接靶向HPV病毒、調(diào)控HPV病毒基因的表達(dá)。尚未見(jiàn)任何一種人類(lèi)miRNA應(yīng)用于抗HPV病毒。而阻斷HPV持續(xù)感染恰恰是預(yù)防和治療宮頸癌的關(guān)鍵。
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0007]鑒于上述技術(shù)背景，本發(fā)明的目的在于提供一種新的用于由HPV感染及宮頸癌的治療祀點(diǎn)及方法。
[0008]具體的，本發(fā)明提供了一種可用于預(yù)防和治療人乳頭瘤毒的感染以及由該病毒所引起的宮頸癌的微小RNA核酸序列，具體為:5’AUAUACCUGUUCGGUCUCUUUA3’。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述微小RNA可以靶向人乳頭瘤病毒E6基因的第207-232nt，所述第207_232nt的序列為:5’ AACAGTTACTGCGACGTGAGGTATAT3’。
[0009]本發(fā)明還涉及上述微小RNA及其各種載體、藥物組合物在預(yù)防和治療HPV病毒感染以及由該病毒引起的宮頸癌的藥物中的用途。
[0010]所述藥物組合物指含有有效量的上述核酸序列以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0011]本發(fā)明中，所述人乳頭瘤病毒可以引起人宮頸癌的高危亞型，包括:HPV16，HPV18HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82。
[0012]另外，本發(fā)明還涉及用本發(fā)明提供的上述核酸序列、載體或藥物組合物來(lái)調(diào)控HPVE6基因的表達(dá)。
[0013]本發(fā)明中，所述的微小RNA可以下調(diào)人乳頭瘤病毒E6基因表達(dá)，并最終抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
[0014]本發(fā)明通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)出上述微小RNA的核酸序列。進(jìn)而，本發(fā)明將該微小RNA及其預(yù)測(cè)靶標(biāo)序列分別克隆于雙熒光素酶報(bào)告基因載體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)報(bào)告基因活性明顯被抑制，證實(shí)該微小RNA可與該靶標(biāo)相互作用。為了評(píng)價(jià)該微小RNA對(duì)HPV16感染的宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，本發(fā)明將該微小RNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HPV16陽(yáng)性的宮頸癌SiHa細(xì)胞株，流式細(xì)胞儀檢測(cè)法、Hoechst染色法、Roche細(xì)胞分析儀檢測(cè)法結(jié)果均顯示外源性上調(diào)細(xì)胞內(nèi)該微小RNA的表達(dá)可明顯減緩細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞凋亡，證實(shí)該微小RNA介導(dǎo)的對(duì)HPV病毒的沉默效應(yīng)可以干擾腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)結(jié)局。同時(shí)，RT-PCR法結(jié)果顯示E6癌基因的mRNA表達(dá)明顯減少。由此，本發(fā)明證實(shí)了該微小RNA可通過(guò)靶向HPV16-E6基因，直接靶向攻擊HPV16病毒，影響病毒的致癌能力，從而有效抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。鑒于miRNA的內(nèi)源性及相對(duì)安全性，如果將其應(yīng)用于藥物，模擬人類(lèi)細(xì)胞受到HPV感染后免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗病毒免疫反應(yīng)，將有望成為一種新型的預(yù)防和治療HPV感染以及由HPV感染引起的宮頸癌的治療方法及要素。
【附圖說(shuō)明】
:
[0015]圖1:將該微小RNA序列克隆于pSilenCer4.1-CMV載體內(nèi)，其預(yù)測(cè)靶標(biāo)序列克隆于psiCheck-2載體內(nèi)，兩種重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于HPV陰性的宮頸癌C33A細(xì)胞，為實(shí)驗(yàn)組；空白質(zhì)粒和靶標(biāo)熒光報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染C-33A細(xì)胞，為對(duì)照組。圖1顯示了轉(zhuǎn)染48小時(shí)后檢測(cè)的熒光素酶活性:實(shí)驗(yàn)組的熒光活性比對(duì)照組減少29.23%，報(bào)告基因表達(dá)明顯被抑制，數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.001)
[0016]圖2:將該微小RNA表達(dá)質(zhì)粒(pSilencer4.l-miRNA-CMV)轉(zhuǎn)染入HPV16陽(yáng)性的宮頸癌SiHa細(xì)胞株，為實(shí)驗(yàn)組；未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的SiHa細(xì)胞為正常對(duì)照組及陰性對(duì)照組。圖2顯示了流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組的早期凋亡率分別為正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組的3.1倍和2.6倍，晚期凋亡率分別為9.5倍和10.4倍，總凋亡率分別為5.8倍和5.4倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。
[0017]圖3:顯示了 Hoechst染色法檢測(cè)SiHa凋亡細(xì)胞結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞熒光染色陽(yáng)性率分別為正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組的43.3倍和23.9倍。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.001)。
[0018]圖4:顯示了由Roche xCELLigence RTCA DP細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)的SiHa細(xì)胞增殖指數(shù)繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn):轉(zhuǎn)染了微小RNA表達(dá)質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞